Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
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Los protocolos reportados en este manuscrito fueron posibles gracias a las contribuciones acumuladas de becarios anteriores del laboratorio de Investigación de Anestesia en Cuidados Críticos del Dr. Warren Zapol, Departamento de Anestesia del Hospital General de Massachusetts. Reconocemos la contribución de los Dres. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli y Emanuele Rezoagli.

Los procedimientos indicados en este protocolo están de acuerdo con la junta de revisión del Hospital General de Massachusetts. Las muestras de sangre que se utilizaron habían sido recogidas durante un estudio previo y fueron desidentificadas para el propósito actual18.
NOTA: Consulte las instrucciones del fabricante para obtener orientación específica sobre las conexiones óptimas entre los tubos y la cristalería que constituyen el recipiente de purga, el lavado...

Debido a la alta sensibilidad, los ensayos basados en quimioluminiscencia para la determinación de NO y compuestos relacionados tienen un alto riesgo de contaminación por NO2. Cada reactivo (especialmente la solución de bloqueo de NO2) y diluyente (incluido ddH2O) utilizado en el experimento debe probarse por su contenido de NO2- para corregir la señal de fondo. El nitrito es extremadamente reactivo con una vida media en sangre total alreded...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

La actividad del óxido nítrico (NO) in vivo es el resultado combinado de sus efectos directos, la acción de sus derivados generados a partir de la autoxidación del NO y los efectos de los compuestos nitrosados. La medición de los metabolitos de NO es esencial para estudiar la actividad del NO tanto a nivel vascular como en otros tejidos, especialmente en los entornos experimentales donde se administra NO exógeno. Los ensayos de quimioluminiscencia a base de ozono permiten mediciones precisas de metabolitos de NO y NO tanto en fluidos (incluidos plasma, homogeneizados de tejidos, cultivos celulares) como en mezclas de gases (por ejemplo, aliento exhalado). El NO reacciona con el ozono para generar dióxido de nitrógeno en un estado excitado. La consiguiente emisión de luz permite la fotodetección y la generación de una señal eléctrica que refleje el contenido de NO de la muestra. Las alícuotas de la misma muestra se pueden usar para medir metabolitos específicos de NO, como nitrato, nitrito, S-nitrosotioles y complejos hierro-nitrosil. Además, el NO consumido por la hemoglobina libre de células también se cuantifica con el análisis de quimioluminiscencia. Se proporciona una ilustración de todas estas técnicas.

El consumo de NO por el ensayo de Hb libre de células se utilizó en muestras que contenían concentraciones conocidas de oxyHb libre de células (Figura 4). Como un hemo de oxyHb libera estequiométricamente una molécula de NO en el ensayo, se utiliza oxyHb libre de células purificadas para construir la curva de calibración para el ensayo (Figura suplementaria 3).
La relación dosis-respuesta entre la Hb libre de células (medida con un ensay...

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Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Aquí, presentamos protocolos para detectar el óxido nítrico y sus derivados biológicamente relevantes utilizando ensayos basados en quimioluminiscencia con alta sensibilidad.

Ensayos basados en quimioluminiscencia para la detección de óxido nítrico y sus derivados de la autoxidación y compuestos nitrosados

