Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
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この原稿で報告されたプロトコルは、マサチューセッツ総合病院の麻酔科のクリティカルケアにおける麻酔研究のウォーレン・ザポール博士の研究室の以前のフェローの蓄積された貢献によって可能になりました。我々は、中川明人博士、フランチェスコ・ザデック博士、エマヌエーレ・ヴァッセナ博士、チョン・レイ博士、長坂靖子博士、エステル・スパニョッリ博士及びエマヌエーレ・レゾアグリ博士の貢献を認識する。

このプロトコルに示されている手順は、マサチューセッツ総合病院の審査委員会に従っています。使用された血液サンプルは、以前の研究中に収集され、現在の目的のために非同定された18。
メモ: パージ容器を構成するチューブとガラス製品間の最適な接続、洗浄、および一般的なメンテナンスに関する具体的なガイダンスについては、製造元の指示?...

高感度のため、NOおよび関連化合物の測定のための化学発光ベースのアッセイは、NO2-汚染のリスクが高い。実験に使用した各試薬(特にNO2-ブロッキング溶液)および希釈剤(ddH2Oを含む)は、バックグラウンドシグナルを補正するためにそのNO2-含有量について試験されるべきである。亜硝酸塩は、全血中の半減期が約10分と非常に反応性が?...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

インビボにおける一酸化窒素(NO)活性は、その直接的な効果、NO自己酸化から生成されるその誘導体の作用、およびニトロソ化化合物の効果を組み合わせた結果である。NO代謝産物の測定は、血管レベルおよび他の組織の両方で、特に外因性NOが投与される実験環境において、NO活性を研究するために不可欠である。オゾンベースの化学発光アッセイは、体液(血漿、組織ホモジネート、細胞培養物を含む)および混合ガス(呼気など)の両方におけるNOおよびNO代謝産物の正確な測定を可能にします。NOはオゾンと反応して励起状態で二酸化窒素を発生する。結果として生じる発光は、光検出および試料のNO含有量を反映する電気信号の発生を可能にする。同じサンプルからのアリコートを使用して、硝酸塩、亜硝酸塩、S-ニトロソチオール、鉄-ニトロシル錯体などの特定のNO代謝産物を測定することができます。また、無細胞ヘモグロビンによって消費されるNOも化学発光分析により定量される。これらすべての手法の図を示します。

無細胞HbアッセイによるNO消費を、既知の濃度の無細胞オキシHbを含むサンプルで使用した(図4)。オキシHbの1つのヘムがアッセイにおいて化学量論的に1つのNO分子を放出するように、精製された無細胞オキシHbがアッセイ用の検量線を構築するために使用される(補足図3)。
心臓手術中に心肺バイパス(CPB)から外れた患者における無細胞Hb(?...

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Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

