Name: measuring photophysiology of attached stage of colacium sp. by a cuvette-type fast repetition rate fluorometer
Uploaded: 2021-11-12T13:00:00
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这项工作得到了滋贺县合作研究基金的支持，该基金在日本振兴地区补助金和日本环境省环境研究与技术发展基金（第5-1607号）下，题为“保护水环境健全性的水质和湖底环境研究”。https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html。作者要感谢Enago（www.enago.jp）的英语评论。

1. 抽样
<ol><li>通过水桶从水面收集湖水。为了靶向附着在S. mucronata（图1A-C）上的Colacium sp.使用100μm尼龙网过滤0.5-10 L的湖水52。 注意： S. mucronata 通常密集聚集在浅层，富营养化，浑浊的水中，例如芦苇（芦苇）区域。</li>
	<li>将浓缩样品储存在500 mL塑料瓶中，加入350 mL湖水。存放在黑暗条件下。</li>
	<li>在?...

该协议首次证明，在自然环境中附着阶段，Colacium sp.的光生理学与其在AF-6介质中的浮游阶段相当。此外，当密度为≤5 inds·mL−1时，饥饿的S. mucronata的肠道内容物不影响基线和Chl-a荧光（图5和图6）。这些结果表明，该协议可以在低底物生物丰度下测量附着阶段Colacium sp.的光生理学，而无需校正。然而，步骤3.2.1-3.2.8?...

