Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
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I protocolli riportati in questo manoscritto sono stati resi possibili dai contributi accumulati di precedenti borsisti del laboratorio di ricerca sull'anestesia in terapia intensiva del Dr. Warren Zapol, Dipartimento di Anestesia presso il Massachusetts General Hospital. Riconosciamo il contributo dei dottori Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli ed Emanuele Rezoagli.

Le procedure indicate in questo protocollo sono in conformità con il comitato di revisione del Massachusetts General Hospital. I campioni di sangue utilizzati erano stati raccolti durante uno studio precedente e sono stati de-identificati per lo scopo attuale18.
NOTA: vedere le istruzioni del produttore per indicazioni specifiche sui collegamenti ottimali tra tubi e bicchieri che costituiscono il recipiente di spurgo, il lavaggio e la manutenzione generale. Le connessi...

A causa dell'elevata sensibilità, i saggi basati sulla chemiluminescenza per la determinazione dell'NO e dei composti correlati hanno un alto rischio di contaminazione da NO2-. Ogni reagente (in particolare la soluzione che blocca l'NO2) e il diluente (incluso il ddH2O) utilizzati nell'esperimento devono essere testati per il suo contenuto di NO2- per correggere il segnale di fondo. Il nitrito è estremamente reattivo con un'emivita nel sangue ...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

L'attività dell'ossido nitrico (NO) in vivo è il risultato combinato dei suoi effetti diretti, dell'azione dei suoi derivati generati dall'autossidazione dell'NO e degli effetti dei composti nitrosi. La misurazione dei metaboliti no è essenziale per studiare l'attività dell'NO sia a livello vascolare che in altri tessuti, specialmente nei contesti sperimentali in cui viene somministrato NO esogeno. I saggi di chemiluminescenza a base di ozono consentono misurazioni precise dei metaboliti NO e NO sia nei fluidi (inclusi plasma, omogeneizzati tissutali, colture cellulari) che nelle miscele di gas (ad esempio, respiro espirato). L'NO reagisce con l'ozono per generare biossido di azoto allo stato eccitato. La conseguente emissione luminosa permette il fotorilevamento e la generazione di un segnale elettrico che riflette il contenuto di NO del campione. Le aliquote dello stesso campione possono essere utilizzate per misurare specifici metaboliti NO, come nitrati, nitriti, S-nitrosotioli e complessi ferro-nitrosilici. Inoltre, l'NO consumato dall'emoglobina priva di cellule viene anche quantificato con l'analisi di chemiluminescenza. Viene fornita un'illustrazione di tutte queste tecniche.

Il consumo di NO mediante il saggio hb senza cellule è stato utilizzato in campioni contenenti concentrazioni note di ossiHb privo di cellule (Figura 4). Poiché un eme di oxyHb rilascia stechiometricamente una molecola NO nel test, l'oxyHb privo di cellule purificate viene utilizzato per costruire la curva di calibrazione per il test (Figura supplementare 3).
La relazione dose-risposta tra Hb senza cellule (misurata con un test colorimetrico) e ...

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Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Qui presentiamo protocolli per rilevare l'ossido nitrico e i suoi derivati biologicamente rilevanti utilizzando saggi basati sulla chemiluminescenza ad alta sensibilità.

Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Questo protocollo consente ai ricercatori di utilizzare con competenza un rilevatore di chemiluminescenza per la misurazione dei metaboliti dell'ossido nitrico senza la guida o la spesa di impiegare personale dedicato in loco. Il test basato sulla chemiluminescenza è il metodo più sensibile per rilevare cambiamenti minimi nei livelli di ossido nitrico e dei suoi metaboliti in un dato campione biologico. L'ossido nitrico inalato è un gas terapeutico utilizzato per un'ampia varietà di malattie.È fondamentale che la progressione e il recupero della malattia siano accuratamente correlati con i livelli di metaboliti dell'ossido nitrico. L'ossido nitrico inalato, un antimicrobico, è promettente nel trattamento di pazienti con malattie infettive delle vie aeree. Il metodo della chemiluminescenza fornisce informazioni sulla correlazione della dose di ossido nitrico e dei suoi metaboliti con i cambiamenti microbiologici e fisiopatologici.Per preparare la soluzione deTA-NONOato, aggiungere 10 milligrammi di DETA-NONOato a 610 microlitri di idrossido di sodio 10 millimolare in PBS di pH 7,4 per generare 100 millimolari di DETA-NONOato e mantenerlo sul ghiaccio. Per procedere, collegare la linea di ossigeno al rilevatore di chemiluminescenza e aprire il serbatoio di ossigeno a una pressione secondo le istruzioni del produttore fornite nel testo. Quindi, collegare la linea del filtro dielettrico a campo intenso al rilevatore di chemiluminescenza.Sull'interfaccia del rilevatore di chemiluminescenza, avviare il programma di rilevamento per i saggi in fase liquida, assicurandosi che l'apporto di ossigeno sia adeguato e il rilevatore inizierà il campionamento, indicando il rilevamento tramite segnale in millivolt, altrimenti richiedere un segnale diagnostico negativo. Per preparare il recipiente di spurgo, chiudere il recipiente di spurgo su tutte e tre le porte avvitando completamente la valvola a spillo a destra e chiudendo i rubinetti di arresto in ingresso e in uscita. Rimuovere il cappuccio dal recipiente di spurgo.Aggiungere una quantità sufficiente del reagente specifico per il test pianificato alla camera di reazione in modo che l'ago della siringa utilizzato per iniettare i campioni possa raggiungere la colonna di fluido verificando la presenza di una linea di base stabile e desiderata. Per avviare il flusso di gas di spurgo, assicurarsi che il serbatoio del gas inerte sia dotato di un regolatore a due stadi e collegare il serbatoio del gas inerte con l'ingresso del gas della nave. Quindi, aprire l'uscita del recipiente di spurgo e aprire il gas con una pressione di uscita al regolatore da uno a cinque libbre per pollice quadrato.Quindi, aprire l'ingresso del recipiente di spurgo e aprire lentamente la valvola a spillo del recipiente di spurgo per consentire l'afflusso di gas e verificare il gorgogliamento all'interno del recipiente di spurgo. Per regolare il flusso di gas, registrare la pressione della cella misurata dal rivelatore di chemiluminescenza con la linea di filtro dielettrico a campo intenso che campiona l'aria ambiente. Riposizionare il cappuccio sul recipiente di spurgo e collegare la linea del filtro dielettrico a campo intenso al recipiente di spurgo.Utilizzare la valvola a spillo per raggiungere la stessa pressione cellulare al livello del rilevatore di chemiluminescenza registrato nell'aria ambiente. Per avviare il programma di acquisizione del segnale di chemiluminescenza, collegare la porta seriale del rilevatore di chemiluminescenza alla porta seriale del computer in cui è stato installato il programma di acquisizione. Quindi, eseguire il programma di analisi.Fare clic su Acquisisci, quindi selezionare la cartella in cui salvare il file di dati, digitare il nome del file e fare clic su Salva. Durante la preparazione per l'iniezione del campione, regolare la scala di tensione sullo schermo per avere il controllo sulla linea di base di destinazione facendo clic sui pulsanti minimo e / o massimo e quindi inserendo il valore desiderato. Per eseguire l'iniezione del campione, sciacquare la siringa almeno due o più volte con acqua deionizzata e distillata prima di prelevare ciascun campione e assicurarsi un'espulsione d'acqua senza ostacoli su una salvietta da attività.Quindi, inserire la siringa nella provetta del campione tenendo sia la siringa che il tubo a una distanza ravvicinata e tirare su lo stantuffo al volume desiderato assicurandosi che nessuna bolla d'aria o parti solide non omogeneizzate siano intrappolate. Pulire la punta della siringa con un tergicristallo e inserire la siringa nel cappuccio del setter alla porta di iniezione. Dopo aver verificato che la punta della siringa rientri nella fase liquida, iniettare il campione nella camera di reazione.Per contrassegnare l'iniezione nel programma software, digitare il nome del campione facendo clic sulla casella grigia sotto Nomi campione, quindi fare clic su Mark Injection mentre si verifica che l'iniezione causi un cambiamento verso l'alto nel segnale o verso il basso nel consumo di ossido nitrico mediante test di emoglobina senza cellule. La relazione dose-risposta tra emoglobina priva di cellule e consumo di ossido nitrico è stata misurata attraverso la chemiluminescenza dopo bypass cardiopolmonare. Si può presumere che vi sia un'alta concentrazione di gruppi eme nello stato ossidato scavenging ossido nitrico.Nei pazienti che ricevono ossido nitrico durante il bypass cardiopolmonare, invece, la maggior parte dei gruppi eme è ridotta e non consuma ossido nitrico. Le misurazioni della concentrazione di emoglobina libera da cellule hanno indicato una lenta eliminazione dal plasma entro 12 ore dal bypass cardiopolmonare. Tuttavia, il consumo di ossido nitrico ha raggiunto il picco a 15 minuti e non riflette l'eliminazione dell'emoglobina priva di cellule.Le curve di regressione lineare del consumo di ossido nitrico da parte dell'emoglobina senza cellule hanno mostrato una prevalenza di emoglobina ossidata e che consuma ossido nitrico a 15 minuti, rispetto all'emoglobina più ridotta al basale 4 ore e 12 ore dopo il bypass cardiopolmonare. Sono stati monitorati gli effetti della somministrazione di gas di ossido nitrico sul consumo di ossido nitrico. Quando i pazienti sono stati trattati con ossido nitrico gassoso intra e post-operatorio, l'aumento osservato di emoglobina libera dopo il bypass cardiopolmonare non è stato associato ad alcun aumento del consumo di ossido nitrico.I risultati hanno indicato che l'ossido nitrico somministrato esogenamente riduceva la maggior parte dell'emoglobina libera e impediva lo scavenging dell'ossido nitrico. L'esperimento è valido solo se tutte le condizioni rimangono le stesse. Se l'altezza del livello del liquido supera la colonna di reazione, dobbiamo fermarci e condurre una nuova calibrazione.

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