Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

이 원고에보고 된 프로토콜은 매사추세츠 종합 병원의 마취학과 인 워렌 자폴 (Warren Zapol) 박사의 중환자 치료 마취 연구 연구소의 이전 동료들의 축적 된 기여로 가능했습니다. 우리는 나카가와 아키토 박사, 프란체스코 자덱, 엠마누엘레 바세나, 정 레이, 나가사카 야스코, 에스테르 스파그놀리, 엠마누엘레 레조아글리 박사의 공헌을 인정합니다.

이 프로토콜에 표시된 절차는 매사추세츠 종합 병원의 검토위원회에 따라 결정됩니다. 사용된 혈액 샘플은 이전 연구 동안 수집되었고, 현재의 목적(18)을 위해 비확인되었다.
주: 퍼지 용기, 세척 및 일반 유지 보수를 구성하는 튜브와 유리 제품 간의 최적 연결에 대한 구체적인 지침은 제조업체의 지침을 참조하십시오. 연결은 유리 제품을 손상시키지 않도?...

높은 민감도로 인해, NO 및 관련 화합물의 결정을 위한 화학발광 기반 분석은NO2-오염의 위험이 높다. 실험에 사용된 각각의 시약 (특히 NO2-차단 용액) 및 희석제 (ddH2O 포함)는 배경 신호에 대해 보정하기위해 그의NO2-함량에 대해 시험되어야 한다. 아질산염은 10분 전혈에서 반감기가 매우 반응하며NO3-를 빠르게 생성한다. 따?...

