Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Protokollen som rapporteras i detta manuskript möjliggjordes av de ackumulerade bidragen från tidigare kamrater från Dr. Warren Zapols laboratorium för anestesiforskning i kritisk vård, avdelningen för anestesi vid Massachusetts General Hospital. Vi erkänner bidraget från Drs. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli och Emanuele Rezoagli.

De förfaranden som anges i detta protokoll är i enlighet med granskningsnämnden för Massachusetts General Hospital. De blodprover som användes hade samlats in under en tidigare studie och avidentifierats för det aktuella ändamålet18.
OBS: Se tillverkarens instruktioner för specifik vägledning om optimala anslutningar mellan slangar och glas som utgör reningskärlet, tvätt och allmänt underhåll. Anslutningarna måste vara fasta och noggrant gjorda för att ...

På grund av den höga känsligheten har kemiluminescensbaserade analyser för bestämning av NO och besläktade föreningar en hög risk för NO 2-kontaminering. Varje reagens (särskilt NO 2-blockerande lösning) och spädningsmedel (inklusive ddH2O) som används i experimentet bör testas för dess NO 2-innehåll för att korrigera för bakgrundssignal. Nitrit är extremt reaktivt med en halveringstid i helblod runt 10 min och genererar snabb...

Sedan Salvador Moncada och Nobelpristagarna Robert Furchgott, Louis Ignarro och Ferid Murad identifierade kväveoxid (NO) som den tidigare kända endotel-härledda avslappningsfaktorn (EDRF), har NO: s centrala roll fastställts i flera nyckelmekanismer som spänner över hela vaskulär biologi, neurovetenskap, metabolism och värdrespons 1,2,3,4,5,6,7 . Exogen administrering av NO-gas har blivit en etablerad behandling för andningssvikt på grund av pulmonell hypertension hos nyfödda8. Kväveoxidgas har också undersökts för behandling av respiratorisk syncytialvirusinfektion (RSV), malaria och andra infektionssjukdomar, ischemi-reperfusionsskada och för förebyggande av akut njurskada hos patienter som genomgår hjärtkirurgi 9,10,11,12. Behovet av exakta mättekniker för att bedöma nivåerna av NO, dess metaboliter och nivåerna av dess målproteiner och föreningar härrör från både mekanistiska och interventionella studier.
På grund av sin höga reaktivitet kan NO genomgå olika reaktioner beroende på den biologiska matrisen i vilken den produceras och/eller friges. I frånvaro av hemoglobin (Hb) eller andra oxihemoproteiner oxideras NO nästan helt till nitrit (NO2-).
2NO + O2 →2NO2
NO2 + NO →N2O3
N2O3+H2O→NO2- + H + 
NO genomgår först autoxidation med molekylärt syre (O2) för att ge kvävedioxid (NO2) och reagerar med NO2 själv för att generera dikvävetrioxid (N2O3). En molekyl avN2O3reagerar med vatten (H2O) för att bilda två molekyler av NO2- och en proton (H+)13. Inom helblodomvandlas 14,15, NO och NO2- snabbt till nitrat (NO3-) eftersom dessa molekyler reagerar ivrigt med de oxiderade hemgrupperna av Hb [Hb-Fe2+-O2 eller oxyhemoglobin (oxyHb)] för att ge NO 3-. Denna reaktion är kopplad till övergången av hemgruppen till järntillståndet [Hb-Fe3+ eller methemoglobin (metHb)]:
Hb-Fe2+-O2 + INGEN → Hb-Fe3+ + NO3-
Barriären för röda blodkroppar (RBC) och utrymmet omedelbart intill endotelet är de viktigaste faktorerna som begränsar denna reaktion och tillåter en liten del av NO som frigörs av endotelet att fungera som EDRF16,17. Faktum är att cellfritt Hb i cirkulationen är känt för att störa vasodilatation i experimentella och kliniska miljöer17,18. Inom RBC, beroende på syresättning och NO 2-koncentration, reagerar en del av NO med deoxihemoglobin (Hb-Fe2+) för att bilda järn-nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO eller HbNO):
