Name: chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Bu makalede bildirilen protokoller, Dr. Warren Zapol'un Massachusetts Genel Hastanesi Anestezi Bölümü Kritik Bakımda Anestezi Araştırma Laboratuvarı'nın önceki bursiyerlerinin birikmiş katkılarıyla mümkün olmuştur. Dr. Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli ve Emanuele Rezoagli'nin katkılarını takdir ediyoruz.

Bu protokolde belirtilen prosedürler Massachusetts Genel Hastanesi inceleme kuruluna uygundur. Kullanılan kan örnekleri önceki bir çalışma sırasında toplanmıştı ve mevcut amaç için tanımlanmamıştı18.
NOT: Boşaltma kabını, yıkamayı ve genel bakımı oluşturan boru ve cam eşyalar arasındaki optimum bağlantılarla ilgili özel rehberlik için üreticinin talimatlarına bakın. Cam eşyalara zarar vermemek için bağlantıların sağlam ve dikkatl...

Yüksek hassasiyet nedeniyle, NO ve ilgili bileşiklerin belirlenmesi için kemilüminesans bazlı testler yüksekNO2 kontaminasyon riskine sahiptir. Deneyde kullanılan her reaktif (özellikle NO 2- bloke edici çözelti) ve seyreltici (ddH 2 O dahil), arka plan sinyalini düzeltmek için NO2- içeriği açısından test edilmelidir. Nitrit, tam kanda yaklaşık 10 dakika yarı ömürlü bir yarı ömür ile son derece reaktiftir ve hızla...

