Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
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Os protocolos relatados neste manuscrito foram possíveis pelas contribuições acumuladas de bolsistas anteriores do laboratório de Pesquisa de Anestesia em Cuidados Críticos do Dr. Warren Zapol. Reconhecemos a contribuição dos Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli e Emanuele Rezoagli.

Os procedimentos indicados neste protocolo estão de acordo com o conselho de revisão do Hospital Geral de Massachusetts. As amostras de sangue utilizadas foram coletadas durante um estudo anterior e foram desidentifidas para a finalidade atual18.
NOTA: Consulte as instruções do fabricante para obter orientações específicas sobre as conexões ideais entre tubos e vidros que constituem o vaso de purga, a lavagem e a manutenção geral. As conexões precisam ser fir...

Devido à alta sensibilidade, ensaios baseados em chemiluminescência para a determinação de NO e compostos relacionados têm alto risco de contaminação nº2. Cada reagente (especialmente a solução de bloqueio NO 2) e dilutante (incluindo ddH2O) usado no experimento devem ser testados para seu conteúdo NO 2 para corrigir o sinal de fundo. O nitrito é extremamente reativo com meia-vida em sangue inteiro em torno de 10 minutos e rapidament...

Desde que Os ganhadores do Salvador Moncada e do Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro e Ferid Murad identificaram o óxido nítrico (NO) como o anteriormente conhecido fator de relaxamento derivado da endotelia (EDRF), o papel central do NO foi estabelecido em vários mecanismos-chave que abrangem toda a biologia vascular, neurociências, metabolismo e resposta ao hospedeiro 1,2,3,4,5,6,7 . A administração exógena do GÁS NO tornou-se um tratamento estabelecido para insuficiência respiratória devido à hipertensão pulmonar no recém-nascido8. O gás óxido nítrico também tem sido investigado para o tratamento da infecção pelo vírus sincicial respiratório (RSV), malária e outras doenças infecciosas, lesão de isquemia-reperfusão e para prevenção de lesão renal aguda em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca 9,10,11,12. A necessidade de técnicas precisas de medição para avaliar os níveis de NO, seus metabólitos e os de suas proteínas e compostos-alvo surge tanto de estudos mecanicistas quanto intervencionistas.
Devido à sua alta reatividade, a NO pode sofrer reações diferentes dependendo da matriz biológica em que é produzida e/ou liberada. Na ausência de hemoglobina (Hb) ou outras hemoproteínas de oxi, a NO é oxidada quase completamente ao nitrito (NO2-).
2NO + O2 → 2NO2
NO2 + NO → N2O3
N2O3 + H2O → NO2- + H+
O NO primeiro sofre autoxidação com oxigênio molecular (O2) para produzir dióxido de nitrogênio (NO2) e reage com o próprio NO2 para gerar trióxido de dinitrogen (N2O3). Uma molécula de N2O3 reage com água (H2O) para formar duas moléculas de NO2- e um próton (H+)13. Dentro de sangue inteiro14,15, NO e NO2- são rapidamente convertidos em nitrato (NO3-) como essas moléculas reagem avidamente com os grupos de heme oxidado de Hb [Hb-Fe2+-O2 ou oximosoglobina (oxicodona)] para produzir NO3-. Esta reação é associada à transição do grupo heme para o estado férrico [Hb-Fe3+ ou methemoglobina (metHb)]:
HB-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-
A barreira das células vermelhas do sangue (RBC) e o espaço imediatamente adjacente ao endotélio são os principais fatores que limitam essa reação e permitem que uma pequena porção do NO liberada pelo endotélio atue como EDRF16,17. Na verdade, o Hb livre de células na circulação é conhecido por interromper a vasodilatação em ambientes experimentais e clínicos17,18. Dentro da RBC, dependendo da oxigenação e da concentração NO2, uma porção de NO reage com desoxihemoglobina (Hb-Fe2+) para formar ferro-nitrosol Hb (Hb-Fe2+-NO ou HbNO):
