Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Протоколы, описанные в этой рукописи, стали возможными благодаря накопленному вкладу предыдущих сотрудников лаборатории исследований анестезии в реаниматологии доктора Уоррена Запола, отделение анестезии в Массачусетской больнице общего профиля. Мы признаем вклад докторов Акито Накагавы, Франческо Задека, Эмануэле Вассены, Чонг Лея, Ясуко Нагасака, Эстер Спаньолли и Эмануэле Резоальи.

Процедуры, указанные в этом протоколе, соответствуют совету по обзору Массачусетской больницы общего профиля. Образцы крови, которые использовались, были собраны во время предыдущего исследования и были деидентифицированы для текущей цели18.
ПРИМЕЧАНИЕ: См?...

Из-за высокой чувствительности хемилюминесцентные анализы для определения NO и связанных с ним соединений имеют высокий риск загрязнения NO2-. Каждый реагент (особенно NO 2-блокирующий раствор) и разбавитель (включая ddH2O), используемые в эксперименте, должны бы...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

Активность оксида азота (NO) in vivo представляет собой комбинированные результаты его прямых эффектов, действия его производных, полученных в результате аутоксидации NO, и эффектов нитрозированных соединений. Измерение метаболитов NO имеет важное значение для изучения активности NO как на сосудистом уровне, так и в других тканях, особенно в экспериментальных условиях, где вводят экзогенный NO. Хемилюминесцентные анализы на основе озона позволяют точно измерять метаболиты NO и NO как в жидкостях (включая плазму, гомогенаты тканей, клеточные культуры), так и в газовых смесях (например, выдыхаемое дыхание). NO реагирует с озоном с образованием диоксида азота в возбужденном состоянии. Последующее световое излучение позволяет фотодетектировать и генерировать электрический сигнал, отражающий содержание NO в образце. Аликвоты из одного и того же образца могут быть использованы для измерения конкретных метаболитов NO, таких как нитраты, нитриты, S-нитрозотиолы и комплексы железа-нитрозила. Кроме того, NO, потребляемое бесклеточным гемоглобином, также количественно определяется с помощью хемилюминесцентного анализа. Приведена иллюстрация всех этих методов.

No-потребление бесклеточным анализом Hb использовалось в образцах, содержащих известные концентрации бесклеточного оксиHb (рисунок 4). Поскольку один гем оксиHb стехиометрически высвобождает одну молекулу NO в анализе, очищенный бесклеточный oxyHb используется для построени...

Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Здесь мы представляем протоколы обнаружения оксида азота и его биологически значимых производных с использованием хемилюминесцентных анализов с высокой чувствительностью.

Хемилюминесцентные анализы для обнаружения оксида азота и его производных от аутоксидации и нитрозированных соединений