Salvador Moncada ve Nobel ödüllü Robert Furchgott, Louis Ignarro ve Ferid Murad, nitrik oksidi (NO) daha önce bilinen endotel kaynaklı gevşeme faktörü (EDRF) olarak tanımladıklarından beri, NO'nun merkezi rolü vasküler biyoloji, nörobilimler, metabolizma ve konakçı yanıtı boyunca uzanan birkaç anahtar mekanizmada kurulmuştur 1,2,3,4,5,6,7 . NO gazının eksojen olarak uygulanması, yenidoğanda pulmoner hipertansiyona bağlı solunum yetmezliği için yerleşik bir tedavi haline gelmiştir8. Nitrik oksit gazı ayrıca solunum sinsityal virüs (RSV) enfeksiyonu, sıtma ve diğer enfektif hastalıkların, iskemi-reperfüzyon hasarının tedavisinde ve kalp cerrahisi geçiren hastalarda akut böbrek hasarının önlenmesinde araştırılmıştır 9,10,11,12. NO'nun seviyelerini, metabolitlerini ve hedef protein ve bileşiklerinin seviyelerini değerlendirmek için hassas ölçüm tekniklerine duyulan ihtiyaç, hem mekanik hem de girişimsel çalışmalardan kaynaklanmaktadır.
Yüksek reaktivitesi nedeniyle, NO, üretildiği ve / veya salındığı biyolojik matrise bağlı olarak farklı reaksiyonlara maruz kalabilir. Hemoglobin (Hb) veya diğer oksi-hemoproteinlerin yokluğunda, NO neredeyse tamamen nitrite (NO2-) oksitlenir.
2NO + O 2 → 2NO2
NO 2 + NO → N2O3
N 2 O3 + H 2 O →NO2- + H+
NO, azot dioksit(NO 2) üretmek için önce moleküler oksijen (O2) ile otoksidasyona tabi tutulur ve diazot trioksit (N 2O3) üretmek için NO2'ninkendisi ile reaksiyona girer. N2O3'ün bir molekülü, iki NO 2- molekülü ve bir proton (H +) 13 oluşturmak için su (H2O) ile reaksiyona girer. Tam kan14,15 içinde, NO ve NO 2- hızla nitrata (NO 3-) dönüştürülür, çünkü bu moleküller Hb'nin oksitlenmiş heme grupları [Hb-Fe2 + -O 2 veya oksihemoglobin (oksiHb)] ile NO3- vermek için hevesle reaksiyona girer. Bu reaksiyon, heme grubunun ferrik duruma [Hb-Fe3+ veya methemoglobin (metHb)] geçişi ile birleştirilir:
Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ NO3-
Kırmızı kan hücresi (RBC) bariyeri ve endotelin hemen bitişiğindeki boşluk, bu reaksiyonu sınırlayan ve endotel tarafından salınan NO'nun küçük bir kısmının EDRF16,17 olarak hareket etmesine izin veren ana faktörlerdir. Aslında, dolaşımdaki hücresiz Hb'nin deneysel ve klinik ortamlarda vazodilatasyonu bozduğu bilinmektedir17,18. RBC içinde, oksijenasyona ve NO 2- konsantrasyonuna bağlı olarak, NO'nun bir kısmı demir-nitrosil Hb (Hb-Fe 2 +-NO veya HbNO) oluşturmak için deoksihemoglobin (Hb-Fe 2 +) ile reaksiyona girer:
Hb-Fe2 + + NO → Hb-Fe2+-NO
RBC15,17'de, NO 2- Hb-Fe 2+'yı azaltarak Hb-Fe 2+'yı oluşturabilir ve bu da NO'nun salınımına yol açar ve bu da Hb-Fe2+-O2 (tercihen) veya Hb-Fe 2+'yı bağlar.
NO-türevlerinin üretimi kesinlikle tek yönlü olarak kabul edilmemelidir, çünkü NO, çeşitli dokularda ve farklı enzimlerde (örneğin, bağırsak bakterileri veya mitokondri içinde, özellikle hipoksik koşullar altında) NO-2- ve NO 3'ten rejenere edilebilir19,20.
Üretilen (veya uygulanan) değişken miktarda NO, esas olarak bir NO+ donör ara maddesi (Nuc-NO+-NO 2-) oluşturan bir nükleofil varlığındaN2O3'ten tiol transnitrozasyonu ile S-nitrosothiollerin aşağı akış üretimine yol açar:
N 2 O3 + RS- → RS-NO + NO2-
S-nitrosothiols üretimi için bir başka olasılık, oksitlenmiş tiollerin nitrosilasyonudur (oksitlenmiş bir tiol ile reaksiyona giren NO):
RS• + NO → RS-NO
Bu mekanizma ve NO2 ile doğrudan tiol oksidasyonu, yalnızca başka bir yerde21'de açıklanan çok özel koşullarda mümkün olabilir. S-nitrosothioller, S-nitrosoglutathione gibi hafif moleküllerden büyük tiol içeren proteinlere kadar uzanır. S-nitrosohemoglobin (S-NO-Hb), β zincirinde (β93C)22 korunmuş bir sistein kalıntısının bir tiol grubunun nitrozasyonu ile oluşur.
S-nitrosothiollerin üretimi ve metabolizması önemli düzenleyici mekanizmaların bir parçasıdır. Örnekler arasında glutatyon, kaspazlar, N-metil-D-Aspartat (NMDA) ve ryanodin reseptörlerinin23,24,25,26,27,28 regülasyonu sayılabilir. Daha önce in vivo olarak NO biyolojisinin önemli bir aracısı olarak kabul edilen nitrosated albümin (S-nitroso-albumin), herhangi bir spesifik ek biyolojik aktivite içermeyen bir NO / NO + taşıyıcısı gibi görünmektedir29.