살바도르 몬카다와 노벨상 수상자인 로버트 푸르치고트, 루이 이그나로, 페리드 무라드가 산화질소(NO)를 이전에 알려진 내피 유래 이완인자(EDRF)로 확인했기 때문에, NO의 중심 역할은 혈관 생물학, 신경과학, 대사 및 숙주 반응전반에 걸친 몇 가지 주요 메커니즘에서 확립되었다 1,2,3,4,5,6,7 . NO 가스의 외인성 투여는 신생아8에서 폐 고혈압으로 인한 호흡 부전에 대한 확립된 치료법이 되었다. 산화 질소 가스는 또한 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 감염, 말라리아 및 기타 감염성 질환, 허혈 재관류 손상의 치료 및 심장 수술을받는 환자의 급성 신장 손상 예방 9,10,11,12에 대해 조사되었습니다. NO, 그 대사 산물 및 표적 단백질 및 화합물의 수준을 평가하기위한 정확한 측정 기술의 필요성은 기계론적 및 중재적 연구 모두에서 비롯됩니다.
그것의 높은 반응성으로 인해, NO는 그것이 생성 및/또는 방출되는 생물학적 매트릭스에 따라 상이한 반응을 겪을 수 있다. 헤모글로빈 (Hb) 또는 다른 옥시헤모단백질의 부재하에, NO는 아질산염 (NO2-)으로 거의 완전히 산화된다.
2NO + O2 →2NO2
NO2 + NO →N2O3
N2O3+H2O →NO2- + H+
NO는 먼저 분자 산소(O2)와 상호 작용하여 이산화질소(NO2)를 생성하고,NO2 자체와 반응하여 삼산화이질소(N2O3)를생성한다. N2O3의 한 분자는 물(H2O)과 반응하여 NO2- 및 양성자(H+)13의2분자를 형성한다. 전혈14,15 내에서, NO와 NO2-는 이들 분자가 Hb의 산화된 헴기[Hb-Fe2+-O2 또는 옥시헤모글로빈(oxyHb)]와 격렬하게 반응하여 질산염(NO3-)으로 빠르게 전환되어 NO3-를 생성한다. 이 반응은 헴기가 페릭 상태로의 전이와 결합된다 [Hb-Fe3+ 또는 메트헤모글로빈 (metHb)]:
Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ +NO3-
적혈구 (RBC) 장벽과 내피에 바로 인접한 공간은 이러한 반응을 제한하는 주요 요인이며 내피에 의해 방출되는 NO의 작은 부분이 EDRF16,17로 작용할 수 있도록합니다. 실제로, 순환에서 무세포 Hb는 실험 및 임상 설정(17,18)에서 혈관확장을 방해하는 것으로 알려져 있다. RBC 내에서, 산소화 및NO2-농도에 따라, NO의 일부는 데옥시헤모글로빈(Hb-Fe2+)과 반응하여 철-니트로실 Hb(Hb-Fe2+-NO 또는 HbNO)를 형성한다:
Hb-Fe2++ NO → Hb-Fe2+-NO
RBC15,17에서, NO2-NO의 방출을 유도하는 Hb-Fe2+를 감소시킴으로써 Hb-Fe3+를 형성할 수 있고, 이는 차례로 Hb-Fe2+-O2 (우선적으로) 또는 Hb-Fe2+에 결합한다.
NO 유도체의 생성은 NO가 다양한 조직 및 상이한 효소에 의해 (예를 들어, 장내 박테리아 또는 미토콘드리아 내에서, 특히 저산소 조건 하에서) NO2- 및NO3-로부터 재생될 수 있기 때문에 엄격하게 단방향성으로 간주되어서는 안 된다.19,20.
가변량의 NO 생성(또는 투여)은 주로 친핵체의 존재하에N2O3로부터 티올 트랜스니트로화에 의해 N-니트로소티올의 하류 생성을 유도하여 NO+ 공여체 중간체(Nuc-NO+-NO2-)를 생성한다:
N2O3+ RS-→ RS-NO + NO2-
S-니트로소티올스 생성에 대한 또 다른 가능성은 산화된 티올의 니트로실화(산화된 티올과 반응하는 NO)이다:
RS• + 아니오 → RS-아니오
