Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Protokollene som ble rapportert i dette manuskriptet ble muliggjort av de akkumulerte bidragene fra tidligere stipendiater ved Dr. Warren Zapols laboratorium for anestesiforskning i kritisk omsorg, Anestesidepartementet ved Massachusetts General Hospital. Vi anerkjenner bidraget fra Dr. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli og Emanuele Rezoagli.

Prosedyrene som er angitt i denne protokollen er i samsvar med kontrollstyret ved Massachusetts General Hospital. Blodprøvene som ble brukt hadde blitt samlet inn i en tidligere studie og ble av-identifisert for gjeldende formål18.
MERK: Se produsentens anvisninger for spesifikk veiledning om optimale forbindelser mellom slanger og glassvarer som utgjør rensebeholderen, vasken og generelt vedlikehold. Tilkoblinger må være faste og nøye laget for ikke å skade glas...

På grunn av den høye følsomheten har chemiluminescensbaserte analyser for bestemmelse av NO og relaterte forbindelser en høy risiko for NO 2-forurensning. Hvert reagens (spesielt NO 2-blokkerende løsning) og fortynningsmiddel (inkludert ddH2O) som brukes i eksperimentet, bør testes for no 2-innhold for å korrigere for bakgrunnssignal. Nitritt er ekstremt reaktiv med en halveringstid i fullblod rundt 10 min og genererer raskt NO3</sub...

