Name: measuring photophysiology of attached stage of colacium sp. by a cuvette-type fast repetition rate fluorometer
Uploaded: 2021-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer at JoVE.com

Il lavoro è stato sostenuto dal Collaborative Research Fund della Prefettura di Shiga dal titolo "Studio sulla qualità dell'acqua e sull'ambiente del fondo lago per la protezione della solidità dell'ambiente idrico" nell'ambito della sovvenzione giapponese per la rivitalizzazione regionale e il Fondo per la ricerca e lo sviluppo tecnologico dell'ambiente (n. 5-1607) del Ministero dell'Ambiente, Giappone. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Gli autori desiderano ringraziare Enago (www.enago.jp) per la recensione in lingua inglese.

1. Campionamento
<ol><li>Raccogli l'acqua del lago dalla superficie con un secchio. Per colpire Colacium sp. attaccato a S. mucronata (Figura 1A-C) filtrare 0,5-10 L di acqua di lago utilizzando una rete a rete di nylon da 100 μm52. NOTA: S. mucronata spesso si aggrega densamente in acque poco profonde, eutrofiche, fangose, come tra le aree di canna (phragmites).</li>
	<li>Conservare i campioni concent...

Questo protocollo ha dimostrato per la prima volta che la fotofisiologia di Colacium sp. durante la fase attaccata in un ambiente naturale è paragonabile al suo stadio planctonico nel mezzo AF-6. Inoltre, il contenuto intestinale di S. mucronata affamato non ha influenzato la fluorescenza al basale e Chl-a quando la densità era ≤5 inds·mL−1 (Figura 5 e Figura 6). Questi risultati suggeriscono che questo protocollo pu?...