NO2에 의한 이러한 메카니즘 및 직접적인 티올 산화는 다른 곳에서 설명되는 매우 특정한 조건에서만 가능할 수 있다(21). S-니트로소티올은 S-니트로소글루타티온과 같은 광분자에서 큰 티올 함유 단백질에 이르기까지 다양합니다. S-니트로소헤모글로빈(S-NO-Hb)은 β쇄(β93C)22 내에 보존된 시스테인 잔기의 티올기의 니트로화에 의해 형성된다.
S-니트로소티올의 생성과 신진 대사는 중요한 조절 메커니즘의 일부입니다. 그 예로는 글루타티온, 카스파제, N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA), 및 리아노딘 수용체 23,24,25,26,27,28의 조절이 포함된다. 이전에 생체내에서 NO 생물학의 주요 매개체로서 고려되었던 니트로화 알부민(S-nitroso-albumin)은 어떠한 특정한 추가적인 생물학적 활성도 없이 NO/NO+ 수송체인 것으로 보인다(29).
생물학적 매트릭스 내의 특정 생물학적 샘플로부터 NO 및 그 유도체의 농도를 측정할 때, 산도, 산소화, 온도 및 시약의 존재와 같은 특성을 고려하는 것이 중요하다. 그 예로는 외인성 NO 공여체 투여를 포함하고, 급성 염증의 설정에서, 과산화수소(H2O2)가NO2와 반응하여 퍼옥시아질산염(ONOO-)21과 같은 초정상 농도의 자유 라디칼의 생성을 유도한다. 사용되는 분석 방법 외에도 샘플 준비 및 저장의 사전 분석 단계가 기본입니다. 생체내 NO 활성을 나타내지 않는 하류 반응은 예측, 고려, 차단되어야 한다. 유효한 예는 S-NO-Hb의 불안정성이며, 측정22를 목표로 할 때 혈액 샘플의 전용 처리가 필요합니다.
화학발광-기반 분석은 조직 균질물30,31을 포함하는 임의의 생물학적 유체에서 NO 및 그의 주요 대사산물 [NO2-,NO3-, S-NO 및 철-니트로실 착물 (Fe-NO)]의 수준을 검출하기 위한 황금 표준이다. 이러한 방법은 NO와 오존(O3)의 반응을 수용하여 여기된 상태(NO2•)에서NO2를 생성하는 장치인 화학발광 검출기(CLD)에 의존합니다. NO2•의 이완은 광승수 튜브에 의해 검출되는 광자의 발광을 야기하여, 샘플링된 가스 혼합물(32)의 NO 함량에 직접적으로 비례하는 전기 신호를 생성한다. CLD의 단순화된 개략도가 표현된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig01.jpg"> 그림 1: 산화질소 가스에 대한 화학발광 검출기의 단순화된 회로도. 화학발광 기반 산화질소(NO)의 검출은 화학발광 검출기(CLD)에 도입되는 NO 가스 분자당 하나의 광자의 화학량론적 생성이다. 화학 발광 반응은 내부 발전기에서 오존 (O3)이 공급되는 지정된 챔버에서 얻어지며, 외부 펌프와의 연결로 음압으로 유지되어 샘플 가스의 지속적이고 지속적인 유입을 허용합니다. O3의 생성에는 CLD와 연결된 전용 O2 탱크에 의해 공급되는 규원자 산소(O2)가 필요합니다(다른 제조업체는 주변 공기로 작동하는 CLD를 제공합니다). 반응 챔버 내에서, 샘플링된 가스에 포함된 NO 가스의 각 분자는 산소와 반응하여 활성화 상태의 이산화질소(NO2*) 한 분자를 산출한다. 그의 기저 상태로 되돌아감으로써, 각각의NO2* 분자는 반응 챔버에 인접해 위치한 광승수 튜브(PMT)에 의해 검출되는 하나의 광자를 방출한다. 증폭기 및 중앙 처리 유닛과 연관된 PMT는 반응 챔버 내의 광자 수 및 NO 분자의 수에 비례하는 신호를 생성한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