Hb-Fe2+ + INGEN → Hb-Fe2+-NO
I RBC15,17 kan NO2- bilda Hb-Fe3+ genom att reducera Hb-Fe2+ vilket leder till frisättning av NO, vilket i sin tur binder Hb-Fe2+-O2 (företrädesvis) eller Hb-Fe2+.
Genereringen av NO-derivat bör inte betraktas som strikt enkelriktad eftersom NO kan regenereras från NO2- ochNO3- i olika vävnader och av olika enzymer (t.ex. av tarmbakterier eller inom mitokondrier, särskilt under hypoxiska förhållanden)19,20.
En varierande mängd NO som produceras (eller administreras) leder till nedströms generering av S-nitrosotioler, huvudsakligen genom tioltransnitrosation frånN2O3i närvaro av en nukleofil som skapar en NO+ givarmediär (Nuc-NO+-NO2-):
N2O3+ RS- → RS-NO + NO 2-
En annan möjlighet för S-nitrosotioler generering är nitrosylering av oxiderade tioler (NO reagerar med en oxiderad tiol):
RS• + INGEN → RS-NO
Denna mekanism och direkt tioloxidation med NO2 kan vara möjlig endast under mycket specifika förhållanden som beskrivs någon annanstans21. S-nitrosotioler sträcker sig från ljusmolekyler som S-nitrosoglutation till stora tiolhaltiga proteiner. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb) bildas genom nitrosering av en tiolgrupp av en konserverad cysteinrest i β-chain (β93C)22.
Genereringen och metabolismen av S-nitrosotiolaler är en del av viktiga regleringsmekanismer. Exempel inkluderar reglering av glutation, kaspaser, N-metyl-D-aspartat (NMDA) och ryanodinreceptorer 23,24,25,26,27,28. Nitroserat albumin (S-nitroso-albumin) har tidigare betraktats som en viktig medlare av NO-biologi in vivo och verkar vara en NO/NO+-transportör utan någon specifik ytterligare biologisk aktivitet29.
Vid mätning av koncentrationen av NO och dess derivat från ett specifikt biologiskt prov inom en biologisk matris är det viktigt att överväga egenskaper som surhet, syresättning, temperatur och närvaron av reagenser. Exempel inkluderar administrerade exogena NO-givare och, vid inställning av akut inflammation, väteperoxid (H2O2) som reagerar med NO2 vilket leder till generering av supernormal koncentration av fria radikaler som peroxinitrit (ONOO-)21. Förutom den analysmetod som används är den preanalytiska fasen av provberedning och lagring grundläggande. Reaktioner nedströms som inte representerar in vivo NO-aktiviteten ska förutsägas, beaktas och blockeras. Ett giltigt exempel är instabiliteten hos S-NO-Hb, som kräver en särskild behandling av blodprover när den är avsedd för mätning22.
Kemiluminescensbaserade analyser är guldstandarden för att detektera nivåerna av NO och dess huvudmetaboliter [NO 2-,NO3-, S-NO och järn-nitrosylkomplex (Fe-NO)] i någon biologisk vätska, inklusive vävnadshomogenater 30,31. Dessa metoder bygger på kemiluminescensdetektorn (CLD), en anordning som rymmer reaktionen av NO med ozon (O3), vilket genererar NO2 i ett exciterat tillstånd (NO2•). Avslappning av NO2• orsakar utsläpp av en foton av ljus som detekteras av ett fotomultiplikerarrör, vilket genererar en elektrisk signal som är direkt proportionell mot NO-halten i den samplade gasblandningen32. Ett förenklat schema över CLD representeras.