Siden Salvador Moncada og nobelprisvinnerne Robert Furchgott, Louis Ignarro og Ferid Murad identifiserte nitrogenoksid (NO) som den tidligere kjente endotel-avledede avslapningsfaktoren (EDRF), har den sentrale rollen til NO blitt etablert i flere viktige mekanismer som spenner over vaskulær biologi, nevrovitenskap, metabolisme og vertsrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Eksogen administrering av NO-gass har blitt en etablert behandling for respirasjonssvikt på grunn av pulmonal hypertensjon hos nyfødte8. Nitrogenoksidgass har også blitt undersøkt for behandling av respiratorisk synytialvirusinfeksjon (RSV), malaria og andre infeksjonssykdommer, iskemi-reperfusjonsskade, og for forebygging av akutt nyreskade hos pasienter som gjennomgår hjertekirurgi 9,10,11,12. Behovet for presise måleteknikker for å vurdere nivåene av NO, dets metabolitter, og de av målproteiner og forbindelser oppstår fra både mekanistiske og intervensjonelle studier.
På grunn av sin høye reaktivitet kan NO gjennomgå forskjellige reaksjoner avhengig av den biologiske matrisen den produseres og/eller frigjøres i. I fravær av hemoglobin (Hb) eller andre oksy-hemoproteiner oksideres NO nesten helt til nitritt (NO2-).
2NO + O2 → 2NO2
NO2 + NO → N2O3
N2O3 + H2O → NR2- + H+
NO gjennomgår først autoxidasjon med molekylært oksygen (O2) for å gi nitrogendioksid (NO2) og reagerer med NO2 selv for å generere dinitrogentrioksid (N2O3). Ett molekyl av N2O3 reagerer med vann (H2O) for å danne to molekyler av NO2- og en proton (H+)13. Innen fullblods14,15, NEI og NO2- konverteres raskt til nitrat (NO3-) da disse molekylene reagerer ivrig med de oksiderte hemegruppene hb [Hb-Fe2 +-O2 eller oksyhemoglobin (oksyHb)] for å gi NO3-. Denne reaksjonen er kombinert med overgangen av heme-gruppen til ferric-tilstanden [Hb-Fe3+ eller methemoglobin (metHb)]:
Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-
Den røde blodlegemer (RBC) barrieren og rommet rett ved siden av endotelet er de viktigste faktorene som begrenser denne reaksjonen og tillater en liten del av NO frigjort av endotelet å fungere som EDRF16,17. Faktisk er cellefri Hb i sirkulasjonen kjent for å forstyrre vasodilatasjon i eksperimentelle og kliniske omgivelser17,18. Innenfor RBC, avhengig av oksygenering og NO 2-konsentrasjon, reagerer en del av NO med deoksyhemoglobin (Hb-Fe2+) for å danne jern-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO eller HbNO):
Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO
I RBC15,17 kan NO2- danne Hb-Fe3+ ved å redusere Hb-Fe2+ som fører til utgivelsen av NO, som igjen binder Hb-Fe2 +-O2 (fortrinnsvis) eller Hb-Fe2+.
Genereringen av NO-derivater bør ikke betraktes som strengt enveis, da NO kan regenereres fra NO2- og NO3- i ulike vev og av forskjellige enzymer (f.eks. ved tarmbakterier eller innen mitokondrier, spesielt under hypoksiske forhold)19,20.
En variabel mengde NO produsert (eller administrert) fører til nedstrøms generering av S-nitrosothioler, hovedsakelig ved tioltransnitrosasjon fra N2O3 i nærvær av en nukleofil som skaper en NO + donor mellomliggende (Nuc-NO + -NO2-):
N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-
En annen mulighet for S-nitrosothiols generasjon er nitrosylering av oksiderte tioler (INGEN reagerer med en oksidert tiol):
RS• + NO → RS-NO
Denne mekanismen og direkte tioloksidasjon ved NO2 kan bare være mulig under svært spesifikke forhold som er beskrevet andre steder21. S-nitrosothioler spenner fra lette molekyler som S-nitrosoglutathione til store tiolholdige proteiner. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) dannes ved nitrosasjon av en tiolgruppe av en konservert cysteinrester i β-kjeden (β93C)22.
Generering og metabolisme av S-nitrosothioler er en del av viktige regulatoriske mekanismer. Eksempler er regulering av glutathione, caspaser, N-metyl-D-Aspartat (NMDA) og ryanodinreseptorer 23,24,25,26,27,28. Tidligere ansett som en stor formidler av NO biologi in vivo, nitrosated albumin (S-nitroso-albumin) synes å være en NO / NO + transportør uten noen spesifikk ekstra biologisk aktivitet29.