NO konsantrasyonunu ve türevlerini biyolojik bir matris içindeki belirli bir biyolojik numuneden ölçerken, asitlik, oksijenasyon, sıcaklık ve reaktiflerin varlığı gibi özellikleri dikkate almak önemlidir. Örnekler arasında uygulanan eksojen NO donörleri ve akut inflamasyon durumunda, NO2ile reaksiyona giren hidrojen peroksit (H2 O2), peroksinitrit (ONOO-)21 gibi serbest radikallerin olağanüstü konsantrasyonunun oluşmasına yol açar. Kullanılan analitik yönteme ek olarak, numune hazırlama ve depolamanın analitik öncesi aşaması da esastır. İn vivo NO aktivitesini temsil etmeyen aşağı akış reaksiyonları tahmin edilmeli, dikkate alınmalı ve bloke edilmelidir. Geçerli bir örnek, ölçüm22 için hedeflendiğinde kan örneklerinin özel bir tedavisini gerektiren S-NO-Hb'nin dengesizliğidir.
Kemilüminesans bazlı testler, doku homojenatları30,31 dahil olmak üzere herhangi bir biyolojik sıvıdaki NO ve ana metabolitlerinin [NO2-, NO3-, S-NO ve demir-nitrosil kompleksleri (Fe-NO)] seviyelerini tespit etmek için altın standarttır. Bu yöntemler, NO'nun ozon (O3) ile reaksiyonunu barındıran ve uyarılmış bir durumda (NO2 •) NO2 üreten bir cihaz olan kemilüminesans dedektörüne (CLD) dayanır. NO2• gevşemesi, bir fotoçarpan tüpü tarafından algılanan bir ışık fotonunun emisyonuna neden olur ve örneklenen gaz karışımının NO içeriği ile doğru orantılı bir elektrik sinyali üretir32. CLD'nin basitleştirilmiş bir şeması temsil edilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig01.jpg"> Şekil 1: Nitrik oksit gazı için bir kemilüminesans dedektörünün basitleştirilmiş şeması. Nitrik oksidin (NO) kemilüminesans temelli tespiti, kemilüminesans dedektöründe (CLD) tanıtılan NO gaz molekülü başına bir fotonun stokiyometrik üretimidir. Kemilüminesans reaksiyonu, harici bir pompa ile bağlanarak negatif basınçta tutulan ve numune gazının sürekli ve sabit girişine izin veren dahili bir jeneratörden ozon (O3) ile beslenen belirlenmiş bir odada elde edilir. O3 üretimi, CLD ile bağlantılı özel bir O2 tankı tarafından sağlanan diyatomik oksijen (O2) gerektirir (diğer üreticiler ortam havasıyla çalışan CLD'ler sağlar). Reaksiyon odasında, örneklenen gazda bulunan her bir NO gazı molekülü, aktif durumda (NO2*) bir azot dioksit molekülü üretmek için oksijenle reaksiyona girer. Zemin durumuna geri dönerek, her NO2 * molekülü, reaksiyon odasına bitişik bulunan bir fotoçarpan tüpü (PMT) tarafından tespit edilen bir foton yayar. İlgili amplifikatör ve merkezi işlem ünitesi ile PMT, foton sayısı ve reaksiyon odasındaki NO moleküllerinin sayısı ile orantılı bir sinyal üretir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
CLD'nin numune girişi, sıvı numuneler için bir reaksiyon odası içeren bir cam eşya sistemine bağlanabilir. Sistem azot, helyum veya argon gibi inert bir gazla sürekli olarak temizlenir ve NO'yu reaksiyon odasından CLD'ye aktarır.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig02.jpg"> Şekil 2: Nitrik oksit gazının kemilüminesans bazlı tespiti için bir tahliye kabının yapısı Temizleme kabı (sağda), nitrik oksit (NO) gazının veya bir sıvı faz reaktifinden salındığında kolayca NO gazına dönüştürülebilen başka bir bileşiğin algılanmasına izin verir. İnert gaz girişi, Argon, Xeon veya diyatomik azot (N2) gibi inert bir gazın kaynağına (tankına) bağlanır. İğne valfi (sola açılır) boşaltma kabı içindeki basınç kontrolü için kullanılır ve kabı temizlemek için tamamen çıkarılabilir. Enjeksiyon portu, numune enjeksiyonu için membran septumlu bir kapakla kaplanmıştır. Membran sık sık değiştirilmelidir. Isıtmalı bir ceket reaksiyon odasını çevreler ve HCl testinde VCl3'ü gerçekleştirmek için bir sıcak su banyosuna bağlanır. Temizleme kabı çıkışı, kemilüminesans dedektörüne (CLD) veya NaOH tuzağına (HCl tahlillerinde VCl3 için gereklidir) bağlanır. Reaksiyon odası içeriğini boşaltmak için, önce inert gaz girişindeki ve boşaltma kabı çıkışındaki stopcock'ları kapatın, iğne valfini kapatın, enjeksiyon portundaki kapağı çıkarın ve son olarak tahliyede stopcock'u açın. HCl'nin aşındırıcılığı nedeniyle HCl tahlilindeki VCl3 gerçekleştirilirse, NaOH tuzağının (solda) temizleme kabı ile CLD arasına satır içi olarak yerleştirilmesi gerekir. CLD'ye bağlantı her zaman CLD ile boşaltma kabının çıkışı (veya kullanılıyorsa NaOH