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig01.jpg"> Figur 1: Förenklat schema över en kemiluminescensdetektor för kväveoxidgas. Kemiluminescensbaserad detektion av kväveoxid (NO) är den stökiometriska generationen av en foton per NO-gasmolekyl som införs i kemiluminescensdetektorn (CLD). Kemiluminescensreaktionen erhålles i en utsedd kammare försedd med ozon (O3) från en intern generator, som hålls vid undertryck genom anslutning till en extern pump, vilket möjliggör kontinuerligt och konstant inflöde av provgas. Genereringen avO3 kräver diatomiskt syre (O2) som levereras av en dedikeradO2-tank ansluten till CLD (andra tillverkare tillhandahåller CLD som arbetar med omgivande luft). Inom reaktionskammaren reagerar varje molekyl av NO-gas som finns i den provterade gasen med syre för att ge en molekyl kvävedioxid i aktiverat tillstånd (NO2*). Genom att återgå till sitt marktillstånd avger varjeNO2*-molekyl en foton som detekteras av ett fotomultiplikorrör (PMT) som ligger intill reaktionskammaren. PMT med tillhörande förstärkare och centralprocessor producerar en signal som är proportionell mot fotontalet och antalet NO-molekyler i reaktionskammaren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
CLD:s provingringsprov kan anslutas till ett glassystem som innehåller en reaktionskammare för vätskeprover. Systemet rensas kontinuerligt med en inert gas såsom kväve, helium eller argon, vilket överför NO från reaktionskammaren till CLD. Vätskefasprover injiceras genom ett dedikerat membran i reningskärlet.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig02.jpg"> Figur 2: Struktur av ett reningskärl för kemiluminescensbaserad detektion av kväveoxidgas Reningskärlet (höger) möjliggör detektion av kväveoxid (NO) gas eller någon annan förening som lätt kan omvandlas till INGEN gas när den frigörs från ett vätskefasreagens. Det inerta gasinloppet är anslutet till en källa (tank) till en inert gas såsom Argon, Xeon eller diatomiskt kväve (N2). Nålventilen (öppnas till vänster) används för tryckreglering i reningskärlet och kan tas bort helt för att rengöra kärlet. Injektionsporten är täckt av ett lock med ett membranseptum för provinjektion. Membranet bör bytas ut ofta. En uppvärmd mantel omger reaktionskammaren och är ansluten till ett varmvattenbad för att utföra VCl3 i HCl-analysen. Reningskärlets utlopp är anslutet till kemiluminescensdetektorn (CLD) eller till NaOH-fällan (krävs för VCl3 i HCl-analyser). För att tömma reaktionskammarens innehåll, stäng först stoppkranarna vid det inerta gasinloppet och rensningskärlets utlopp, stäng nålventilen, ta bort locket vid injektionsporten och öppna slutligen stoppkranen vid avloppet. NaOH-fällan (vänster) måste placeras inline mellan reningskärlet och CLD om VCl3 i HCl-analysen utförs på grund av frätandet av HCl. Anslutningen till CLD kräver alltid att ett intensivt fältdielektriskt (IFD) filter placeras mellan CLD och utgången från rensningskärlet (eller NaOH-fällan, om den används). IFD-filtret tar bort luftburna partiklar och hindrar vätska från att passera genom reningskärlet. PTFE = polytetrafluoretylen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Som en konsekvens kan varje förening som kan omvandlas till NO genom en specifik och kontrollerad kemisk reaktion detekteras med hög känslighet i vilken biologisk vätska och vävnadshomogenat som helst24. Direkt mätning av gasfas NO genom kemiluminescens utförs i både experimentella och kliniska miljöer. Dessa tekniker beskrivs utförligt någon annanstans 33,34,35. Mätning av NO2-, S-nitrosotioler, S-nitroserade proteiner och Fe-NOs kan utföras genom tillsats av prover i en reaktionsblandning med trijodid (I3-), som stökiometriskt frigör INGEN gas från alla dessa föreningar:
I3- → I2 + I-
2NO2− +2I− +4H+ → 2NO +I2 +2H2O
I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+
2NO+ + 2I− → 2NO + I2