Ved måling av konsentrasjonen av NO og dets derivater fra en bestemt biologisk prøve i en biologisk matrise, er det viktig å vurdere egenskaper som surhet, oksygenering, temperatur og tilstedeværelse av reagenser. Eksempler er administrerte eksogene NO-donorer, og i innstillingen av akutt betennelse reagerer hydrogenperoksid (H2O2) med NO2 som fører til generering av supernormal konsentrasjon av frie radikaler som peroksynitritt (ONOO-)21. I tillegg til den analytiske metoden som brukes, er den preanalytiske fasen av prøvepreparering og lagring grunnleggende. Nedstrømsreaksjoner som ikke representerer in vivo NO-aktiviteten skal forutsies, vurderes og blokkeres. Et gyldig eksempel er ustabiliteten til S-NO-Hb, som krever en dedikert behandling av blodprøver når den er rettet mot måling22.
Chemiluminescence-baserte analyser er gullstandarden for å oppdage nivåene av NO og dens viktigste metabolitter [NO2-, NO3-, S-NO og iron-nitrosylkomplekser (Fe-NO)] i enhver biologisk væske, inkludert vev homogenater30,31. Disse metodene er avhengige av chemiluminescence detector (CLD), en enhet som huser reaksjonen av NO med ozon (O3), og genererer NO2 i en spent tilstand (NO2•). Avslapping av NO2• forårsaker utslipp av en foton av lys som oppdages av et fotomultiplierrør, og genererer et elektrisk signal som er direkte proporsjonalt med NO-innholdet i den prøvede gassblandingen32. Et forenklet skjema av CLD er representert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig01.jpg"> Figur 1: Forenklet skjematisk for en chemiluminescensdetektor for nitrogenoksidgass. Chemiluminescence-basert deteksjon av nitrogenoksid (NO) er den stoichiometriske generasjonen av ett foton per NO gassmolekyl som introduseres i chemiluminescence detector (CLD). Chemiluminescensreaksjonen oppnås i et utpekt kammer som leveres med ozon (O3) fra en intern generator, som holdes ved negativt trykk ved forbindelse med en ekstern pumpe, noe som tillater kontinuerlig og konstant tilstrømning av prøvegass. Genereringen av O3 krever diatomisk oksygen (O2) som leveres av en dedikert O2-tank koblet til CLD (andre produsenter gir CLDer som opererer med omgivelsesluft). Innenfor reaksjonskammeret reagerer hvert molekyl av INGEN gass i prøvegassen med oksygen for å gi ett molekyl nitrogendioksid i aktivert tilstand (NO2*). Ved å gå tilbake til sin bakketilstand avgir hvert NO2* molekyl en foton som oppdages av et fotomultiplierrør (PMT) som ligger ved siden av reaksjonskammeret. PMT med tilhørende forsterker og sentral prosesseringsenhet produserer et signal proporsjonalt med fotontallet og antall NO-molekyler i reaksjonskammeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Prøveinntaket til CLD kan kobles til et glassrørsystem som inneholder et reaksjonskammer for væskeprøver. Systemet renses kontinuerlig med en inert gass som nitrogen, helium eller argon, og overfører NEI fra reaksjonskammeret til CLD. Væskefaseprøver injiseres gjennom en dedikert membran inn i rensebeholderen.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig02.jpg"> Figur 2: Struktur av et rensekar for chemiluminescensbasert påvisning av nitrogenoksidgass Rensebeholderen (høyre) gjør det mulig å påvise nitrogenoksid (NO) gass eller annen forbindelse som lett kan omdannes til INGEN gass når den slippes ut fra et flytende fasereagens. Det inert gassinntaket er koblet til en kilde (tank) av en inert gass som Argon, Xeon eller diatomisk nitrogen (N2). Nåleventilen (åpnes til venstre) brukes til trykkregulering i rensebeholderen og kan fjernes helt for å rengjøre fartøyet. Injeksjonsporten er dekket av en hette med en membran septum for prøveinjeksjon. Membranen bør byttes ofte ut. En oppvarmet jakke omgir reaksjonskammeret og er koblet til et varmtvannsbad for å utføre VCl3 i HCl-analysen. Utløpet av rensebeholderen er koblet til chemiluminescensdetektoren (CLD) eller naoh-fellen (kreves for VCl3 i HCl-analyser). For å tømme innholdet i reaksjonskammeret må du først lukke stoppekranene ved det inerte gassinntaket og rensekarutløpet, lukke nåleventilen, fjerne hetten ved injeksjonsporten og til slutt åpne stoppekranen ved avløpet. NaOH-fellen (til venstre) må plasseres linjebundet mellom rensebeholderen og CLD hvis VCl3 i HCl-analysen utføres på grunn av korrosjonen til HCl. Forbindelsen til CLD krever alltid at et intenst felt dielektrisk (IFD) filter skal plasseres mellom CLD og utgangen av rensebeholderen (eller NaOH-fellen, hvis det brukes). IFD-filteret fjerner luftbårne partikler og stopper væske fra å passere gjennom rensebeholderen. PTFE = polytetrafluoretylen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Som en konsekvens kan enhver forbindelse som kan konverteres til NEI gjennom en bestemt og kontrollert kjemisk reaksjon oppdages med høy følsomhet i enhver biologisk væske og vev homogenat24. Direkte måling av gassfase NO gjennom chemiluminescens utføres i både eksperimentelle og kliniske omgivelser. Disse teknikkene er omfattende beskrevet andre steder 33,34,35. Måling av NO2-, S-nitrosothiols, S-nitroserte proteiner og Fe-NOs kan utføres ved å legge til prøver i en reaksjonsblanding med triiodid (I3-), som stoichiometisk frigjør INGEN gass fra alle disse forbindelsene:
Jeg3- → jeg2 + jeg-
2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O
I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+
2NO+ + 2I− → 2NO + I2
mens jeg3- reagerer ikke med NO 3-15. Nøyaktige målinger av hver forbindelse er muliggjort ved forbehandling av prøve aliquots med surgjort sulfanilamid (AS) med eller uten mercuric klorid (HgCl2). Spesielt fjerner forbehandling med AS alt NO 2-innhold. Som en konsekvens av dette gjenspeiler NO-innholdet målt ved CLD bare summen av S-NOer og Fe-NOs konsentrasjon. Injeksjon av HgCl2 i en prøve aliquot før AS injeksjon fører til at NO2- frigjøres av S-NO. Behandling med AS (som fører til NO2- fjerning) sikrer at det målte NO-innholdet bare gjenspeiler konsentrasjonen av Fe-NOer. En rekke subtraksjoner mellom vurderingene gjør det mulig å beregne den nøyaktige konsentrasjonen av de tre NO-derivatene22.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig03.jpg"> Figur 3: Trinn i prøvepreparering for I 3-i-eddiksyre chemiluminescence-analysen. De sekvensielle trinnene for fremstilling av I 3-i eddiksyre chemiluminescence-analysen er illustrert. Bruk av lysbeskyttede sentrifugerør er nødvendig. Rør 1, 2 og 3 er de som brukes til å forberede seg på analysen. En annen prøve aliquot (rør 4) er nødvendig for VCl3 i HCl-analysen hvis måling av nitrat (NO3-) er nødvendig. Trinnene angis med tall i rødt. Forhåndsutfylling (trinn 1) som indikert med fosfatbuffersark (PBS) eller HgCl2 før prøvevolumet tilsettes. Tilsett prøvevolumet (2) som angitt, virvel og inkuber i 2 minutter ved romtemperatur (RT). Tilsett (3) PBS eller surgjort sulfanilamid (AS) som indikert, virvel og inkuber i 3 min ved RT. Kjør analysen (4). Konsentrasjonen målt ved analysen er summen av konsentrasjonen av forbindelsene som rapporteres under hvert rør. Rør nummer 1 vil tillate målinger av nitritt (NO2-), S-nitrosothiols (S-NO) og jern-nitrosylkomplekser (Fe-NOs) som et enkelt signal. For nitratmåling (NO3-) skal prøver kjøres med både I3- i eddiksyre og VCl3 i HCl-analyser, og verdien oppnådd fra rør 1 skal trekkes fra den som er oppnådd fra rør 4. *foreslåtte mengder som skal brukes til Hb-analyse for bestemmelse av rest no2-, S-nitrosohemoglobin og jern-nitrosyl-hemoglobin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For NO 3-måling brukes Vanadium (III) klorid (VCl3) i saltsyre (HCl) til konvertering av NO3- til NO i rensebeholderen for å måle NO 3-stoichiometrisk med CLD:
2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+
For å oppnå en tilstrekkelig rask konvertering må reaksjonen utføres ved 90-95 °C. Reduksjon fra NO3- til NO2- kombineres med reduksjon av NO2- til NO av HCl. Vanadium metall reduserer også S-NOs frigjøre sin NO moiety22,36. Den endelige konsentrasjonen oppnådd av CLD med VCl3 i HCl gjenspeiler den samlede konsentrasjonen av NO3-, NO2 og andre nitroserte forbindelser. Subtraksjon av sistnevnte verdi fra konsentrasjonen gitt med CLD med I3- tillater beregning av NO 3-konsentrasjon 36,37 (figur 3).
I NO-forbruksanalysen genererer den kontinuerlige frigjøringen av NO i rensefartøyet av NO-givere som (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate) et stabilt signal som tillater kvantifisering av cellefri oksyHb i de injiserte prøvene. Mengden NO som forbrukes i rensebeholderen er i et stoichiometrisk forhold til mengden oksyHb iprøven 38.
Protokoller for måling av NO2-, NO3-, S-nitrosothiols, jern-nitrosylkomplekser og INGEN forbruk ved cellefri Hb i plasmaprøver er illustrert. Studier på NO i RBC-miljøet krever spesifikk prøvebehandling etterfulgt av eksklusjonskromatografi for å måle ekstremt skjøre S-NO-Hb og Hb-NO kombinert med bestemmelse av total Hb-konsentrasjon15,22. Prøvepreparering er medvirkende til å korrigere måling. Pre-eksistens av NO2- i H2O og frigjøring av NO2- under analysen kan føre til måling av kunstig høyere konsentrasjoner av NO derivater som S-NO-Hb14,39. Viktige aspekter ved prøveforberedelse presenteres også.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