叶绿素可变荧光是测量藻类光系统II（PSII）光生理学的有用工具。藻类通过改变其PSII光生理学来应对各种环境压力，例如过量的光照和营养缺乏。快速重复率荧光计 （FRRf） 是测量 PSII 光生理学1，2 和估算初级生产力1，3，4 的常用方法，能够监测浮游植物 PSII 光生理学以及跨宽空间和时间尺度的初级生产力5，6，7。FRRf可以同时测量PSII（σ PSII）吸收截面，反应中心（[RCII]）浓度，最大光化学效率（Fv / Fm），有效光化学效率（Fq'/Fm'）和非光化学淬灭（NPQNSV）（表1）。通常，Fv/Fm 和 Fq′/Fm′ 被定义为 PSII 活性 8，而 NPQNSV 被定义为相对散热能量9。
重要的是，FRRf的单周转（ST）闪光完全降低了初级醌电子受体QA，但不会降低塑性醌池。相反，脉冲幅度调制（PAM）荧光计的多次周转（MT）闪光可以减少两者。与MT方法相比，ST方法具有明显的优势，通过同时测量Fv / Fm，Fq′/ Fm'，NPQNSV和σ PSII10的恢复动力学来识别NPQNSV的可能起源。迄今为止，已有几种类型的FRRf仪器，如潜水式、比色皿式和流通型。潜水式 FRRf 可在海洋和湖泊中进行原位测量，而比色皿型 FRRf 适用于测量小样品量。流通型通常用于连续测量地表水中浮游植物的光生理学。
鉴于 PAM 荧光计（包括比色皿型）的发展，适用于广泛的受试者11，PAM 荧光计在藻类光生理学研究中仍然比 FRRf 更常见12。例如，尽管这些工具之间的样品室结构和比色皿容量仅略有不同，但比色皿型PAM已应用于浮游植物13，14，15，底栖微藻16，17，18，冰藻19和生化藻类20，而比色皿型FRRf主要应用于浮游植物21，22，23 和有限数量的冰藻群落24，25。鉴于其有效性，比色皿型FRRf同样适用于底栖和表生藻类。因此，扩展其应用将为PSII光生理学提供相当多的见解，特别是对于鲜为人知的生代藻类光生理学。
生代藻类很少受到关注，很少有研究检查它们的PSII光生理学20，26，很可能是因为它们在水生食物网中的作用很小27，28。然而，包括表生性藻类在内的表生元可以对浮游动物群落动态产生积极影响，例如增加繁殖和存活率29，30，以及对过程产生负面影响，例如增加下沉率29，31 和对视觉捕食者的脆弱性32，33，34，35，36.因此，探索控制浮游动物群落中表观生物动力学的环境和生物学因素至关重要。
在生代藻类中，Colacium Ehrenberg 1834（Euglenophyta）是一种常见的淡水藻类群32，37，38，39，具有不同的生命阶段，包括附着（图1A-D），非运动浮游（图1E，F）和运动浮游阶段40，41.在非运动浮游阶段，细胞以单细胞浮游生物，聚集菌落或单层片状菌落的形式存在，被粘液覆盖42。在附着阶段，Colacium sp.使用从细胞前端排泄的粘液37，39，41附着在底物生物（碱性）上，特别是微甲壳类41，43。它们的生命周期还包括从蜕皮的外骨骼或死亡的基底骨骼中分离出来，并与鞭毛一起游泳以找到另一种底物生物体39。浮游和附着阶段都可以通过有丝分裂40增加其种群规模。虽然它们的附着阶段被假设为收集资源的进化特征，如light44和微量元素41，45，46，或作为分散策略27，但关于这些方面的实验证据很少37，41，44，关键附着机制在很大程度上是未知的。例如，Rosowski和Kugrens预计Colacium从基质桡足类41中获得锰（Mn），集中在外骨骼47中。
在这里，我们描述了如何使用比色皿型FRRf测量浮游藻类的PSII光生理学以及用Colacium sp.细胞靶向附着藻类（附着在浮游动物身上）的相关应用方法。我们使用配备三个发光二极管（LED）的Act2系统，它们提供以444 nm，512 nm和633 nm48为中心的闪光激发能量。在这里，444 nm（蓝色）对应于叶绿素a（Chl-a）的吸收峰，而512nm（绿色）和633nm（橙色）分别对应于藻红素和藻蓝蛋白的吸收峰。荧光信号检测峰为682 nm，半带宽为30 nm。由于在自然环境中很难找到Colacium sp.的浮游阶段，因此收集了它们附着的阶段进行实验。在众多的底物生物中，Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776（Branchiopoda，Daphniidae;图1A，B，G）是最容易处理的，因为它们的游泳速度慢，体型大（400-650μm）和独特的行为（倒挂在水面上）。因此，该协议使用附着在S. mucronata上的Colacium sp.作为Colacium-basibiont系统的案例研究。为了避免来自肠道内容物的荧光，S. mucronata被饿死。由于之前的一项研究报告称，来自肠道内容物（摄入的藻类）的荧光信号在40分钟后显示五倍49，我们预计90分钟的饥饿足以最大限度地减少肠道含量荧光影响FRRf测量的可能性，同时对Colacium sp.的实验压力的影响最小，例如营养缺乏。此外，该方案还用于阐明Colacium sp.的附着机理，并确定钙（Ca）和锰（Mn）两种金属如何影响浮游和附着阶段的光生理学。钙以多种方式在光合途径50中起关键作用，并且两种金属都是构建PSII51的析氧复合物所必需的。由于钙和锰高度集中在甲壳类浮游动物47的甲壳中，我们假设如果该生命阶段在附着阶段从S. mucronata获得这些元素，则Colacium sp.光生理学可能对浮游阶段的Ca和Mn富集反应更突出。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act2Run</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-08711</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-25031</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-00382</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-05522</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Chlorella</td>
			<td>Recenttec, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>20 mg C&#183;mL&#8722;1 ; store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastOcean Act2</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe-citrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>093-00952</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCLP-880PF</td>
			<td>Nippon Medical and Chemical Instruments 
			&#160;Co., Ltd., Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>With LED light bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04292</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>167-04241</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>137-00402</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl3&#183;4H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>139-00722</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01861</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02472</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-02542</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-03231</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton Counter</td>
			<td>Matsunami Glass, Osaka, Japan</td>
			<td>S6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pylex test tube</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td>With rim, 16 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>203-00851</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B12</td>
			<td>Wako</td>
			<td>226-00343</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B6</td>
			<td>Wako</td>
			<td>165-05401</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>264-00402</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring photophysiology of attached stage of colacium sp. by a cuvette-type fast repetition rate fluorometer

快速重复率荧光计（FRRf）是测量光系统II（PSII）光生理学和初级生产率的有益方法。虽然FRRf可以测量各种真核藻类和蓝藻的PSII吸收截面（σ PSII），最大光化学效率（Fv / Fm），有效光化学效率（Fq/ Fm'）和非光化学淬灭（NPQNSV），但迄今为止几乎所有的FRRf研究都集中在浮游植物上。在这里，该协议描述了如何测量在生藻属的PSII光生理学。 Ehrenberg 1834（Euglenophyta），在其附着阶段（附着在浮游动物上），使用比色皿型FRRf。首先，我们估计了底物浮游动物（Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776，Cladocera，Daphniidae）对基线荧光和浮游可乐菌属的σ PSII，Fv / Fm，Fq'/Fm'和NPQNSV的影响。为了验证这种方法，我们记录了粘液链球菌附着的Colacium sp.的光生理学测量结果，并将这些结果与其浮游阶段进行了比较。具有代表性的结果表明，该协议如何确定钙（Ca）和锰（Mn）对Colacium sp.光生理学的影响，并确定Mn富集在附着和浮游阶段之间的各种影响。最后，我们讨论了该协议对其他周生藻类的适应性。

多达5个个体（inds）mL−1的基线荧光（图5）或Chl-a荧光（图6）没有显着影响。然而，当粘液链球菌为7.5 inds·mL−1时，Fv/Fm和NPQNSV受到显著影响。因此，为了测量Colacium sp.在附着阶段的光生理学，我们选择了具有较高Colacium sp.负荷的S. mucronata，以达到?...