HB-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO
Na RBC15,17, o NO2- pode formar o Hb-Fe3+ reduzindo o Hb-Fe2+ levando ao lançamento do NO, que por sua vez liga o Hb-Fe2+-O2 (preferencialmente) ou o Hb-Fe2+.
A geração de no-derivados não deve ser considerada estritamente unidirecional, pois o NO pode ser regenerado a partir de NO2- e NO3- em vários tecidos e por diferentes enzimas (por exemplo, por bactérias intestinais ou dentro das mitocôndrias, particularmente sob condições hipoxicas)19,20.
Uma quantidade variável de NO produzido (ou administrado) leva à geração a jusante de S-nitrosothiols, principalmente por transinrose de thiol a partir de N2O3 na presença de um nucleófilo criando um intermediário doador NO+ (Nuc-NO+-NO2-):
N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-
Outra possibilidade para a geração de S-nitrosothiols é a nitrosiagem de tiais oxidados (NÃO reage com um tiol oxidado):
RS• + NO → RS-NO
Este mecanismo e oxidação direta de thiol pelo NO2 só podem ser possíveis em condições muito específicas que são descritas em outros lugares21. Os s-nitrosothiols variam de moléculas leves como S-nitrosoglutathione a grandes proteínas que contêm tiol. A s-nitrosohemoglobina (S-NO-Hb) é formada por nitrosão de um grupo de tiol de um resíduo de cisteína conservado na cadeia de β (β93C)22.
A geração e o metabolismo dos S-nitrosothiols fazem parte de importantes mecanismos regulatórios. Exemplos incluem regulação de glutathione, caspases, N-metil-D-Aspartato (NMDA) e receptores de ryanodo 23,24,25,26,27,28. Anteriormente considerado como um grande mediador da NO biology in vivo, a albumina nitrosa (S-nitroso-albumina) parece ser um transportador NO/NO+ sem qualquer atividade biológica adicional específica29.
Ao medir a concentração de NO e seus derivados de uma amostra biológica específica dentro de uma matriz biológica, é importante considerar características como acidez, oxigenação, temperatura e presença de reagentes. Exemplos incluem doadores exógenos administrados NO e, no cenário de inflamação aguda, peróxido de hidrogênio (H2O2) reagindo com o NO2 levando à geração de concentração supernormal de radicais livres como a peroxitorita (ONOO-)21. Além do método analítico que é empregado, a fase pré-analítica da preparação e armazenamento da amostra é fundamental. Reações a jusante que não representam a atividade in vivo NO devem ser previstas, consideradas e bloqueadas. Um exemplo válido é a instabilidade do S-NO-Hb, que exige um tratamento dedicado de amostras de sangue quando é direcionado para a medição22.
Ensaios baseados em chemiluminescência são o padrão-ouro para detectar os níveis de NO e seus principais metabólitos [NO2-, NO3-, S-NO e complexos ferro-nitrosol (Fe-NO)] em qualquer fluido biológico, incluindo homogeneiza tecidos30,31. Esses métodos dependem do detector de chemiluminescência (CLD), um dispositivo que abriga a reação de NO com ozônio (O3), gerando o Nº2 em estado animado (NO2•). Relaxamento do NO2• causa emissão de um fóton de luz detectado por um tubo fotomultiplier, gerando um sinal elétrico diretamente proporcional ao teor NO da mistura de gás amostrado32. Um esquema simplificado do CLD está representado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig01.jpg"> Figura 1: Esquema simplificado de um detector de quimiluminescência para gás óxido nítrico. A detecção baseada em óxido nítrico (NO) é a geração estequiométrica de uma molécula de gás NO que é introduzida no detector de quimiominascência (CID). A reação de chemiluminescência é obtida em uma câmara designada fornecida com ozônio (O3) de um gerador interno, que é mantida em pressão negativa por conexão com uma bomba externa, permitindo entrada contínua e constante de gás amostral. A geração de O3 requer oxigênio diatômico (O2) que é fornecido por um