medan jag3- inte reagerar med NO 3-15. Exakta mätningar av varje förening möjliggörs genom förbehandling av provalikvoter med surgjord sulfanilamid (AS) med eller utan kvicksilverklorid (HgCl2). Specifikt tar förbehandling med AS bort allt NO 2-innehåll. Till följd av detta återspeglar NO-halten mätt med CLD endast summan av koncentrationen av S-NOs och Fe-NOs. Injektion avHgCl2 i ett prov alikvot före AS-injektion orsakar att NO2- frigörs av S-NO. Behandling med AS (vilket leder till borttagning av NO2) säkerställer att den uppmätta NO-halten endast återspeglar koncentrationen av Fe-NO. En serie subtraktioner mellan bedömningarna gör det möjligt att beräkna den exakta koncentrationen av de tre NO-derivaten22.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig03.jpg"> Figur 3: Steg i provberedningen för I3- i ättiksyrakemiluminiscensanalysen. De sekventiella stegen för framställning av I3- i ättiksyrakemiluminiscensanalys illustreras. Användning av ljusskyddade centrifugrör krävs. Rör 1, 2 och 3 är de som används för att förbereda sig för analysen. En annan provalimit (rör 4) behövs förVCl3 i HCl-analysen om mätning av nitrat (NO3-) krävs. Steg indikeras med siffror i rött. Förfyllning (steg 1) enligt vad som anges med fosfatbuffertsaltlösning (PBS) ellerHgCl2 innan provvolymen tillsätts. Tillsätt provvolymen (2) enligt anvisningarna, virvel och inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur (RT). Tillsätt (3) PBS eller surgjord sulfanilamid (AS) enligt anvisningarna, virvel och inkubera i 3 min vid RT. Kör analysen (4). Den koncentration som mäts med analysen är summan av koncentrationen av de föreningar som rapporterats under varje rör. Rör nummer 1 möjliggör mätningar av nitrit (NO2-), S-nitrosotiolaler (S-NO) och järn-nitrosylkomplex (Fe-NOs) som en enda signal. För nitratmätning (NO3-) ska proverna köras med både I 3-i ättiksyra och VCl3 i HCl-analyser, och det värde som erhålls från rör 1 ska subtraheras från det som erhålls från rör 4. *föreslagna kvantiteter som ska användas för Hb-analys för bestämning av kvarvarande NO2-, S-nitrosohemoglobin och järn-nitrosyl-hemoglobin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
För NO 3-mätning används vanadin (III)klorid (VCl3) i saltsyra (HCl) för omvandling av NO3- till NO i reningskärlet för att mäta NO 3-stökiometriskt med CLD:
2 NO3-+ 3V + 3 + 2H2 O → 2NO+ 3VO2+ + 4H+
För att uppnå en tillräckligt snabb omvandling måste reaktionen utföras vid 90-95 °C. Reduktion från NO3- till NO2- är kopplad till reduktion av NO2- till NO med HCl. Vanadinmetall minskar också S-NOs som frigör sin NO-del22,36. Den slutliga koncentrationen erhållen genom CLD medVCl3 i HCl återspeglar den aggregerade koncentrationen avNO3-,NO2- och andra nitroserade föreningar. Subtraktion av det senare värdet från den koncentration som avges med CLD med I3- möjliggör beräkning av NO 3-koncentration 36,37 (figur 3).
I NO-konsumtionsanalysen genererar den kontinuerliga frisättningen av NO i reningskärlet av NO-givare som (Z)-1-[2-(2-aminoetyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolat (DETA-NONOate) en stabil signal som möjliggör kvantifiering av cellfri oxyHb i de injicerade proverna. Mängden NO som konsumeras i reningskärlet är i ett stökiometriskt förhållande till mängden oxyHb i provet38.
Protokoll för mätning av NO2-,NO3-, S-nitrosotiolaler, järn-nitrosylkomplex och NO-konsumtion med cellfritt Hb i plasmaprover illustreras. Studier av NO i RBC-miljön kräver specifik provbehandling följt av uteslutningskromatografi för att mäta extremt ömtålig S-NO-Hb och Hb-NO i kombination med bestämning av total Hb-koncentration15,22. Provberedning är avgörande för att korrigera mätningen. Förekomst av NO2- iH2Ooch frisättning av NO2- under analysen kan leda till mätning av artificiellt högre koncentrationer av NO-derivat såsom S-NO-Hb14,39. Viktiga aspekter av provberedning presenteras också.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