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Este protocolo permite a los investigadores utilizar de manera competente un detector de quimioluminiscencia para la medición de metabolitos de óxido nítrico sin la guía o el gasto de emplear personal dedicado en el sitio. El ensayo basado en quimioluminiscencia es el método más sensible para detectar cambios mínimos en los niveles de óxido nítrico y sus metabolitos en cualquier muestra biológica dada. El óxido nítrico inhalado es un gas terapéutico utilizado para una amplia variedad de enfermedades.Es crucial que la progresión y la recuperación de la enfermedad se correlacionen con precisión con los niveles de metabolitos de óxido nítrico. El óxido nítrico inhalado, un antimicrobiano, se muestra prometedor en el tratamiento de pacientes con enfermedades infecciosas de las vías respiratorias. El método de quimioluminiscencia proporciona información sobre la correlación de la dosis de óxido nítrico y sus metabolitos con los cambios microbiológicos y fisiopatológicos.Para preparar la solución de DETA-NONOato, agregue 10 miligramos de DETA-NONOato a 610 microlitros de hidróxido de sodio 10 milimolar en PBS de pH 7.4 para generar 100 milimolares de DETA-NONOato y mantenerlo en hielo. Para continuar, conecte la línea de oxígeno al detector de quimioluminiscencia y abra el tanque de oxígeno a una presión de acuerdo con las instrucciones del fabricante proporcionadas en el texto. Luego, conecte la línea de filtro dieléctrico de campo intenso al detector de quimioluminiscencia.En la interfaz del detector de quimioluminiscencia, comience a ejecutar el programa de detección para ensayos de fase líquida, asegurándose de que el suministro de oxígeno sea adecuado y que el detector comience a muestrear, lo que indica la detección por señal en milivoltios, de lo contrario provocará una señal de diagnóstico negativa. Para preparar el recipiente de purga, cierre el recipiente de purga en los tres puertos atornillando completamente la válvula de aguja a la derecha y cerrando las llaves de parada de entrada y salida. Retire la tapa del recipiente de purga.Agregue una cantidad suficiente del reactivo específico para el ensayo planificado a la cámara de reacción para que la aguja de la jeringa utilizada para inyectar las muestras pueda alcanzar la columna de fluido mientras se verifica la presencia de una línea de base estable y deseada. Para iniciar el flujo de gas de purga, asegúrese de que el tanque de gas inerte esté equipado con un regulador de dos etapas y conecte el tanque de gas inerte con la entrada de gas del recipiente. Luego, abra la salida del recipiente de purga y abra el gas con una presión de salida en el regulador de una a cinco libras por pulgada cuadrada.Luego, abra la entrada del recipiente de purga y abra lentamente la válvula de aguja del recipiente de purga para permitir la entrada de gas y verificar el burbujeo dentro del recipiente de purga. Para ajustar el flujo de gas, registre la presión de la celda medida por el detector de quimioluminiscencia con la línea de filtro dieléctrico de campo intenso que muestrea el aire ambiente. Vuelva a colocar la tapa en el recipiente de purga y conecte la línea de filtro dieléctrico de campo intenso al recipiente de purga.Use la válvula de la aguja para alcanzar la misma presión celular al nivel del detector de quimioluminiscencia que se registra en el aire ambiente. Para iniciar el programa de adquisición de señal de quimioluminiscencia, conecte el puerto serie del detector de quimioluminiscencia al puerto serie del equipo en el que se ha instalado el programa de adquisición. A continuación, ejecute el programa de análisis.Haga clic en Adquirir, luego seleccione la carpeta para guardar el archivo de datos, escriba el nombre del archivo y haga clic en Guardar. Mientras se prepara para la inyección de muestras, ajuste la escala de voltaje en la pantalla para tener control sobre la línea de base objetivo haciendo clic en los botones mínimo y / o máximo, y luego ingresando el valor deseado. Para realizar la inyección de muestra, enjuague la jeringa al menos dos veces o más con agua desionizada y destilada antes de extraer cada muestra, y asegúrese de una eyección de agua sin obstrucciones en una toallita de tarea.Luego, inserte la jeringa en el tubo de muestra mientras mantiene la jeringa y el tubo a una distancia cercana y tire del émbolo hasta el volumen deseado mientras se asegura de que no queden atrapadas burbujas de aire ni piezas sólidas no homogeneizadas. Limpie la punta de la jeringa con un limpiaparabrisas de tareas e inserte la jeringa en la tapa del colocador en el puerto de inyección. Después de verificar que la punta de la jeringa está dentro de la fase líquida, inyecte la muestra en la cámara de reacción.Para marcar la inyección en el programa de software, escriba el nombre de la muestra haciendo clic en el cuadro gris debajo de Nombres de muestra, luego haga clic en Marcar inyección mientras verifica que la inyección cause un cambio hacia arriba en la señal o hacia abajo en el consumo de óxido nítrico mediante el ensayo de hemoglobina libre de células. La relación dosis-respuesta entre la hemoglobina libre de células y el consumo de óxido nítrico se midió a través de la quimioluminiscencia después del bypass cardiopulmonar. Se puede suponer que hay una alta concentración de grupos hemo en el estado oxidado que elimina el óxido nítrico.En pacientes que reciben óxido nítrico durante el bypass cardiopulmonar, en cambio, la mayoría de los grupos hemo se reducen y no consumen óxido nítrico. Las mediciones de la concentración de hemoglobina libre de células indicaron una eliminación lenta del plasma dentro de las 12 horas posteriores al bypass cardiopulmonar. Sin embargo, el consumo de óxido nítrico alcanzó su punto máximo a los 15 minutos y no reflejó la eliminación de la hemoglobina libre de células.Las curvas de regresión lineal del consumo de óxido nítrico por hemoglobina libre de células exhibieron una prevalencia de hemoglobina oxidada y consumidora de óxido nítrico a los 15 minutos, en comparación con una hemoglobina más reducida al inicio de 4 horas y 12 horas después del bypass cardiopulmonar. Se monitorearon los efectos de la administración de gas de óxido nítrico sobre el consumo de óxido nítrico. Cuando los pacientes fueron tratados con gas óxido nítrico intra y postoperatorio, el aumento observado de hemoglobina libre después del bypass cardiopulmonar no se combinó con ningún aumento en el consumo de óxido nítrico.Los resultados indicaron que el óxido nítrico administrado exógenamente redujo la mayor parte de la hemoglobina libre y evitó la eliminación de óxido nítrico. El experimento es válido sólo si todas las condiciones siguen siendo las mismas. Si la altura del nivel de líquido supera la columna de reacción, debemos detenernos y realizar una nueva calibración.

Research

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Medicine

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