tanque O2 dedicado conectado com o CLD (outros fabricantes fornecem CLDs operando com ar ambiente). Dentro da câmara de reação, cada molécula de gás NO contido no gás amostrado reage com oxigênio para produzir uma molécula de dióxido de nitrogênio no estado ativado (NO2*). Ao retornar ao seu estado terrestre, cada molécula NO2* emite um fóton que é detectado por um tubo fotomultiplier (PMT) localizado ao lado da câmara de reação. O TPM com o amplificador associado e unidade de processamento central produz um sinal proporcional à contagem de fótons e ao número de nenhuma molécula na câmara de reação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A entrada amostral do CLD pode ser conectada a um sistema de vidro contendo uma câmara de reação para amostras líquidas. O sistema é continuamente purgado com um gás inerte como nitrogênio, hélio ou argônio, transferindo NÃO da câmara de reação para o CLD. Amostras de fase líquida são injetadas através de uma membrana dedicada no vaso de purga.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig02.jpg"> Figura 2: Estrutura de um vaso de purga para detecção baseada em óxido nítrico à base de quimiotrica O vaso de purga (à direita) permite a detecção de gás óxido nítrico (NO) ou qualquer outro composto que possa ser facilmente convertido em nenhum gás quando liberado de um reagente de fase líquida. A entrada de gás inerte está conectada a uma fonte (tanque) de um gás inerte como Argon, Xeon ou nitrogênio diatômico (N2). A válvula da agulha (abre à esquerda) é usada para controle de pressão dentro do vaso de purga e pode ser completamente removida para limpar o vaso. A porta de injeção é coberta por uma tampa com um septo de membrana para injeção de amostra. A membrana deve ser substituída com frequência. Uma jaqueta aquecida envolve a câmara de reação e é conectada a um banho de água quente para realizar o teste VCl3 em HCl. A saída do vaso de purgação está conectada ao detector de quimiominascência (CLD) ou à armadilha NaOH (necessária para vcl3 em ensaios HCl). Para drenar o conteúdo da câmara de reação, primeiro feche as torneiras na entrada de gás inerte e a saída do vaso de purga, feche a válvula da agulha, remova a tampa no porta de injeção e, finalmente, abra a torneira no ralo. A armadilha NaOH (esquerda) é necessária para ser colocada em linha entre o vaso de purga e o CLD se o ensaio VCl3 em HCl for realizado devido à corrosão do HCL. A conexão com o CLD sempre requer um filtro de campo intenso (IFD) a ser colocado entre o CLD e a saída do vaso de purga (ou a armadilha NaOH, se usado). O filtro IFD remove partículas aéreas e impede que o líquido passe pelo vaso de purga. PTFE = politetrafluoroetileno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como consequência, qualquer composto que possa ser convertido em NÃO através de uma reação química específica e controlada pode ser detectado com alta sensibilidade em qualquer fluido biológico e homogeneizar tecido24. A medição direta da fase de gás NO através da chemiluminescência é realizada tanto em ambientes experimentais quanto clínicos. Essas técnicas são amplamente descritas em outros lugares 33,34,35. A medição de NO2-, S-nitrosothiols, proteínas S-nitrosated e Fe-NOs pode ser realizada adicionando amostras em uma mistura de reação com triiodeto (I3-), que não libera gás estelioetricamente de todos esses compostos:
I3- → I2 + I-
2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O
I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+
2NO+ + 2I− → 2NO + I2