tuzağı) arasına yerleştirilecek yoğun alan dielektrik (IFD) filtresini gerektirir. IFD filtresi havadaki partikülleri uzaklaştırır ve sıvının tahliye kabından geçmesini durdurur. PTFE = politetrafloroetilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Sonuç olarak, spesifik ve kontrollü bir kimyasal reaksiyon yoluyla NO'ya dönüştürülebilen herhangi bir bileşik, herhangi bir biyolojik sıvı ve doku homojenatında yüksek hassasiyetle tespit edilebilir24. Kemilüminesans yoluyla gaz fazı NO'nun doğrudan ölçümü hem deneysel hem de klinik ortamlarda gerçekleştirilir. Bu teknikler başka yerlerde kapsamlı bir şekilde tanımlanmıştır33,34,35. NO2-, S-nitrosothiols, S-nitrosated proteinler ve Fe-NO'ların ölçümü, tüm bu bileşiklerden stokiyometrik olarak NO gazını serbest bırakan triiyodür (I3-) ile bir reaksiyon karışımında numuneler eklenerek gerçekleştirilebilir:
I3- → I2 + I-
2NO 2− +2I− +4H+ → 2NO + I 2 +2H 2 O
I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+
2NO+ + 2I− → 2NO + I2
Ben3- NO 3-15 ile reaksiyona girmezken. Her bileşiğin hassas ölçümleri, numune alikotlarının merkürik klorürlü veya merkürik klorürsüz (HgCl2) asitlenmiş sülfanilamid (AS) ile ön işlemden geçirilmesiyle mümkün olur. Özellikle, AS ile ön işlem tüm NO2- içeriğini kaldırır. Sonuç olarak, CLD tarafından ölçülen NO içeriği yalnızca S-NO'ların ve Fe-NO'ların konsantrasyonunun toplamını yansıtır. AS enjeksiyonundan önce bir numune aliquot'a HgCl2'nin enjekte edilmesi, NO2- nin S-NO tarafından salınmasına neden olur. AS ile tedavi (NO2- çıkarılmasına yol açar), ölçülen NO içeriğinin sadece Fe-NO'ların konsantrasyonunu yansıtmasını sağlar. Değerlendirmeler arasındaki bir dizi çıkarma, üç NO türevinin kesin konsantrasyonunu hesaplamaya izin verir22.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig03.jpg"> Şekil 3: Asetik asit kemilüminesans testinde I3- için numune hazırlama adımları. Asetik asit kemilüminesans testinde I3- hazırlanması için sıralı adımlar gösterilmiştir. Işık korumalı santrifüj tüplerinin kullanılması gereklidir. Tüp 1, 2 ve 3, tahlili hazırlamak için kullanılanlardır. Nitrat (NO3-) ölçümü gerekiyorsa, HCl testinde VCl3 için başka bir örnek aliquot (tüp 4) gereklidir. Adımlar kırmızı renkli sayılarla gösterilir. Numune hacmini eklemeden önce fosfat tampon salin (PBS) veya HgCl2 ile belirtildiği gibi önceden doldurma (Adım 1). Numune hacmini (2) belirtildiği gibi ekleyin, girdap yapın ve oda sıcaklığında (RT) 2 dakika kuluçkaya yatırın. (3) PBS veya asitlenmiş sülfanilamid (AS) belirtildiği gibi, vorteks ekleyin ve RT'de 3 dakika boyunca inkübe edin. Tahlil ile ölçülen konsantrasyon, her tüp altında bildirilen bileşiklerin konsantrasyonunun toplamıdır. 1 numaralı tüp, nitrit (NO2-), S-nitrosothiols (S-NO) ve demir-nitrosil komplekslerinin (Fe-NO'lar) tek bir sinyal olarak ölçülmesine izin verecektir. Nitrat (NO 3-) ölçümü için, numuneler hem asetik asitte I 3- hem de HCl tahlillerinde VCl 3 ile çalıştırılmalı ve tüp 1'den elde edilen değer, tüp 4'ten elde edilenden çıkarılmalıdır. *Kalıntı NO2-, S-nitrosohemoglobin ve demir-nitrosil-hemoglobinin belirlenmesi için Hb analizi için kullanılması önerilen miktarlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
NO 3- ölçümü için, hidroklorik asit (HCl) içindeki Vanadyum (III) klorür (VCl3), CLD ile NO 3- stokiyometrik olarak NO 3- ölçümü için temizleme kabında NO- 3- 'ye dönüştürülmesi için kullanılır:
2 NO 3-+ 3V +3 + 2H 2 O →2NO+ 3VO2+ + 4H+
Yeterince hızlı bir dönüşüm elde etmek için, reaksiyonun 90-95 ° C'de yapılması gerekir. NO3'ten NO 2'ye indirgeme, HCl tarafından NO2'nin NO'ya indirgenmesi ile birleştirilir. Vanadyum metali ayrıca NO moiety22,36'larını serbest bırakan S-NO'ları azaltır. CLD tarafından HCl'de VCl 3 ile elde edilen nihai konsantrasyon, NO3-, NO2 ve diğer nitroslu bileşiklerin toplam konsantrasyonunu yansıtır. İkinci değerin I 3- ile CLD ile verilen konsantrasyondan çıkarılması, NO 3- konsantrasyon 36,37'nin hesaplanmasına izin verir (Şekil 3).