Nitrogenoksid (NO) aktivitet in vivo er de kombinerte resultatene av sine direkte effekter, virkningen av dets derivater generert fra INGEN autoxidasjon, og effekten av nitroserte forbindelser. Måling av NO metabolitter er avgjørende for å studere INGEN aktivitet både på vaskulære nivåer og i andre vev, spesielt i eksperimentelle omgivelser der eksogen NO administreres. Ozonbaserte chemiluminescensanalyser tillater presise målinger av NO- og NO-metabolitter i begge væsker (inkludert plasma, vevshomogenater, cellekulturer) og gassblandinger (f.eks. utåndet pust). NO reagerer med ozon for å generere nitrogendioksid i en opphisset tilstand. Det påfølgende lysutslippet tillater fotodeteksjon og generering av et elektrisk signal som reflekterer NO-innholdet i prøven. Aliquots fra samme prøve kan brukes til å måle spesifikke NO metabolitter, for eksempel nitrat, nitritt, S-nitrosothioler og jern-nitrosylkomplekser. I tillegg er NO konsumert av cellefritt hemoglobin også kvantifisert med chemiluminescensanalyse. En illustrasjon av alle disse teknikkene er gitt.

NO-forbruket ved cellefri Hb-analyse ble brukt i prøver som inneholder kjente konsentrasjoner av cellefri oksyHb (figur 4). Som en heme av oksyHb stoichiometrisk frigjør ett NO-molekyl i analysen, brukes renset cellefri oksyHb til å bygge kalibreringskurven for analysen (Supplerende figur 3).
Doseresponsforholdet mellom cellefri Hb (målt med en kolorimetrisk analyse) og INGEN forbruk hos pasienter som kommer ut av hjerte- og lunge bypass (CPB)...

Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Her presenterer vi protokoller for å oppdage nitrogenoksid og dets biologisk relevante derivater ved hjelp av chemiluminescensbaserte analyser med høy følsomhet.

Chemiluminescence-baserte analyser for påvisning av nitrogenoksid og dets derivater fra autoxidasjon og nitroserte forbindelser

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Denne protokollen gjør det mulig for forskere å bruke en chemiluminescensdetektor for måling av nitrogenoksidmetabolitter uten veiledning eller utgifter ved å ansette dedikert personell på stedet. Chemiluminescence-basert analyse er den mest følsomme metoden for å oppdage minimale endringer i nivåene av nitrogenoksid og dets metabolitter i en gitt biologisk prøve. Inhalert nitrogenoksid er en terapeutisk gass som brukes til et bredt spekter av sykdommer.Det er avgjørende at sykdomsprogresjon og utvinning er nøyaktig korrelert med nitrogenoksid metabolittnivåer. Inhalert nitrogenoksid, et antimikrobielt, viser løfte i behandling av pasienter med smittsomme luftveissykdommer. Chemiluminescensmetoden gir innsikt i korrelerende nitrogenoksiddose og dens metabolitter med mikrobiologiske og patofysiologiske endringer.For å forberede DETA-NONOate-løsningen, tilsett 10 milligram DETA-NONOate til 610 mikroliter 10 millimolar natriumhydroksid i PBS av pH 7,4 for å generere 100 millimolar DETA-NONOate og hold det på is. For å fortsette, koble oksygenlinjen til chemiluminescence-detektoren og åpne oksygentanken ved et trykk i henhold til produsentens instruksjon i teksten. Deretter kobler du den intense felt dielektriske filterlinjen til chemiluminescence-detektoren.På chemiluminescence-detektorgrensesnittet begynner du å kjøre deteksjonsprogrammet for væskefaseanalyser, og sikrer at oksygentilførselen er tilstrekkelig og detektoren vil starte prøvetaking, noe som indikerer deteksjon ved signal i millivolt, ellers be om et negativt diagnostisk signal. For å forberede rensebeholderen, lukk rensebeholderen på alle tre portene ved å skru nåleventilen helt til høyre og lukke innløps- og utløpsstoppkranene. Fjern hetten fra rensebeholderen.Tilsett en tilstrekkelig mengde reagens som er spesifikk for den planlagte analysen til reaksjonskammeret, slik at sprøytenålen som brukes til å injisere prøvene, kan nå væskekolonnen mens du verifiserer tilstedeværelsen av en stabil, ønsket basislinje. For å starte rensegassstrømmen må du sørge for at den inertgasstanken er utstyrt med en totrinnsregulator, og koble den inert gastanken til gassinntaket på fartøyet. Åpne deretter utløpet av rensebeholderen og åpne gassen med et utløpstrykk på regulatoren på en til fem pund per kvadrattomme.Åpne deretter innløpet til rensebeholderen og åpne langsomt nåleventilen til rensebeholderen for å tillate tilstrømning av gass og verifisere boblende i rensebeholderen. For å justere gassstrømmen registrerer du celletrykket målt ved chemiluminescensdetektoren med den intense felt dielektriske filterlinjen som tar prøver av omgivelsesluft. Flytt hetten på rensebeholderen og koble den intense felt dielektriske filterlinjen til rensebeholderen.Bruk nåleventilen til å nå samme celletrykk på chemiluminescence detektornivå som er registrert i omgivelsesluft. For å starte chemiluminescence-signalanskaffelsesprogrammet kobler du den serielle porten til chemiluminescence-detektoren til datamaskinens serielle port som anskaffelsesprogrammet er installert i. Deretter kjører du analyseprogrammet.Klikk på Hent, velg deretter mappen for å lagre datafilen, skriv inn filnavnet, og klikk på Lagre. Mens du forbereder prøveinjeksjon, juster spenningsskalaen på skjermen for å ha kontroll over den målrettede grunnlinjen ved å klikke på minimums- og / eller maksimumsknappene, og skriv deretter inn ønsket verdi. For å utføre prøveinjeksjonen, skyll sprøyten minst to ganger eller mer med deionisert og destillert vann før du trekker ut hver prøve, og sørg for en uhindret vannutkast på en oppgaveserviett.Sett deretter sprøyten inn i prøverøret mens du holder både sprøyten og røret på kort avstand og trekk stempelet opp til ønsket volum, samtidig som du sikrer at ingen luftbobler eller ikke-homogeniserte faste deler er fanget. Rengjør spissen av sprøyten med en oppgavevisker og sett sprøyten inn i setterhetten ved injeksjonsporten. Etter å ha kontrollert at spissen av sprøyten er innenfor væskefasen, injiser prøven i reaksjonskammeret.For å markere injeksjonen i programmet, skriv inn prøvenavnet ved å klikke på den grå boksen under Prøvenavn, og klikk deretter på Injection mens du bekrefter at injeksjonen forårsaker en oppadgående endring i signalet eller nedover i nitrogenoksidforbruket ved cellefri hemoglobinanalyse. Doseresponsrelasjonen mellom cellefritt hemoglobin og nitrogenoksidforbruk ble målt gjennom chemiluminescens etter kardiopulmonal bypass. Det kan antas at det er en høy konsentrasjon av hemegrupper i oksidert status scavenging nitrogenoksid.Hos pasienter som mottar nitrogenoksid under kardiopulmonal bypass, reduseres i stedet flertallet av heme-gruppene og bruker ikke nitrogenoksid. Målinger av cellefri hemoglobinkonsentrasjon indikerte en langsom eliminering fra plasma innen 12 timer etter kardiopulmonal bypass. Nitrogenoksidforbruket nådde imidlertid 15 minutter og reflekterte ikke eliminering av cellefritt hemoglobin.De lineære regresjonskurvene for nitrogenoksidforbruk ved cellefritt hemoglobin viste en utbredelse av oksidert og nitrogenoksidkrevende hemoglobin på 15 minutter, i motsetning til mer redusert hemoglobin ved baseline 4 timer og 12 timer etter kardiopulmonal bypass. Effekten av administrasjon av nitrogenoksidgass på nitrogenoksidforbruk ble overvåket. Når pasienter ble behandlet med nitrogenoksidgass intra- og postoperativt, ble den observerte økningen av fritt hemoglobin etter kardiopulmonal bypass ikke kombinert med noen økning i nitrogenoksidforbruket.Resultatene indikerte at eksogent administrert nitrogenoksid reduserte det meste av det frie hemoglobin og forhindret nitrogenoksid scavenging. Eksperimentet er bare gyldig hvis alle betingelsene forblir de samme. Hvis høyden på væskenivået overstiger reaksjonskolonnen, må vi stoppe og gjennomføre en ny kalibrering.

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Påvisning og Genogrouping av noroviruses fra Barnas Avføring Av Taqman Ett-trinns RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produksjon og Påvisning av reaktive oksygen arter (ROS) i Kreft

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Analytiske teknikker analysere Nitric Oxide bioaktivitet

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Overvåking

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nephrectomy i kombinasjon med høy Salt Kosthold og nitrogenoksidsyntase Hemming å indusere kronisk nyresykdom i Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Polyakrylamidgeler for Invadopodia og trekkraft Analyser på kreftceller

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

Dristighet, aggresjon og stiming Analyser for sebrafisk Behavioral syndromer

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Syntese, karakterisering og anvendelse av superparamagnetiske jernoksid nanoprober for ekstrapulmonal tuberkulose deteksjon

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Blodplater-basert oppdagelsen av nitrogenoksid i blodet ved å måle VASP fosforylering

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Et nytt innåndingsmaskesystem for å levere høye konsentrasjoner av nitrogenoksidgass hos spontant pustende forsøkspersoner

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...