enquanto eu3- não reage com o NO 3-15. Medições precisas de cada composto são possíveis pelo pré-tratamento de alíquotas amostrais com sulfanilamida acidificada (AS) com ou sem cloreto mercúrico (HgCl2). Especificamente, o pré-tratamento com AS remove todo o conteúdo NO 2. Como consequência, o conteúdo NO medido pelo CLD reflete apenas a soma da concentração de S-NOs e Fe-NOs. A injeção de HgCl2 em uma alíquota de amostra antes da injeção de AS faz com que o NO2- seja liberado pelo S-NO. O tratamento com AS (levando à remoção nº2) garante que o teor de NÃO medido só reflete a concentração de Fe-NOs. Uma série de subtrações entre as avaliações permitem calcular a concentração precisa dos três derivados NO22.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig03.jpg"> Figura 3: Etapas na preparação da amostra para o ensaio i3- em ácido acético quemiluminescence. Os passos sequenciais para a preparação do ensaio i3- em ácido acético chemiluminescence são ilustrados. É necessário o uso de tubos de centrífuga protegidos pela luz. Os tubos 1, 2 e 3 são os usados para se preparar para o ensaio. Outra alíquota de amostra (tubo 4) é necessária para o ensaio VCl3 em HCl se for necessária a medição do nitrato (NO3-). As etapas são indicadas por números em vermelho. Pré-preenchimento (Passo 1) conforme indicado com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) ou HgCl2 antes de adicionar o volume amostral. Adicione o volume amostral (2) conforme indicado, vórtice e incubar por 2 minutos à temperatura ambiente (RT). Adicionar (3) PBS ou sulfanilamida acidificada (AS) conforme indicado,vórtice e incubar por 3 min no RT. Execute o ensaio (4). A concentração medida pelo ensaio é a soma da concentração dos compostos relatados sob cada tubo. O tubo número 1 permitirá medições de nitrito (NO2-), S-nitrosothiols (S-NO) e complexos ferro-nitrosilo (Fe-NOs) como um único sinal. Para a medição do nitrato (NO3-), as amostras devem ser executadas com i3- em ácido acético e VCl3 em ensaios de HCl, e o valor obtido a partir do tubo 1 deve ser subtraído do obtido do tubo 4. *Quantidades sugeridas a serem utilizadas para análise de Hb para determinação de resíduos NO2-, S-nitrosohemoglobina e ferro-nitrosibina-hemoglobina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para a medição Nº3, o cloreto de vanádio (III) (VCl3) em ácido clorídrico (HCl) é usado para conversão de NO3- a NO no vaso de purga, a fim de medir o nº3- estequiometricalmente com o CLD:
2 NO3-+ 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+
Para conseguir uma conversão suficientemente rápida, a reação precisa ser realizada a 90-95 °C. A redução de NO3- para NO2- é associada à redução de NO2- para NO por HCl. O metal vanadium também reduz os S-NOs liberando seu NO moiety22,36. A concentração final obtida pelo CLD com VCl3 em HCl reflete a concentração agregada de NO3-, NO2 e outros compostos nitrosados. A subtração do último valor da concentração rendeda com CLD com I3- permite o cálculo de Nº3- concentração36,37 (Figura 3).
No ensaio de consumo NO, a liberação contínua de NÃO no recipiente de purga por NENHUM doador como (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolato (DETA-NONOato) gera um sinal estável permitindo quantificar oxiHb sem células nas amostras injetadas. A quantidade de NÃO consumida no vaso de purga está em uma relação estequiométrica com a quantidade de oxicodona na amostra38.
Protocolos para medição de NO2-, NO3-, S-nitrosothiols, complexos ferro-nitrosilo e NO consumo por Hb livre de células em amostras de plasma são ilustrados. Estudos sobre NÃO no ambiente RBC requerem tratamento amostral específico seguido de cromatografia de exclusão para medir s-no-hb e hb-no extremamente frágeis, juntamente com a determinação da concentração total de Hb15,22. A preparação da amostra é fundamental na correção da medição. A pré-existência do NO2- em H2O e liberação do Nº2- durante o ensaio pode levar à medição de concentrações artificialmente maiores de nenhum derivado, como o S-NO-Hb14,39. Aspectos importantes da preparação da amostra também são apresentados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