La fluorescenza variabile della clorofilla è uno strumento utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema algale II (PSII). Le alghe rispondono a vari stress ambientali, come l'eccesso di luce e la carenza di nutrienti, alterando la loro fotofisiologia PSII. Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo comune per misurare la fotofisiologia PSII1,2 e stimare la produttività primaria1,3,4, che consente di monitorare la fotofisiologia del fitoplancton PSII e la produttività primaria su ampie scale spaziali e temporali5,6,7. FRRf può misurare simultaneamente la sezione trasversale di assorbimento PSII (σ PSII), la concentrazione del centro di reazione ([RCII]), la massima efficienza fotochimica (Fv / Fm), l'efficienza fotochimica efficace (Fq ′ / Fm′) e la tempra non fotochimica (NPQNSV) (Tabella 1). In generale, Fv/Fm e Fq′/Fm′ sono definiti come attività PSII8, mentre NPQNSV è definito come energia relativa dissipata dal calore9.
È importante sottolineare che i flash a singolo turnover (ST) di FRRf riducono completamente l'accettore di elettroni chinoni primari, QA, ma non il pool di plastochinoni. Al contrario, i flash di rotazione multipla (MT) da un fluorometro a modulazione di ampiezza dell'impulso (PAM) possono ridurre entrambi. Il metodo ST ha un chiaro vantaggio rispetto al metodo MT nell'identificare le possibili origini di NPQNSV misurando contemporaneamente la cinetica di recupero di Fv/Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV e σ PSII10. Ad oggi, diversi tipi di strumenti FRRf, come il tipo sommergibile, il tipo cuvetta e il tipo flow-through, sono disponibili in commercio. Il FRRf di tipo sommergibile consente misurazioni in situ in oceani e laghi, mentre il FRRf di tipo cuvetta è adatto per misurare piccoli volumi di campioni. Il tipo flow-through è comunemente usato per misurare continuamente la fotofisiologia del fitoplancton nelle acque superficiali.
Dato lo sviluppo di fluorometri PAM, incluso il tipo a cuvetta, per una vasta gamma di soggetti11, i fluorometri PAM sono ancora più comuni dei FRRf nella ricerca di fotofisiologia algale12. Ad esempio, sebbene la struttura della camera del campione e la capacità della cuvetta tra questi strumenti differiscano solo leggermente, il PAM di tipo cuvetta è stato applicato ai fitoplancton13,14,15, alle microalghe bentoniche16,17,18, alle alghe ghiacciate19 e alle alghe epizoiche20, mentre la FRRf di tipo cuvetta è stata applicata principalmente ai fitoplancton21,22,23 e un numero limitato di comunità algali di ghiaccio24,25. Data la sua efficacia, il FRRf di tipo cuvetta è ugualmente applicabile alle alghe bentoniche ed epizoiche. Pertanto, l'espansione della sua applicazione fornirà una notevole comprensione della fotofisiologia PSII, in particolare per la fotofisiologia algale epizoica meno conosciuta.
Le alghe epizoiche hanno ricevuto poca attenzione, con pochi studi che esaminano la loro fotofisiologia PSII20,26, molto probabilmente a causa dei loro ruoli minori nelle reti alimentari acquatiche27,28. Tuttavia, gli epibionti, comprese le alghe epizoiche, possono influenzare positivamente le dinamiche della comunità dello zooplancton, come l'aumento dei tassi di riproduzione e sopravvivenza29,30, nonché i processi di impatto negativo, come l'aumento del tasso di affondamento29,31 e la vulnerabilità ai predatori visivi32,33,34,35,36 . Pertanto, è fondamentale esplorare i fattori ambientali e biologici che controllano le dinamiche epibionti nelle comunità di zooplancton.
Tra le alghe epizoiche, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) è un gruppo algale comune, d'acqua dolce32,37,38,39 con vari stadi di vita, tra cui annesso (Figura 1A-D), planctonico non mobile (Figura 1E,F) e stadio planctonico mobile40,41 . Durante lo stadio planctonico non mobile, le cellule vivono come plancton unicellulari, colonie aggregate o colonie di fogli monostrato, coperte da mucillagini42. Nella fase attaccata, Colacium sp. utilizza mucillagini escrete dall'estremità anteriore della cellula37,39,41 per attaccarsi agli organismi substrati (basibionti), in particolare ai microcrustaceani41,43. Il loro ciclo vitale comporta anche il distacco dall'esoscheletro fuso o dal basibionte morto e il nuoto con i loro flagelli per trovare un altro organismo substrato39. Sia gli stadi planctonici che quelli attaccati possono aumentare le dimensioni della popolazione di mitosi40. Sebbene il loro stadio collegato sia ipotizzato come un tratto evolutivo per la raccolta di risorse, come la luce44 e gli oligoelementi41,45,46, o come strategia di dispersione27, sono disponibili poche prove sperimentali su questi aspetti37,41,44 e i meccanismi di attaccamento chiave sono in gran parte sconosciuti. Ad esempio, Rosowski e Kugrens si aspettavano che Colacium ottenesse manganese (Mn) dai copepodi del substrato41, concentrati nell'esoscheletro47.
Qui, descriviamo come misurare la fotofisiologia PSII delle alghe planctoniche e il relativo metodo di applicazione per il targeting delle alghe attaccate (che si attaccano allo zooplancton) con le cellule colacium sp. usando il FRRf di tipo cuvetta. Utilizziamo il sistema Act2 dotato di tre diodi emettitori di luce (LED) che forniscono energia di eccitazione del flash centrata a 444 nm, 512 nm e 633 nm48. Qui, 444 nm (blu) corrisponde al picco di assorbimento della corofilla a (Chl-a), mentre 512 nm (verde) e 633 nm (arancione) corrispondono ai picchi di assorbimento della ficoeritrina e della ficocianina, rispettivamente. Il picco di rilevamento del segnale fluorescente è di 682 nm con una mezza larghezza di banda di 30 nm. Poiché è difficile trovare lo stadio planctonico di Colacium sp. in ambienti naturali, il loro stadio attaccato è stato raccolto per gli esperimenti. Tra i numerosi organismi substrato, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; La Figura 1A, B, G) è una delle più semplici da gestire a causa della loro bassa velocità di nuoto, delle grandi dimensioni del corpo (400-650 μm) e del comportamento unico (appeso a testa in giù sulla superficie dell'acqua). Pertanto, questo protocollo utilizza Colacium sp. attaccato su S. mucronata come caso di studio del sistema Colacium-basibiont. Per evitare la fluorescenza derivata dal contenuto intestinale, S. mucronata è stata affamata. Poiché uno studio precedente ha riportato che il segnale di fluorescenza dal contenuto intestinale (alghe ingerite) mostra una diminuzione di cinque volte dopo 40 min49, ci aspettavamo che 90 minuti di fame sarebbero stati sufficienti per ridurre al minimo la possibilità che la fluorescenza del contenuto intestinale influenzasse la misurazione FRRf con effetti minimi di stress sperimentale a Colacium sp., come la carenza di nutrienti. Inoltre, questo protocollo è stato applicato per chiarire il meccanismo di attacco di Colacium sp. e determinare come due metalli, calcio (Ca) e manganese (Mn) influenzano la fotofisiologia di entrambi gli stadi planctonici e attaccati. Il calcio svolge un ruolo chiave nelle vie fotosintetiche50 in diversi modi, ed entrambi i metalli sono necessari per costruire i complessi in evoluzione dell'ossigeno del PSII51. Poiché il calcio e il manganese sono altamente concentrati nel carapace dello zooplancton dei crostacei47, ipotizziamo che la fotofisiologia di Colacium sp. potrebbe rispondere in modo più prominente all'arricchimento di Ca e Mn durante lo stadio planctonico se questa fase di vita ottiene questi elementi da S. mucronata durante lo stadio attaccato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act2Run</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-08711</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-25031</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-00382</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-05522</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Chlorella</td>
			<td>Recenttec, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>20 mg C&#183;mL&#8722;1 ; store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastOcean Act2</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe-citrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>093-00952</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCLP-880PF</td>
			<td>Nippon Medical and Chemical Instruments 
			&#160;Co., Ltd., Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>With LED light bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04292</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>167-04241</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>137-00402</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl3&#183;4H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>139-00722</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01861</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02472</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-02542</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-03231</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton Counter</td>
			<td>Matsunami Glass, Osaka, Japan</td>
			<td>S6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pylex test tube</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td>With rim, 16 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>203-00851</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B12</td>
			<td>Wako</td>
			<td>226-00343</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B6</td>
			<td>Wako</td>
			<td>165-05401</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>264-00402</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring photophysiology of attached stage of colacium sp. by a cuvette-type fast repetition rate fluorometer

Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema II (PSII) e la produttività primaria. Sebbene FRRf possa misurare la sezione trasversale di assorbimento PSII (σ PSII), la massima efficienza fotochimica (Fv / Fm), l'efficienza fotochimica efficace (Fq ′ / Fm′) e la tempra non fotochimica (NPQNSV) per varie alghe eucariotiche e cianobatteri, quasi tutti gli studi FRRf fino ad oggi si sono concentrati sul fitoplancton. Qui, il protocollo descrive come misurare la fotofisiologia PSII di un'alga epizoica Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), nel suo stadio annesso (attaccato allo zooplancton), usando FRRf di tipo cuvetta. In primo luogo, abbiamo stimato gli effetti dello zooplancton substrato (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) sulla fluorescenza basale e σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′ e NPQNSV del planctonico Colacium sp. Per convalidare questa metodologia, abbiamo registrato misurazioni fotofisiologiche di Colacium sp. allegato su S. mucronata e confrontato questi risultati con il suo stadio planctonico. I risultati rappresentativi hanno mostrato come il protocollo potrebbe determinare gli effetti del calcio (Ca) e del manganese (Mn) sulla fotofisiologia di Colacium sp. e identificare i vari effetti dell'arricchimento di Mn tra stadi attaccati e planctonici. Infine, discutiamo l'adattabilità di questo protocollo ad altre alghe perifite.

Non vi è stato alcun effetto significativo della fluorescenza al basale (Figura 5) o della fluorescenza Chl-a (Figura 6) da parte di S. mucronata fino a 5 individui (inds.) mL−1. Tuttavia, Fv/Fm e NPQNSV sono stati significativamente colpiti quando S. mucronata era di 7,5 inds·mL−1. Pertanto, per misurare la fotofisiologia di Colacium sp. d...

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Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Il fluorometro a velocità di ripetizione rapida (FRRf) è un metodo utile per misurare la fotofisiologia del fotosistema II e la produttività primaria. Qui descriviamo un protocollo per misurare la fotofisiologia PSII dell'alga epizoica, Colacium sp. su substrato zooplancton utilizzando FRRf di tipo cuvetta.