NO tüketim tahlilinde, (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-amonyoetil)amino]diazen-1-ium-1,2-diyol (DETA-NONOate) gibi NO donörleri tarafından temizleme kabında NO'nun sürekli salınması, enjekte edilen numunelerde hücresiz oksiHb'nin ölçülmesine izin veren kararlı bir sinyal üretir. Temizleme kabında tüketilen NO miktarı, numunedeki oksiHb miktarı ile stokiyometrik bir ilişki içindedir38.
Plazma örneklerinde NO2-, NO3-, S-nitrosothiols, demir-nitrosil kompleksleri ve hücresiz Hb ile NO tüketiminin ölçümü için protokoller gösterilmiştir. RBC ortamında NO ile ilgili çalışmalar, toplam Hb konsantrasyonu 15,22'nin belirlenmesi ile birlikte son derece kırılgan S-NO-Hb ve Hb-NO'yu ölçmek için dışlama kromatografisi ile birlikte spesifik numune muamelesi ve ardından dışlama kromatografisi gerektirir. Numune hazırlama, ölçümün düzeltilmesinde etkilidir. Tahlil sırasındaH2 O'da NO 2'ninönceden varlığı ve NO 2'nin salınması, S-NO-Hb 14,39 gibi yapay olarak daha yüksek konsantrasyonlarda NO türevlerinin ölçülmesine yol açabilir. Numune hazırlamanın önemli yönleri de sunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45754</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam B Emulsion</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5757</td>
			<td>250 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA NONOate</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>82120</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroochloric Acid 37% (1 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td>500 mL - liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>SAFC</td>
			<td>207772</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercury (II) Chloride ACS reagent&#62; 99.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>215465</td>
			<td>100 g - solid (dissolve in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 705 RN 50 &#956;L syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80530</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 802 N 25 &#956;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>84854</td>
			<td>Microliter syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethylmaleimide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4260</td>
			<td>25 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel</td>
			<td>Zysense</td>
			<td>NOA 280i</td>
			<td>Chemiluminescence Detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet p-40&#160; (NP-40)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85125</td>
			<td>10% - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent&#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>244023</td>
			<td>100 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Iodide ACS reagent&#62; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221945</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>105067</td>
			<td>250 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen 125</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Mechanic Homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RV3 Two Stage Rotary Vane Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65201906</td>
			<td>Vacuum Pump - Bundled with analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparin - BD Hemogard Clo</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD367871</td>
			<td>75 USP Units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent &#8805; 97%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>795429</td>
			<td>1 kg - pelletts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrate ACS reagent &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221341</td>
			<td>500 g - powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite &#8805; 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2252</td>
			<td>500 g - crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfanilamide &#8805; 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9251</td>
			<td>100 g - solid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanadium (III) Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>112393</td>
			<td>25 g - solid - Caution (exothermic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 1 Filter Paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemiluminescence-based assays for detection of nitric oxide and its derivatives from autoxidation and nitrosated compounds