A atividade de óxido nítrico (NO) in vivo é o resultado combinado de seus efeitos diretos, a ação de seus derivados gerados a partir da autoxidação no no, e os efeitos dos compostos nitrosos. Medir metabólitos NO é essencial para estudar nenhuma atividade tanto em níveis vasculares quanto em outros tecidos, especialmente nos ambientes experimentais onde o NO exógeno é administrado. Os ensaios de chemiluminescência à base de ozônio permitem medições precisas de metabólitos NO e NO em ambos os fluidos (incluindo plasma, homogeneizadores de tecido, culturas celulares) e misturas de gás (por exemplo, respiração exalada). NÃO reage com ozônio para gerar dióxido de nitrogênio em um estado animado. A consequente emissão de luz permite a fotodetecção e a geração de um sinal elétrico refletindo o teor NO da amostra. Alíquotas da mesma amostra podem ser usadas para medir metabólitos não específicos, como nitrato, nitrito, S-nitrosothiols e complexos ferro-nitrosilo. Além disso, o NO consumido pela hemoglobina livre de células também é quantificado com a análise de quimiluminescência. Uma ilustração de todas essas técnicas é fornecida.

O ensaio de Não-consumo por Hb livre de células foi utilizado em amostras contendo concentrações conhecidas de oxicodona livre de células (Figura 4). Como um heme de oxyHb stoichiometricamente libera uma molécula NO no ensaio, o oxyHb purificado sem células é usado para construir a curva de calibração para o ensaio (Figura Suplementar 3).
A relação dose-resposta entre hb livre de células (medida com um assiiz colorimétrico) e NO cons...