CLD의 샘플 입구는 액체 샘플용 반응 챔버를 함유하는 유리 시스템에 연결될 수 있다. 이 시스템은 질소, 헬륨 또는 아르곤과 같은 불활성 가스로 연속적으로 퍼징되어 NO를 반응 챔버에서 CLD로 전달합니다. 액상 샘플은 전용 멤브레인을 통해 정화 용기로 주입됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig02.jpg"> 그림 2 : 화학 발광 기반 산화 질소 가스 검출을위한 정화 용기의 구조 퍼지 용기 (오른쪽)는 액상 시약에서 방출 될 때 NO 가스로 쉽게 전환 될 수있는 산화 질소 (NO) 가스 또는 기타 화합물의 검출을 허용합니다. 불활성 가스 유입구는 아르곤, 제온, 또는 이원자성 질소(N2)와 같은 불활성 기체의 소스(탱크)에 연결된다. 바늘 밸브 (왼쪽으로 열림)는 퍼지 용기 내의 압력 제어에 사용되며 용기를 청소하기 위해 완전히 제거 할 수 있습니다. 주입 포트는 샘플 주입을위한 막 중격이있는 캡으로 덮여 있습니다. 멤브레인은 자주 교체해야합니다. 가열된 재킷은 반응 챔버를 둘러싸고 온수 욕조에 연결되어 HCl 분석에서VCl3을 수행한다. 퍼지 용기 출구는 화학발광 검출기 (CLD) 또는 NaOH 트랩에 연결된다 (HCl 분석에서VCl3에 필요함). 반응 챔버 함량을 배출하려면 먼저 불활성 가스 입구와 퍼지 용기 출구에서 스톱콕을 닫고 바늘 밸브를 닫은 다음 주입구에서 캡을 제거한 다음 마지막으로 드레인에서 스톱콕을 엽니 다. NaOH 트랩 (왼쪽)은 HCl의 부식성 때문에 HCl 분석에서VCl3이 수행되는 경우 정화 용기와 CLD 사이에 인라인으로 배치해야합니다. CLD에 연결하려면 CLD와 퍼지 용기의 출력(또는 사용되는 경우 NaOH 트랩) 사이에 항상 강렬한 전계 유전체(IFD) 필터가 배치되어야 합니다. IFD 필터는 공기 중 입자를 제거하고 액체가 퍼지 용기를 통과하는 것을 방지합니다. PTFE = 폴리테트라플루오로에틸렌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
결과적으로, 특이적이고 조절된 화학 반응을 통해 NO로 전환될 수 있는 임의의 화합물은 임의의 생물학적 유체 및 조직 균질액(24)에서 높은 감도로 검출될 수 있다. 화학발광을 통한 기상NO의 직접 측정은 실험 및 임상 설정 모두에서 수행된다. 이들 기술은 다른 곳에서도 광범위하게 설명된다(33,34,35). NO2-, S-니트로소티올, S-니트로소티올, S-니트로화 단백질 및 Fe-NOs의 측정은 이들 모든 화합물로부터 NO 가스를 화학량론적으로 방출하는 트리요오다이드(I3-)와의 반응 혼합물에 샘플을 첨가함으로써 수행될 수 있다:
I3- → I2 + I-
2NO2 - +2I- +4H + → 2NO + I 2 +2H2 O
I3 - + 2RS-NO → 3I - + RSSR + 2NO +
2NO + + 2I - → 2NO + I2
반면 I 3-은 NO 3-15와 반응하지 않습니다. 각 화합물의 정확한 측정은 수은 염화물 (HgCl2)의 유무에 관계없이 산성화 된 설파 닐 아미드 (AS)로 샘플 분취량을 전처리함으로써 가능합니다. 구체적으로, AS로 전처리하면NO2-함량이 모두 제거된다. 결과적으로, CLD에 의해 측정된 NO 함량은 S-NOs 및 Fe-NOs 농도의 합만을 반영한다. AS 주입 전에 샘플 분취량에 HgCl2를 주입하면NO2-가 S-NO에 의해 방출됩니다. AS로 처리(NO2-제거로 이어짐)는 측정된 NO 함량이 Fe-NOs의 농도만을 반영하도록 보장한다. 평가 사이의 일련의 감산은 세 개의 NO 유도체(22)의 정확한 농도를 계산할 수있게한다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig03.jpg"> 도 3: I3-아세트산 화학발광 분석에서I3-용 시료 제조 단계. 