İn vivo nitrik oksit (NO) aktivitesi, doğrudan etkilerinin, NO otoksidasyonundan üretilen türevlerinin etkisinin ve nitroslu bileşiklerin etkilerinin birleşik sonuçlarıdır. NO metabolitlerinin ölçülmesi, hem vasküler seviyelerde hem de diğer dokularda, özellikle de eksojen NO'nun uygulandığı deneysel ortamlarda NO aktivitesini incelemek için gereklidir. Ozon bazlı kemilüminesans testleri, hem sıvılarda (plazma, doku homojenatları, hücre kültürleri dahil) hem de gaz karışımlarında (örneğin, ekshale edilen nefes) NO ve NO metabolitlerinin hassas ölçümlerine izin verir. NO, uyarılmış bir durumda azot dioksit üretmek için ozon ile reaksiyona girer. Sonuçta ortaya çıkan ışık emisyonu, fotoalgılamaya ve numunenin NO içeriğini yansıtan bir elektrik sinyalinin üretilmesine izin verir. Aynı numuneden elde edilen alikotlar, nitrat, nitrit, S-nitrosotioller ve demir-nitrosil kompleksleri gibi spesifik NO metabolitlerini ölçmek için kullanılabilir. Ek olarak, hücresiz hemoglobin tarafından tüketilen NO, kemilüminesans analizi ile de ölçülür. Tüm bu tekniklerin bir örneği verilmiştir.