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Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Este protocolo permite que os pesquisadores usem proficientemente um detector de quimiluminescência para a medição de metabólitos de óxido nítrico sem a orientação ou a despesa de empregar pessoal dedicado no local. O ensaio baseado em chemiluminescência é o método mais sensível para detectar alterações mínimas nos níveis de óxido nítrico e seus metabólitos em qualquer amostra biológica. Óxido nítrico inalado é um gás terapêutico usado para uma grande variedade de doenças.É crucial que a progressão e a recuperação da doença estejam correlacionadas com precisão com os níveis de metabólito de óxido nítrico. Óxido nítrico inalado, um antimicrobiano, mostra promessa no tratamento de pacientes com doenças infecciosas das vias aéreas. O método de chemiluminescência fornece uma visão sobre a correlação da dose de óxido nítrico e seus metabólitos com alterações microbiológicas e fisiofiológicas.Para preparar a solução DETA-NONOate, adicione 10 miligramas de DETA-NONOate a 610 microlitres de hidróxido de sódio de 10 milimônios em PBS de pH 7.4 para gerar 100 mililitros de DETA-NONOate e mantê-lo no gelo. Para prosseguir, conecte a linha de oxigênio ao detector de quimiominascência e abra o tanque de oxigênio a uma pressão de acordo com as instruções do fabricante fornecidas no texto. Em seguida, conecte a linha de filtro dielétrico de campo intenso ao detector de quimiluminescência.Na interface do detector de chemiluminescência, comece a executar o programa de detecção de ensaios de fase líquida, garantindo que o fornecimento de oxigênio seja adequado e que o detector comece a amostragem, indicando a detecção por sinal em milívolos, caso contrário, solicitará um sinal de diagnóstico negativo. Para preparar o vaso de purga, feche o recipiente de purga nas três portas, parafusando totalmente a válvula da agulha à direita e fechando os galos de entrada e saída. Remova a tampa do vaso de purga.Adicione uma quantidade suficiente do reagente específico ao ensaio planejado à câmara de reação para que a agulha de seringa usada para injetar as amostras possa atingir a coluna de fluidos enquanto verifica a presença de uma linha de base estável e desejada. Para iniciar o fluxo de gás de purga, certifique-se de que o tanque de gás inerte esteja equipado com um regulador de dois estágios, e conecte o tanque de gás inerte com a entrada de gás do navio. Em seguida, abra a saída do navio de expurgo e abra o gás com uma pressão de saída no regulador de um a cinco libras por polegada quadrada.Em seguida, abra a entrada do recipiente de purga e abra lentamente a válvula de agulha do vaso de purga para permitir a entrada de gás e verificar borbulhar dentro do vaso de purga. Para ajustar o fluxo de gás, registre a pressão celular medida pelo detector de quimiluminescência com a linha de filtro dielétrico de campo intenso amostrando ar ambiente. Reposicione a tampa no recipiente de purga e conecte a linha de filtro dielétrico de campo intenso ao vaso de purga.Use a válvula da agulha para atingir a mesma pressão celular no nível do detector de quimiominascência que é registrado no ar ambiente. Para iniciar o programa de aquisição de sinal de chemiluminescence, conecte a porta serial do detector de quimiominascência à porta serial do computador na qual o programa de aquisição foi instalado. Então, execute o programa de análise.Clique em Adquirir e selecione a pasta para salvar o arquivo de dados, digite o nome do arquivo e clique em Salvar. Enquanto se prepara para a injeção de amostra, ajuste a escala de tensão na tela para ter controle sobre a linha de base direcionada clicando nos botões mínimos e/ou máximos e, em seguida, digitando o valor desejado. Para realizar a injeção amostral, enxágue a seringa pelo menos duas vezes ou mais com água desionizada e destilada antes de retirar cada amostra, e garantir uma ejeção de água desobstruída em uma limpeza de tarefa.Em seguida, insira a seringa no tubo de amostra enquanto segura a seringa e o tubo a uma distância próxima e puxe o êmbolo para o volume desejado, garantindo que nenhuma bolha de ar ou partes sólidas não homogeneizadas fiquem presas. Limpe a ponta da seringa com um limpador de tarefas e insira a seringa na tampa do setter na porta de injeção. Depois de verificar se a ponta da seringa está dentro da fase líquida, injete a amostra na câmara de reação.Para marcar a injeção no programa de software, digite o nome da amostra clicando na caixa cinza em Nomes de Amostra e clique em Mark Injection enquanto verifica se a injeção causa uma mudança para cima no sinal ou para baixo no consumo de óxido nítrico pelo ensaio de hemoglobina livre de células. A relação de resposta à dose entre hemoglobina livre de células e consumo de óxido nítrico foi medida através da chemiluminescência após bypass cardiopulmonar. Pode-se supor que há uma alta concentração de grupos de heme no estado oxidado limpando óxido nítrico.Em pacientes que recebem óxido nítrico durante o bypass cardiopulmonar, em vez disso, a maioria dos grupos de heme é reduzida e não consome óxido nítrico. Medições da concentração de hemoglobina livre de células indicaram uma eliminação lenta do plasma dentro de 12 horas após o bypass cardiopulmonar. No entanto, o consumo de óxido nítrico atingiu o pico em 15 minutos e não refletiu a eliminação da hemoglobina livre de células.As curvas de regressão linear do consumo de óxido nítrico por hemoglobina livre de células apresentaram prevalência de hemoglobina oxidada e nitric que consome óxido em 15 minutos, em oposição à hemoglobina mais reduzida na linha de base 4 horas e 12 horas de bypass pós-cardiopulmonar. Foram monitorados os efeitos da administração de gás óxido nítrico no consumo de óxido nítrico. Quando os pacientes foram tratados com gás óxido nítrico intra e pós-operatório, o aumento observado da hemoglobina livre após o bypass cardiopulmonar não foi associado a qualquer aumento no consumo de óxido nítrico.Os resultados indicaram que o óxido nítrico exogenou a administração reduziu a maior parte da hemoglobina livre e impediu a limpeza de óxido nítrico. O experimento só é válido se todas as condições permanecerem as mesmas. Se a altura do nível líquido exceder a coluna de reação, devemos parar e conduzir uma nova calibração.

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Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Técnicas Analíticas para ensaiar Bioatividade Óxido Nítrico

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Luminescência de Cerenkov Imaging (CLI) para o Monitoramento Terapia de Câncer

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nephrectomy em combinação com uma dieta alta de sal e Óxido Nítrico Sintase inibição para induzir o Doença Renal Crônica no Rato Lewis

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Géis de poliacrilamida para Invadopodia e Tração Força Ensaios sobre as células cancerosas

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

Arrojo, agressão e Ensaios shoaling para Zebrafish Síndromes Comportamentais

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Síntese, Caracterização e Aplicação de Nanoprobes superparamagnéticos de óxido de ferro para detecção de tuberculose extrapulmonar

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Detecção baseada em plaquetas de óxido nítrico no sangue, medindo-se a fosforilação VASP

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Um novo sistema de máscara de inalação para fornecer altas concentrações de gás óxido nítrico em sujeitos de respiração espontânea

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...