아세트산 화학발광 분석에서 I3-의 제조를 위한 순차적 단계가 예시된다. 광 보호 원심 분리 튜브의 사용이 필요합니다. 튜브 1, 2, 및 3은 분석을 준비하기 위해 사용되는 것들이다. 또 다른 샘플 분취량 (튜브 4)은 질산염 (NO3-)의 측정이 필요한 경우 HCl 분석에서VCl3에 필요합니다. 단계는 빨간색으로 숫자로 표시됩니다. 샘플 부피를 첨가하기 전에 포스페이트 버퍼 식염수(PBS) 또는 HgCl2로 표시된 바와 같이 예비충전(단계 1). 지시된 바와 같이 샘플 부피 (2)를 첨가하고, 볼텍스하고, 실온 (RT)에서 2분 동안 인큐베이션한다. 지시된 바와 같이 (3) PBS 또는 산성화된 설파닐아미드 (AS)를 첨가하고, 볼텍스하고, RT에서 3분 동안 인큐베이션한다. 분석법에 의해 측정된 농도는 각 튜브 하에서보고된 화합물의 농도의 합이다. 튜브 번호 1은 단일 신호로서 아질산염(NO2-), S-니트로소티올(S-NO) 및 철-니트로실 착물(Fe-NOs)의 측정을 허용한다. 질산염 (NO3-) 측정을 위해, 샘플은 HCl 분석에서 아세트산의 I3-와 VCl3 둘 다로 실행되어야하며, 튜브 1로부터 얻은 값은 튜브 4로부터 얻은 값에서 뺄 수 있어야합니다. *잔류NO2-, S-니트로소헤모글로빈 및 철-니트로실헤모글로빈의 결정을 위해 Hb 분석에 사용되는 제안된 양. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
NO3-측정을 위해, 염산(HCl) 중의 바나듐(III) 클로라이드(VCl3)는 CLD를 사용한 NO3-화학량론적으로 측정하기 위해 퍼지 용기 내의NO3-로의 NO로의 전환에 사용된다:
2 NO3- + 3V + 3 +2H2O→ 2NO + 3VO2 + + 4H +
충분히 빠른 전환을 달성하기 위해, 반응은 90-95°C에서 수행될 필요가 있다. NO3-에서 NO2-로의 환원은 HCl에 의한 NO2-내지 NO의 환원과 결합된다. 바나듐 금속은 또한 그들의 NO 모이어티22,36을 해방시키는 S-NOs를 감소시킨다. HCl 중의 VCl3을 갖는 CLD에 의해 수득된 최종 농도는NO3-, NO2, 및 다른 니트로화 화합물의 응집체 농도를 반영한다. I3-를 사용한 CLD로 수득된 농도로부터 후자의 값을 뺀 것은NO3-농도 36,37의 계산을 허용한다(도 3).
NO 소비 분석에서, NO 공여체에 의한 퍼지 용기 내의 NO의 연속 방출은 (Z)-1-[2-(2-아미노에틸)-N-(2-암모니오에틸)아미노]디아젠-1-륨-1,2-디올레이트(DETA-NONOate)와 같은 NO 공여체에 의해 주입된 샘플에서 무세포 옥시Hb를 정량화할 수 있게 하는 안정한 신호를 생성한다. 퍼지 용기에서 소비되는 NO의 양은 샘플(38) 중의 oxyHb의 양과 화학양론적 관계에 있다.
혈장 샘플에서 무세포 Hb에 의한NO2-, NO3-, S-니트로소티올, 철-니트로실 착물, 및 NO 소비의 측정을 위한 프로토콜이 예시된다. RBC 환경에서 NO에 대한 연구는 총 Hb 농도15,22의 결정과 결합 된 매우 취약한 S-NO-Hb 및 Hb-NO를 측정하기 위해 특정 샘플 처리 후 배제 크로마토그래피가 필요합니다. 샘플 준비는 측정을 교정하는 데 도움이됩니다. 분석 동안 H2O에서 NO2-의 사전 존재 및NO2-방출은 S-NO-Hb14,39와 같은 인위적으로 더 높은 농도의 NO 유도체의 측정을 유도할 수 있다. 샘플 준비의 중요한 측면도 제시됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