ここでは、化学発光ベースのアッセイを高感度に使用して、一酸化窒素およびその生物学的に関連する誘導体を検出するためのプロトコルを提示する。

自動酸化およびニトロソ化化合物からの一酸化窒素およびその誘導体の検出のための化学発光ベースのアッセイ

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

このプロトコルにより、研究者は、現場で専任の人員を雇うという指導や費用をかけずに、一酸化窒素代謝産物の測定に化学発光検出器を巧みに使用することができます。化学発光ベースのアッセイは、任意の生物学的サンプル中の一酸化窒素およびその代謝産物のレベルにおける最小限の変化を検出するための最も敏感な方法である。吸入一酸化窒素は、多種多様な疾患に使用される治療用ガスである。疾患の進行および回復が一酸化窒素代謝産物レベルと正確に相関することが極めて重要である。抗菌剤である吸入一酸化窒素は、気道感染症患者の治療に有望であることを示しています。化学発光法は、一酸化窒素用量およびその代謝産物を微生物学的および病態生理学的変化と相関させる洞察を提供する。DETA-NONOate溶液を調製するには、pH 7.4のPBS中の610マイクロリットルの10ミリモル水酸化ナトリウムに10ミリグラムのDETA-NONOateを加え、100ミリモルのDETA-NONOateを生成して氷上に保持する。続行するには、酸素ラインを化学発光検出器に接続し、テキストに記載されている製造元の指示に従って酸素タンクを圧力で開きます。次に、強磁界誘電体フィルタラインを化学発光検出器に接続する。化学発光検出器インターフェースで、液相アッセイ用の検出プログラムの実行を開始し、酸素供給が適切であり、検出器がサンプリングを開始し、ミリボルト単位の信号による検出を示し、それ以外の場合は負の診断信号をプロンプトします。パージ容器を準備するには、ニードルバルブを右に完全にねじ込み、入口と出口のストップコックを閉じて、3つのポートすべてでパージ容器を閉じます。パージ容器からキャップを取り外します。計画されたアッセイに特異的な十分な量の試薬を反応チャンバに追加して、サンプルの注入に使用されるシリンジ針が安定した所望のベースラインの存在を検証しながら流体カラムに到達できるようにします。パージガスの流れを開始するには、不活性ガスタンクに2段レギュレータが装備されていることを確認し、不活性ガスタンクを容器のガス入口に接続します。次に、パージ容器の出口を開き、レギュレータの出口圧力で1平方インチあたり1〜5ポンドのガスを開きます。次に、パージ容器の入口を開き、パージ容器のニードルバルブをゆっくりと開き、ガスの流入を可能にし、パージ容器内のバブリングを確認します。ガスの流れを調整するには、化学発光検出器で測定したセル圧力を、周囲空気をサンプリングする強磁場誘電体フィルタラインで記録します。パージ容器のキャップの位置を変更し、強磁界誘電体フィルタラインをパージ容器に接続します。ニードルバルブを使用して、周囲空気に記録されている化学発光検出器レベルで同じ細胞圧力に達します。化学発光信号取得プログラムを起動するには、化学発光検出器のシリアルポートを、集録プログラムがインストールされているコンピュータのシリアルポートに接続します。次に、分析プログラムを実行します。[取得]をクリックし、データファイルを保存するフォルダを選択し、ファイル名を入力して[保存]をクリックします。サンプル注入の準備中に、画面上の電圧スケールを調整して、最小および/または最大ボタンをクリックして、ターゲットベースラインを制御し、目的の値を入力します。サンプル注入を行うには、各サンプルを抜き出す前に、脱イオン水と蒸留水でシリンジを少なくとも2回以上すすぎ、タスクワイプで遮るもののない水噴出を確保します。次に、シリンジとチューブの両方を近距離に保持しながらシリンジをサンプルチューブに挿入し、気泡または均質化されていない固体部分がトラップされていないことを確認しながら、プランジャーを所望の体積に引き上げる。タスクワイパーでシリンジの先端を清掃し、注射口のセッターキャップにシリンジを挿入します。シリンジの先端が液相内にあることを確認した後、反応チャンバ内に試料を注入する。ソフトウェアプログラムで注射をマークするには、「サンプル名」の下の灰色のボックスをクリックしてサンプル名を入力し、「マーク注入」をクリックして、注射によってシグナルが上向きまたは無細胞ヘモグロビンアッセイによる一酸化窒素消費の下向きの変化を引き起こすことを確認します。無細胞ヘモグロビンと一酸化窒素消費との間の用量反応関係を、心肺バイパス後の化学発光を通して測定した。一酸化窒素を捕捉する酸化状態には高濃度のヘム基が存在するものと推測できる。心肺バイパス中に一酸化窒素を投与された患者では、代わりに、ヘム基の大部分が減少し、一酸化窒素を消費しない。無細胞ヘモグロビン濃度の測定は、心肺バイパス後12時間以内に血漿中からの遅い排泄を示した。しかし、一酸化窒素の消費は15分でピークに達し、無細胞ヘモグロビンの排除を反映していなかった。無細胞ヘモグロビンによる一酸化窒素消費の線形回帰曲線は、心肺バイパス後のベースライン4時間および12時間でより減少したヘモグロビンとは対照的に、15分で酸化および一酸化窒素消費ヘモグロビンの有病率を示した。一酸化窒素消費に対する一酸化窒素ガス投与の影響をモニターした。患者が術中および術後に一酸化窒素ガスで治療された場合、心肺バイパス後に観察された遊離ヘモグロビンの増加は、一酸化窒素消費の増加と結合しなかった。結果は、外因的に投与された一酸化窒素が遊離ヘモグロビンの大部分を減少させ、一酸化窒素捕捉を防止することを示した。実験は、すべての条件が同じままである場合にのみ有効です。液面の高さが反応カラムを超えた場合は、停止して新しい校正を実施する必要があります。

Research

JoVE Journal

Medicine

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