Kväveoxid (NO) aktivitet in vivo är de kombinerade resultaten av dess direkta effekter, verkan av dess derivat genererade från NO-autoxidation och effekterna av nitroserade föreningar. Mätning av NO-metaboliter är avgörande för att studera NO-aktivitet både vid vaskulära nivåer och i andra vävnader, särskilt i experimentella miljöer där exogent NO administreras. Ozonbaserade kemiluminescensanalyser möjliggör exakta mätningar av NO- och NO-metaboliter i både vätskor (inklusive plasma, vävnadshomogenater, cellkulturer) och gasblandningar (t.ex. utandad andedräkt). NO reagerar med ozon för att generera kvävedioxid i ett upphetsat tillstånd. Den därav följande ljusemissionen möjliggör fotodesektion och generering av en elektrisk signal som återspeglar NO-innehållet i provet. Alikvoter från samma prov kan användas för att mäta specifika NO-metaboliter, såsom nitrat, nitrit, S-nitrosotiolaler och järn-nitrosylkomplex. Dessutom kvantifieras NO som konsumeras av cellfritt hemoglobin också med kemiluminescensanalys. En illustration av alla dessa tekniker tillhandahålls.

NO-förbrukningen genom cellfri Hb-analys användes i prover innehållande kända koncentrationer av cellfri oxyHb (figur 4). Eftersom ett hem av oxyHb stökiometriskt frigör en NO-molekyl i analysen används renad cellfri oxyHb för att bygga kalibreringskurvan för analysen (kompletterande figur 3).
Dos-responsförhållandet mellan cellfritt Hb (mätt med en kolorimetrisk analys) och INGEN konsumtion hos patienter som kommer från kardiopulmone...

Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Här presenterar vi protokoll för att detektera kväveoxid och dess biologiskt relevanta derivat med hjälp av kemiluminescensbaserade analyser med hög känslighet.

Kemiluminescensbaserade analyser för detektion av kväveoxid och dess derivat från autoxidation och nitroserade föreningar

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Detta protokoll gör det möjligt för forskare att skickligt använda en kemiluminescensdetektor för mätning av kväveoxidmetaboliter utan vägledning eller kostnad för att anställa dedikerad personal på plats. Kemiluminescensbaserad analys är den mest känsliga metoden för att detektera minimala förändringar i nivåerna av kväveoxid och dess metaboliter i ett givet biologiskt prov. Inhalerad kväveoxid är en terapeutisk gas som används för en mängd olika sjukdomar.Det är avgörande att sjukdomsprogression och återhämtning är korrekt korrelerad med kväveoxidmetabolitnivåer. Inhalerad kväveoxid, ett antimikrobiellt medel, visar löfte vid behandling av patienter med luftvägsinfektionssjukdomar. Kemiluminiscensmetoden ger insikt i korrelerande kväveoxiddos och dess metaboliter med mikrobiologiska och patofysiologiska förändringar.För att bereda DETA-NONOate-lösningen, tillsätt 10 milligram DETA-NONOate till 610 mikroliter 10-millimolär natriumhydroxid i PBS med pH 7,4 för att generera 100 millimolar DETA-NONOate och hålla den på is. För att fortsätta, anslut syreledningen till kemiluminescensdetektorn och öppna syretanken vid ett tryck enligt tillverkarens instruktion i texten. Anslut sedan den dielektriska filterledningen med intensivt fält till kemiluminescensdetektorn.På kemiluminescensdetektorgränssnittet börjar du köra detektionsprogrammet för vätskefasanalyser, vilket säkerställer att syretillförseln är tillräcklig och detektorn startar provtagning, vilket indikerar detektion med signal i millivolt, annars uppmana en negativ diagnostisk signal. För att förbereda rensningskärlet, stäng rensningskärlet på alla tre portarna genom att skruva nålventilen helt åt höger och stänga inlopps- och utloppsstoppkranarna. Ta bort locket från rensningskärlet.Tillsätt en tillräcklig mängd av det reagens som är specifikt för den planerade analysen till reaktionskammaren så att sprutnålen som används för att injicera proverna kan nå vätskekolonnen samtidigt som närvaron av en stabil, önskad baslinje verifieras. För att starta reningsgasflödet, se till att den inerta bensintanken är utrustad med en tvåstegsregulator och anslut den inerta bensintanken med fartygets gasingränt. Öppna sedan utloppet på rensningskärlet och öppna gasen med ett utloppstryck vid regulatorn på ett till fem pund per kvadrattum.Öppna sedan rensningskärlets inlopp och öppna långsamt nålventilen på rensningskärlet för att tillåta inflöde av gas och verifiera bubbling i rensningskärlet. För att justera gasflödet, registrera celltrycket uppmätt av kemiluminescensdetektorn med den intensiva fältets dielektriska filterlinjeprovtagning av omgivande luft. Flytta locket på rensningskärlet och anslut den dielektriska filterledningen med intensivt fält till rensningskärlet.Använd nålventilen för att nå samma celltryck vid kemiluminescensdetektornivån som registreras i omgivande luft. För att starta kemiluminescenssignalförvärvsprogrammet, anslut den seriella porten på kemiluminiscensdetektorn till datorns seriella port i vilken förvärvsprogrammet har installerats. Kör sedan analysprogrammet.Klicka på Skaffa, välj sedan mappen för att spara datafilen, skriv in filnamnet och klicka på Spara. När du förbereder dig för provinjektion, justera spänningsskalan på skärmen för att ha kontroll över den riktade baslinjen genom att klicka på minimi- och / eller maximiknapparna och sedan ange önskat värde. För att utföra provinjektionen, skölj sprutan minst två gånger eller mer med avjoniserat och destillerat vatten innan du tar ut varje prov och se till att varje prov sprutas ut obehindrat på en uppgiftstorka.Sätt sedan in sprutan i provröret medan du håller både sprutan och röret på nära avstånd och dra upp kolven till önskad volym samtidigt som du säkerställer att ingen luftbubbla eller icke-homogeniserade fasta delar fångas. Rengör sprutans spets med en uppgiftstorkare och sätt in sprutan i seterlocket vid injektionsporten. Efter att ha verifierat att sprutans spets ligger inom vätskefasen, injicera provet i reaktionskammaren.För att markera injektionen i programmet, skriv provnamnet genom att klicka på den grå rutan under Provnamn och klicka sedan på Markera injektion medan du verifierar att injektionen orsakar en uppåtgående förändring i signalen eller nedåt i kväveoxidförbrukningen genom cellfri hemoglobinanalys. Dosresponsförhållandet mellan cellfritt hemoglobin och kväveoxidkonsumtion mättes genom kemiluminescens efter kardiopulmonell bypass. Det kan antas att det finns en hög koncentration av hemgrupper i den oxiderade statusen som rensar kväveoxid.Hos patienter som får kväveoxid under kardiopulmonell bypass reduceras istället majoriteten av hemgrupperna och konsumerar inte kväveoxid. Mätningar av cellfri hemoglobinkoncentration indikerade en långsam eliminering från plasma inom 12 timmar efter kardiopulmonell bypass. Kväveoxidförbrukningen toppade emellertid vid 15 minuter och återspeglade inte elimineringen av cellfritt hemoglobin.De linjära regressionskurvorna för kväveoxidförbrukning med cellfritt hemoglobin uppvisade en prevalens av oxiderat och kväveoxidkrävande hemoglobin vid 15 minuter, i motsats till mer reducerat hemoglobin vid baslinjen 4 timmar och 12 timmar efter kardiopulmonell bypass. Effekterna av kväveoxidgasadministrering på kväveoxidförbrukningen övervakades. När patienter behandlades med kväveoxidgas intra- och postoperativt var den observerade ökningen av fritt hemoglobin efter kardiopulmonell bypass inte kopplad till någon ökning av kväveoxidförbrukningen.Resultaten indikerade att exogent administrerad kväveoxid minskade det mesta av det fria hemoglobinet och förhindrade kväveoxidrensning. Experimentet är endast giltigt om alla villkor förblir desamma. Om vätskenivåns höjd överstiger reaktionskolonnen måste vi stanna och genomföra en ny kalibrering.

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Upptäckt och Genogrouping av norovirus från Barnens Pallar Genom Taqman Ett steg RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion och Detektering av reaktiva syreradikaler (ROS) i cancer

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Analytiska tekniker för analys av kväveoxid Bioaktivitet

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminiscens Imaging (CLI) för cancerbehandling övervakning

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

5/6th Nefrektomi i kombination med hög salthalt kost och kväveoxidsyntas Inhibition att inducera kronisk njursjukdom i Lewis Rat

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Polyakrylamidgeler för Invadopodia och Traction Force Analyser på cancerceller

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

Djärvhet, aggression och shoaling Analyser för Zebrafish beteendesyndrom

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Syntes, karakterisering och tillämpning av superparamagnetiska järnoxid nanosonder för extrapulmonary tuberkulos Upptäckt

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Trombocyt-baserad detektion av kväveoxid i blodet genom att mäta VASP fosforylering

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Ett nytt inhalationsmasksystem för att leverera höga koncentrationer av kväveoxidgas hos spontant andande ämnen

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...