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Этот протокол позволяет исследователям умело использовать детектор хемилюминесценции для измерения метаболитов оксида азота без руководства или затрат на использование специального персонала на месте. Анализ на основе хемилюминесценции является наиболее чувствительным методом для обнаружения минимальных изменений уровней оксида азота и его метаболитов в любом данном биологическом образце. Ингаляционный оксид азота является лечебным газом, используемым при самых разнообразных заболеваниях.Крайне важно, чтобы прогрессирование заболевания и выздоровление были точно коррелированы с уровнями метаболитов оксида азота. Ингаляционный оксид азота, противомикробное средство, показывает перспективность в лечении пациентов с инфекционными заболеваниями дыхательных путей. Метод хемилюминесценции дает представление о корреляции дозы оксида азота и его метаболитов с микробиологическими и патофизиологическими изменениями.Чтобы приготовить раствор DETA-NONOate, добавьте 10 миллиграммов DETA-NONOate к 610 микролитрам 10-миллимолярного гидроксида натрия в PBS рН 7,4, чтобы получить 100 миллимоляров DETA-NONOATE и сохранить его на льду. Чтобы продолжить, подключите кислородную линию к детектору хемилюминесценции и откройте кислородный баллон под давлением в соответствии с инструкцией завода-изготовителя, приведенной в тексте. Затем подключите линию диэлектрического фильтра интенсивного поля к детектору хемилюминесценции.На интерфейсе детектора хемилюминесценции запустите программу обнаружения анализов жидкой фазы, убедившись, что подача кислорода достаточна, и детектор начнет отбор проб, указывающий на обнаружение сигналом в милливольтах, в противном случае вызвать отрицательный диагностический сигнал. Чтобы подготовить продувочный сосуд, закройте продувочный сосуд на всех трех портах, полностью прикрутив игольчатый клапан вправо и закрыв впускной и выпускной петухи. Снимите колпачок с продувочного сосуда.Добавьте достаточное количество реагента, специфичного для запланированного анализа, в реакционную камеру, чтобы шприц-игла, используемая для введения образцов, могла достичь колонки жидкости, проверяя при этом наличие стабильного, желаемого исходного уровня. Чтобы запустить поток продувочного газа, убедитесь, что резервуар для инертного газа оснащен двухступенчатым регулятором, и соедините резервуар для инертного газа с газовым входом сосуда. Затем откройте выходное отверстие продувочного сосуда и откройте газ с давлением на выходе у регулятора от одного до пяти фунтов на квадратный дюйм.Затем откройте входное отверстие продувочного сосуда и медленно откройте игольчатый клапан продувочного сосуда, чтобы обеспечить приток газа и проверить пузырьки в продувочном сосуде. Чтобы отрегулировать поток газа, запишите давление в ячейке, измеренное детектором хемилюминесценции, с помощью линии диэлектрического фильтра интенсивного поля для отбора проб окружающего воздуха. Переставьте колпачок на продувочный сосуд и подключите линию диэлектрического фильтра интенсивного поля к продувочному сосуду.Используйте игольчатый клапан для достижения того же давления в клетке на уровне детектора хемилюминесценции, которое регистрируется в окружающем воздухе. Чтобы запустить программу получения сигнала хемилюминесценции, подключите последовательный порт детектора хемилюминесценции к последовательному порту компьютера, в который установлена программа сбора. Затем запустите программу анализа.Нажмите «Получить», затем выберите папку для сохранения файла данных, введите имя файла и нажмите «Сохранить». Во время подготовки к впрыску образца отрегулируйте шкалу напряжения на экране, чтобы иметь контроль над целевой базовой линией, нажав на минимальную и/или максимальную кнопки, а затем введя желаемое значение. Чтобы выполнить инъекцию образца, промойте шприц по крайней мере дважды или более деионизированной и дистиллированной водой перед изъятием каждого образца и обеспечьте беспрепятственный выброс воды на заданную салфетку.Затем вставьте шприц в пробу, удерживая шприц и трубку на близком расстоянии, и подтяните плунжер до нужного объема, гарантируя, что пузырь воздуха или негомогенизированные твердые части не будут захвачены. Очистите наконечник шприца с помощью стеклоочистителя и вставьте шприц в колпачок сеттера в инжекторном отверстии. Убедившись, что наконечник шприца находится в жидкой фазе, введите образец в реакционную камеру.Чтобы отметить инъекцию в программном обеспечении, введите имя образца, щелкнув серое поле в разделе «Имена образцов», затем нажмите «Mark Injection», убедившись, что инъекция вызывает изменение сигнала в сторону повышения или уменьшения потребления оксида азота бесклеточным анализом гемоглобина. Зависимость дозового ответа между бесклеточным гемоглобином и потреблением оксида азота измеряли с помощью хемилюминесценции после сердечно-легочного шунтирования. Можно предположить, что наблюдается высокая концентрация гемовых групп в окисленном состоянии поглощающего оксид азота.У пациентов, получающих оксид азота во время сердечно-легочного шунтирования, вместо этого большинство гемовых групп снижается и не потребляет оксид азота. Измерения концентрации бесклеточного гемоглобина указывали на медленное выведение из плазмы в течение 12 часов после сердечно-легочного шунтирования. Однако потребление оксида азота достигло пика через 15 минут и не отражало элиминацию бесклеточного гемоглобина.Линейные регрессионные кривые потребления оксида азота бесклеточным гемоглобином показали преобладание окисленного и потребляющего оксид азота гемоглобина через 15 минут, в отличие от более сниженного гемоглобина на исходном уровне 4 часов и 12 часов после сердечно-легочного шунтирования. Контролировалось влияние введения газа оксида азота на потребление оксида азота. Когда пациентов лечили газом оксида азота внутри- и послеоперационно, наблюдаемое повышение свободного гемоглобина после сердечно-легочного шунтирования не сочеталось с каким-либо увеличением потребления оксида азота.Результаты показали, что экзогенно вводимый оксид азота восстанавливал большую часть свободного гемоглобина и предотвращал удаление оксида азота. Эксперимент действителен только в том случае, если все условия остаются неизменными. Если высота уровня жидкости превышает реакционную колонну, мы должны остановиться и провести новую калибровку.

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Обнаружение и Genogrouping норовирусов от стулья Детский По Taqman один шаг RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Производство и обнаружения активных форм кислорода (АФК) в Раки

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Аналитические методы пробирного азотной окиси биоактивность

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Черенковского свечения Imaging (CLI) для мониторинга терапии рака

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th нефрэктомии в сочетании с высоким содержанием соли и азотной ингибирование синтазы, чтобы побудить хронического заболевания почек у крыс Льюиса

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Полиакриламидные Гели для Invadopodia и тяговое усилие Анализы на клетках рака

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

Смелостью, агрессивностью и обмеления Анализы для данио рерио Поведенческие синдромы

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Синтез, характеристика и применение суперпарамагнитных нанозондов оксида железа для обнаружения экстралегочного туберкулеза

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Обнаружение на основе тромбоцитов оксида азота в крови путем измерения VASP фосфорилирование

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Новая система ингаляционных масок для доставки высоких концентраций газа оксида азота у спонтанно дышащих субъектов

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...