Hücresiz Hb testi ile NO-tüketimi, bilinen hücresiz oksiHb konsantrasyonlarını içeren örneklerde kullanılmıştır (Şekil 4). Bir oksiHb hemi stokiyometrik olarak tahlilde bir NO molekülünü serbest bıraktığından, tahlil için kalibrasyon eğrisini oluşturmak için saflaştırılmış hücresiz oksiHb kullanılır (Ek Şekil 3).
Kalp cerrahisi sırasında kardiyopulmoner bypass'tan (KPB) çıkan hastalarda hücresiz Hb (kolorimetri...

Watch this Scientific Journal Video about Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds at JoVE.com

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Burada, nitrik oksit ve biyolojik olarak ilgili türevlerini, yüksek hassasiyete sahip kemilüminesans bazlı testler kullanarak tespit etmek için protokoller sunuyoruz.

Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Bu protokol, araştırmacıların nitrik oksit metabolitlerinin ölçümü için sahada özel personel istihdam etme rehberliği veya masrafı olmadan bir kemilüminesans dedektörünü yetkin bir şekilde kullanmalarını sağlar. Kemilüminesans bazlı tahlil, herhangi bir biyolojik numunedeki nitrik oksit ve metabolitlerindeki minimum değişiklikleri tespit etmek için en hassas yöntemdir. Solunan nitrik oksit, çok çeşitli hastalıklar için kullanılan terapötik bir gazdır.Hastalığın ilerlemesi ve iyileşmesinin nitrik oksit metabolit seviyeleri ile doğru bir şekilde ilişkili olması çok önemlidir. Bir antimikrobiyal olan inhale nitrik oksit, hava yolu bulaşıcı hastalıkları olan hastaların tedavisinde umut vaat etmektedir. Kemilüminesans yöntemi, nitrik oksit dozunun ve metabolitlerinin mikrobiyolojik ve patofizyolojik değişikliklerle ilişkilendirilmesi konusunda fikir vermektedir.DETA-NONOate çözeltisini hazırlamak için, 100 milimolar DETA-NONOate üretmek ve buz üzerinde tutmak için pH 7.4 PBS'de 610 mikrolitre 10 milimolar sodyum hidroksite 10 miligram DETA-NONOat ekleyin. Devam etmek için, oksijen hattını kemilüminesans dedektörüne bağlayın ve oksijen tankını, metinde verilen üreticinin talimatına göre bir basınçta açın. Ardından, yoğun alan dielektrik filtre hattını kemilüminesans dedektörüne bağlayın.Kemilüminesans dedektörü arayüzünde, sıvı faz analizleri için algılama programını çalıştırmaya başlayın, oksijen beslemesinin yeterli olduğundan ve dedektörün milivolt cinsinden sinyalle algılamayı gösteren örneklemeye başlayacağından emin olun, aksi takdirde negatif bir teşhis sinyali isteyin. Temizleme kabını hazırlamak için, iğne valfini sağa tamamen vidalayarak ve giriş ve çıkış durdurma musluklarını kapatarak üç bağlantı noktasındaki temizleme kabını kapatın. Kapağı temizleme kabından çıkarın.Reaksiyon odasına planlanan tahlile özgü yeterli miktarda reaktif ekleyin, böylece numuneleri enjekte etmek için kullanılan şırınga iğnesi, kararlı, istenen bir taban çizgisinin varlığını doğrularken sıvı kolonuna ulaşabilir. Tahliye gazı akışını başlatmak için, inert gaz tankının iki aşamalı bir regülatör ile donatıldığından emin olun ve inert gaz tankını geminin gaz girişine bağlayın. Ardından, boşaltma kabının çıkışını açın ve gazı, inç kare başına bir ila beş poundluk regülatörde bir çıkış basıncı ile açın.Ardından, boşaltma kabının girişini açın ve gaz girişine izin vermek ve boşaltma kabı içindeki köpürmeyi doğrulamak için boşaltma kabının iğne valfini yavaşça açın. Gaz akışını ayarlamak için, kemilüminesans dedektörü tarafından ölçülen hücre basıncını, ortam havasını örnekleyen yoğun alan dielektrik filtre hattı ile kaydedin. Kapağı boşaltma kabı üzerinde yeniden konumlandırın ve yoğun alan dielektrik filtre hattını boşaltma kabına bağlayın.Ortam havasında kaydedilen kemilüminesans dedektörü seviyesinde aynı hücre basıncına ulaşmak için iğne valfini kullanın. Kemilüminesans sinyali alma programını başlatmak için, kemilüminesans dedektörünün seri portunu, alım programının yüklendiği bilgisayarın seri portuna bağlayın. Ardından, çözümleme programını çalıştırın.Al'a tıklayın, ardından veri dosyasını kaydetmek için klasörü seçin, dosya adını yazın ve Kaydet'e tıklayın. Numune enjeksiyonuna hazırlanırken, minimum ve/veya maksimum düğmelerine tıklayarak ve ardından istenen değeri girerek ekrandaki voltaj ölçeğini hedeflenen taban çizgisi üzerinde kontrol sahibi olacak şekilde ayarlayın. Numune enjeksiyonunu gerçekleştirmek için, her numuneyi çekmeden önce şırıngayı en az iki kez veya daha fazla kez deiyonize ve damıtılmış suyla durulayın ve bir görev silme işleminde engelsiz bir su tahliyesi sağlayın.Ardından, hem şırıngayı hem de tüpü yakın bir mesafede tutarken şırıngayı numune tüpüne yerleştirin ve hava kabarcığı veya homojenize edilmemiş katı parçaların sıkışmamasını sağlarken pistonu istenen hacme çekin. Şırınganın ucunu bir görev sileceği ile temizleyin ve şırıngayı enjeksiyon portundaki ayarlayıcı kapağına yerleştirin. Şırınganın ucunun sıvı fazda olduğunu doğruladıktan sonra, numuneyi reaksiyon odasına enjekte edin.Yazılım programında enjeksiyonu işaretlemek için, Örnek Adları'nın altındaki gri kutuya tıklayarak numune adını yazın, ardından enjeksiyonun sinyalde yukarı doğru bir değişikliğe veya hücresiz hemoglobin testi ile nitrik oksit tüketiminde aşağı doğru bir değişikliğe neden olduğunu doğrularken Enjeksiyonu İşaretle'ye tıklayın. Hücresiz hemoglobin ve nitrik oksit tüketimi arasındaki doz yanıtı ilişkisi, kardiyopulmoner bypass sonrası kemilüminesans ile ölçüldü. Nitrik oksit temizleyen oksitlenmiş durumda yüksek konsantrasyonda heme grupları olduğu varsayılabilir.Kardiyopulmoner bypass sırasında nitrik oksit alan hastalarda, bunun yerine, heme gruplarının çoğunluğu azalır ve nitrik oksit tüketmez. Hücresiz hemoglobin konsantrasyonunun ölçümleri, kardiyopulmoner bypasstan sonraki 12 saat içinde plazmadan yavaş bir eliminasyon olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, nitrik oksit tüketimi 15 dakikada zirveye ulaştı ve hücresiz hemoglobinin eliminasyonunu yansıtmadı.Hücresiz hemoglobin tarafından nitrik oksit tüketiminin doğrusal regresyon eğrileri, kardiyopulmoner bypass sonrası 4 saat ve 12 saat sonra başlangıçta daha azalmış hemoglobinin aksine, 15 dakikada oksitlenmiş ve nitrik oksit tüketen hemoglobin prevalansı sergiledi. Nitrik oksit gazı uygulamasının nitrik oksit tüketimi üzerindeki etkileri izlendi. Hastalar ameliyat sırasında ve sonrasında nitrik oksit gazı ile tedavi edildiğinde, kardiyopulmoner bypass sonrası gözlenen serbest hemoglobin artışı, nitrik oksit tüketimindeki herhangi bir artışla birleştirilmemiştir.Sonuçlar, eksojen olarak uygulanan nitrik oksidin serbest hemoglobinin çoğunu azalttığını ve nitrik oksit temizlemeyi önlediğini göstermiştir. Deneme, yalnızca tüm koşullar aynı kalırsa geçerlidir. Sıvı seviyesinin yüksekliği reaksiyon kolonunu aşarsa, durmalı ve yeni bir kalibrasyon yapmalıyız.