생체 내에서 산화질소(NO) 활성은 그의 직접적인 효과, NO autoxidation으로부터 생성된 그의 유도체의 작용, 및 니트로화 화합물의 효과의 조합된 결과이다. NO 대사산물을 측정하는 것은 혈관 수준과 다른 조직, 특히 외인성 NO가 투여되는 실험 환경에서 NO 활성을 연구하는 데 필수적입니다. 오존 기반 화학발광 분석은 유체(플라즈마, 조직 균질물, 세포 배양물 포함) 및 가스 혼합물(예: 내뿜는 호흡) 모두에서 NO 및 NO 대사산물의 정밀한 측정을 가능하게 합니다. NO는 오존과 반응하여 흥분 상태에서 이산화질소를 생성합니다. 결과적으로 발광은 광검출 및 샘플의 NO 함량을 반영하는 전기 신호의 생성을 허용합니다. 동일한 샘플로부터의 분취량은 특정 NO 대사산물, 예컨대 질산염, 아질산염, S-니트로소티올, 및 철-니트로실 착물을 측정하는데 사용될 수 있다. 또한, 무세포 헤모글로빈에 의해 소비된 NO는 또한 화학발광 분석으로 정량화된다. 이러한 모든 기술에 대한 그림이 제공됩니다.

무세포 Hb 분석법에 의한 NO 소비는 공지된 농도의 무세포 oxyHb를 함유하는 샘플에서 사용되었다(도 4). 옥시Hb의 하나의 헴이 화학량론적으로 분석에서 하나의 NO 분자를 방출함에 따라, 정제된 무세포 oxyHb는 검정에 대한 검량선을 구축하는데 사용된다(보충 도 3).
심장 수술 중 심폐 우회술(CPB)에서 벗어나는 환자에서 무세포 Hb(비색 분석법으?...