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Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

快速重复率荧光计（FRRf）是测量光系统II光生理学和初级生产率的有益方法。在这里，我们描述了一种方案，使用比色皿型FRRf测量底物浮游动物上上生性藻类， Colacium sp.的PSII光生理学。

使用比色皿型快速重复率荧光计测量 Colacium sp.附着阶段的光生理学

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

该协议测量附着藻类的光合活性，而它们仍然附着在浮游生物上，就像在自然界中一样。这种技术的主要优点是光生理学的测量可以实时完成，而不会干扰样品。为了检查浮游动物个体对基线荧光的影响，从没有任何附着生物体的培养物中制备成年粘液性肩胛。现在，在FLW中将个体在20摄氏度下饿死至少90分钟，以避免肠道内容物发出荧光。将1.5毫升FWL倒入比色皿中。拾取所需的 s 数。粘液体个体在光学显微镜下以100倍放大倍率使用移液器，并将其转移到比色皿中。添加FLW可使样品体积达到2毫升，并允许其在20摄氏度的低光下适应15分钟，然后快速重复率荧光计测量。然后单击“执行运行”以开始测量，并为每个样品重复测量三次以上。从生成的图中读取 F0 值。在100倍放大倍率的光学显微镜下使用移液器用蜕皮甲壳拾取可乐菌，并用FLW洗涤它们。无菌地将AF-6培养基中的可乐菌种接种在干净的工作台上的10毫升玻璃管中。在生长室中将培养物保持在NC2温度，每天至少用手轻轻摇动玻璃管一次以防止细胞沉降。为了检查浮游动物个体对来自可乐菌物种的叶绿素和荧光的影响，使用没有任何附着生物的成年s. mucronata。为了避免肠道内容物发出荧光，请使FLW中的个体挨饿至少90分钟。设置比色皿式快速重复率荧光计。现在将预培养的可乐菌种的1.5毫升子样品倒入比色皿中。然后将所需数量的粘液链球菌个体转移到这些比色皿中，并用过滤的培养基使样品体积达到2毫升。在进行快速重复率荧光计测量之前，使个体在20摄氏度的低光下适应15分钟。单击“运行”以开始测量，每个样品重复测量三次以上。从生成的图中读取 F0 和 FM 值。为了校正基线荧光，使用0.2微米倒入大小的滤光片过滤培养基并测量荧光。从可乐菌种类的 F0 和 FM 中减去基线样品的 F0，或在选项选项卡的设置中修改空白校正值。使用移液器在光学显微镜下分离具有可乐菌属的粘液体个体。然后使用FLW洗涤s. mucronata。转移 s.粘液成100毫升的FLW，并在NC2温度下的黑暗条件下保存90分钟以使其饥饿。将1.5毫升FLW倒入比色皿中。转移大约十秒。将具有可乐菌种的粘液体放入比色皿中，并加入FLW以使样品达到2毫升。如文本手稿中所述，在N2C温度下使个体在低光下适应15分钟，并测量叶绿素a荧光。为了枚举附着的细胞的数量，在进行快速重复率荧光计测量后，用2%戊二醛固定样品。然后在光学显微镜下在s. mucronata的几个焦点深度和位置拍照。对基线荧光或叶绿素a荧光没有显著影响。mucronata高达每毫升5个人。然而，当粘液密度为每毫升7.5个体时，最大光化学效率和非光化学猝灭受到显着影响。AF-6培养基中固定期和浮游期可乐菌属植物生理学的季节变化与非光化学猝灭的平均最大光化学效率相似。对于黑暗条件下可乐菌种附着阶段，光生理参数差异不显著，但3小时后锰的非光化学淬火高于钙，21小时光强低。在浮游阶段，3小时时锰中PS2吸收截面明显低于钙处理。锰处理的有效光化学效率显著较高，但21小时非光化学淬灭低于对照。在光照增加的情况下，锰在3小时时PS2吸收截面趋于降低，在21小时的非光化学淬火中，同时在3小时时增加有效光化学效率。钙在增加光照下非光化学淬火略有改善。然而，它在三小时时降低了有效光化学效率。最重要的是底物生物的影响。如果藻类附着在不同的物种或材料上，效果可能会有所不同。除了该协议之外，碳固定或氧生产率的测量对于澄清钙生产率对实验操作的反应也很有用。该协议使我们能够阐明附着藻类的光合活性如何响应环境变化。

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