Research

JoVE Journal

Medicine

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Taqman By Çocuk Tabureler gelen Noroviruses tespiti ve Genogrouping Tek aşamalı RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Kanserler Üretim ve reaktif oksijen türlerinin (ROS Algılama)

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Kanser Tedavisi İzleme Cerenkov Lüminesans Görüntüleme (CLI)

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

5/6th Nephrectomy in Combination with High Salt Diet and Nitric Oxide Synthase Inhibition to Induce Chronic Kidney Disease in the Lewis Rat

Yüksek Tuz Diyet ve Lewis Rat Kronik Böbrek Hastalığı tetikleyebilecek Nitrik Oksit Sentaz inhibisyonu ile bağlantılı 5/6th nefrektomi

Chronic kidney disease (CKD) is a global problem. Slowing CKD progression is a major health priority. Since CKD is characterized by complex derangements ...

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Kanser Hücreleri üzerindeki Invadopodia ve Çekiş Gücü Tahliller için poliakrilamid jeller

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

Zebra balığı Davranış Sendromlardaki için cesaret, Saldırganlık ve shoaling Tahliller

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

Ekstrapulmoner Tüberküloz Tespiti için Süperparamanyetik Demir Oksit Nanoprobukların Sentezi, Karakterizasyonu ve Uygulanması

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Nitrik oksit VASP fosforilasyon ölçme tarafından kan trombosit tabanlı algılama

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

A Novel Inhalation Mask System to Deliver High Concentrations of Nitric Oxide Gas in Spontaneously Breathing Subjects

Kendiliğinden Solunan Deneklerde Yüksek Konsantrasyonlarda Nitrik Oksit Gazı Sağlamak için Yeni Bir Soluma Maske Sistemi

Nitric Oxide (NO) is administered as gas for inhalation to induce selective pulmonary vasodilation. It is a safe therapy, with few potential risks even if ...