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Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

여기에서는 고감도의 화학 발광 기반 분석을 사용하여 산화 질소 및 이의 생물학적 관련 유도체를 검출하기위한 프로토콜을 제시합니다.

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

이 프로토콜을 통해 연구원은 현장에서 전담 인력을 고용하는 지침이나 비용없이 산화 질소 대사 산물 측정을 위해 화학 발광 검출기를 능숙하게 사용할 수 있습니다. Chemiluminescence-based assay는 주어진 생물학적 샘플에서 산화 질소 및 그 대사 산물의 수준의 변화를 최소화하는 가장 민감한 방법입니다. 흡입 된 산화 질소는 다양한 질병에 사용되는 치료 가스입니다.질병 진행과 회복이 산화 질소 대사 산물 수준과 정확하게 관련되는 것이 중요합니다. 항균제 인 흡입 된 산화 질소는 기도 전염병 환자를 치료할 때 약속을 보여줍니다. 화학 발광 방법은 산화 질소 복용량과 그 대사 산물을 미생물 학적 및 병리 생리학 적 변화와 상호 연관시키는 것에 대한 통찰력을 제공합니다.DETA-NONOate 용액을 제조하기 위해, pH 7.4의 PBS 중의 10밀리몰 수산화나트륨 610마이크로리터에 DETA-NONOate 10밀리그램을 첨가하여 100밀리몰의 DETA-NONOate를 생성하고 얼음 위에 보관한다. 계속하려면 산소 라인을 화학 발광 검출기에 연결하고 텍스트에 제공된 제조업체의 지시에 따라 압력으로 산소 탱크를 엽니 다. 그런 다음 강도장 유전체 필터 라인을 화학 발광 검출기에 연결하십시오.화학발광 검출기 인터페이스에서 액상 분석을위한 검출 프로그램을 실행하여 산소 공급이 적절하고 검출기가 샘플링을 시작하여 밀리볼트 단위의 신호로 감지를 나타내며 그렇지 않으면 음성 진단 신호를 프롬프트합니다. 퍼지 용기를 준비하려면 바늘 밸브를 오른쪽으로 완전히 조이고 입구 및 출구 정지 콕을 닫아 세 포트 모두에서 퍼지 용기를 닫으십시오. 퍼지 용기에서 캡을 제거하십시오.샘플을 주입하는 데 사용되는 주사기 바늘이 안정하고 원하는 기준선의 존재를 검증하면서 유체 컬럼에 도달할 수 있도록 계획된 분석에 특이적인 충분한 양의 시약을 반응 챔버에 첨가한다. 퍼지 가스 흐름을 시작하려면 불활성 가스 탱크에 두 단계 조절기가 장착되어 있는지 확인하고 불활성 가스 탱크를 용기의 가스 입구와 연결하십시오. 그런 다음 퍼지 용기의 출구를 열고 평방 인치당 하나 ~ 다섯 파운드의 조절기에서 출구 압력으로 가스를 엽니 다.그런 다음 퍼지 용기의 입구를 열고 퍼지 용기의 바늘 밸브를 천천히 열어 가스의 유입을 허용하고 퍼지 용기 내에서 버블 링을 확인합니다. 가스 흐름을 조정하려면 주변 공기를 샘플링하는 강렬 필드 유전체 필터 라인으로 화학 발광 검출기에 의해 측정 된 세포 압력을 기록하십시오. 퍼지 용기에 캡을 재배치하고 인텐트 필드 유전체 필터 라인을 퍼지 용기에 연결합니다.바늘 밸브를 사용하여 주변 공기에 기록 된 화학 발광 검출기 수준에서 동일한 세포 압력에 도달하십시오. 화학발광 신호 수집 프로그램을 시작하려면 화학발광 검출기의 직렬 포트를 수집 프로그램이 설치된 컴퓨터의 직렬 포트에 연결하십시오. 그런 다음 분석 프로그램을 실행하십시오.획득을 클릭 한 다음 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택하고 파일 이름을 입력 한 다음 저장을 클릭하십시오. 샘플 주입을 준비하는 동안 최소 및/또는 최대 버튼을 클릭한 다음 원하는 값을 입력하여 대상 기준선을 제어하도록 화면의 전압 스케일을 조정합니다. 샘플 주입을 수행하려면 각 샘플을 회수하기 전에 탈이온수 및 증류수로 주사기를 적어도 두 번 이상 헹구고 작업 닦아내기에서 방해받지 않는 물 분출을 보장하십시오.그런 다음, 주사기와 튜브를 모두 가까운 거리로 유지하면서 시료 튜브에 주사기를 삽입하고 플런저를 원하는 부피로 끌어 올리면서 기포 또는 균질화되지 않은 고체 부품이 갇히지 않도록하십시오. 작업 와이퍼로 주사기의 끝을 청소하고 주사기를 주입 포트의 세터 캡에 삽입하십시오. 주사기의 팁이 액상 내에 있는지 확인한 후 샘플을 반응 챔버에 주입하십시오.소프트웨어 프로그램에서 주입을 표시하려면 샘플 이름 아래의 회색 상자를 클릭하여 샘플 이름을 입력 한 다음 마크 인젝션을 클릭하고 주입이 신호의 상향 또는 무세포 헤모글로빈 분석에 의한 산화 질소 소비의 하향 변화를 유발하는지 확인하십시오. 무세포 헤모글로빈과 산화질소 소비 사이의 용량 반응 관계는 심폐 바이패스 후 화학발광을 통해 측정하였다. 산화질소를 소거한 상태에서 고농도의 헴기가 있다고 가정할 수 있다.심폐 우회 중에 산화 질소를받는 환자의 경우, 대신 헴 그룹의 대다수가 감소하고 산화 질소를 섭취하지 않습니다. 무세포 헤모글로빈 농도의 측정은 심폐 우회 후 12시간 이내에 혈장으로부터 느리게 제거됨을 나타내었다. 그러나 산화 질소 소비는 15 분에서 최고조에 달했으며 무세포 헤모글로빈의 제거를 반영하지 않았습니다.무세포 헤모글로빈에 의한 산화질소 소비의 선형 회귀 곡선은 심폐 우회 후 기준선 4시간 및 12시간에서 더 감소된 헤모글로빈과는 대조적으로 15분에 산화된 산화질소 및 산화질소 소비 헤모글로빈의 유병률을 나타내었다. 산화질소 가스 투여가 산화질소 소비에 미치는 영향을 모니터링하였다. 환자가 수술 후 산화질소 가스로 치료되었을 때, 심폐 우회술 후 유리 헤모글로빈의 관찰된 증가는 산화질소 소비의 어떠한 증가와도 결합되지 않았다.결과는 외인성 산화 질소가 유리 헤모글로빈의 대부분을 감소시키고 산화 질소 소거를 예방한다는 것을 나타냈다. 실험은 모든 조건이 동일하게 유지되는 경우에만 유효합니다. 액체 수준의 높이가 반응 컬럼을 초과하면 새로운 교정을 중단하고 수행해야합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

연구

의학

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

암의 생산 및 반응 산소 종의 감지 (ROS)

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

암 치료 모니터링을위한 Cerenkov 발광 이미징 (CLI)

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

높은 소금 다이어트와 루이스 쥐에서 만성 신장 질환을 유발하는 산화 질소 합성 효소 억제와 함께 5/6th의 절제

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

Zebrafish의 행동 증후군에 대한 대담, 침략, 그리고이 얕아 분석

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

초초파라마그네틱 산화질소 나노프로브의 합성, 특성화 및 적용

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

자연적으로 호흡하는 과목에서 고농도의 산화산화물 가스를 전달하는 새로운 흡입 마스크 시스템

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...