Misurazione della fotofisiologia dello stadio collegato di Colacium sp. da un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Questo protocollo misura l'attività fotosintetica delle alghe attaccate, mentre si attaccano ancora al plancton, proprio come in natura. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la misurazione della fotofisiologia può essere eseguita in tempo reale senza distrazioni del campione. Per esaminare gli effetti degli individui di zooplancton sulla fluorescenza basale, preparare scapholeberis mucronata adulto dalla coltura senza organismi attaccati.Ora affamare gli individui in FLW a 20 gradi Celsius per almeno 90 minuti per evitare la fluorescenza dal contenuto intestinale. Versare 1,5 millilitri di FWL in una cuvetta. Raccogli il numero desiderato di s.individui mucronata che usano una pipetta al microscopio ottico a 100 volte l'ingrandimento e li trasferiscono nella cuvetta. Aggiungere FLW per portare il volume del campione fino a 2 millilitri e consentirgli di acclimatarsi in condizioni di scarsa illuminazione a 20 gradi Celsius è per 15 minuti prima della misurazione del fluorometro a velocità di ripetizione rapida. Quindi fare clic su act to run"per avviare la misurazione e ripetere le misurazioni più di tre volte per campione.Leggete il valore F0 dal plottaggio risultante. Raccogli le specie di colacium con un carapace fuso usando una pipetta al microscopio ottico con ingrandimento 100 volte e lavale con FLW. Specie di colacium asetticamente inoculate nel mezzo AF-6 in un tubo di vetro da 10 millilitri su una panca pulita.Mantenere la coltura a una temperatura NC2 in una camera di crescita, agitando delicatamente il tubo di vetro a mano almeno una volta al giorno per evitare l'insediamento cellulare. Per esaminare gli effetti degli individui di zooplancton sulla clorofilla una fluorescenza da specie di colacium, utilizzare s. mucronata adulto senza organismi attaccati.Per evitare la fluorescenza dal contenuto intestinale, affamare gli individui in FLW per almeno 90 minuti. Impostare un fluorometro a velocità di ripetizione rapida di tipo cuvetta. Ora versa un sottocampione di 1,5 millilitri di specie di colacium pre-coltivate in una cuvetta.Quindi trasferire il numero desiderato di individui s. mucronata in queste cuvette e portare il volume del campione fino a 2 millilitri con il mezzo filtrato. Acclimatare gli individui in condizioni di scarsa illuminazione a 20 gradi Celsius per 15 minuti prima di effettuare la misurazione del fluorometro a velocità di ripetizione rapida.Fare clic su act to run" per avviare la misurazione, ripetendo le misurazioni più di tre volte per campione. Leggere i valori F0 e FM dal grafico risultante. Per correggere la fluorescenza basale, filtrare il terreno di coltura utilizzando un filtro di 0,2 micrometri e misurare la fluorescenza.Sottrarre F0 del campione basale da F0 e FM di specie di colacium o modificare il valore di correzione in bianco nelle impostazioni nella scheda opzioni. Isolare gli individui s. mucronata con specie di colacium usando una pipetta al microscopio ottico.Quindi lavare s. mucronata usando FLW. Trasferimento s.mucronata in 100 millilitri di FLW e tenerli in condizioni di oscurità a temperatura NC2 per 90 minuti per la fame. Versare 1,5 millilitri di FLW in una cuvetta. Trasferimento di circa dieci s.mucronata individui con specie di colacium in una cuvetta e aggiungere FLW per portare il campione fino a 2 millilitri. Acclimatare gli individui in condizioni di scarsa illuminazione a temperatura N2C per 15 minuti e misurare la clorofilla una fluorescenza, come menzionato nel manoscritto del testo. Per enumerare il numero di cellule attaccate, fissare il campione con il 2% di glutaraldeide dopo aver preso la misurazione del fluorometro a velocità di ripetizione rapida.Quindi scattare foto a diverse profondità focali e posizioni di s. mucronata al microscopio ottico. Non vi è stato alcun effetto significativo sulla fluorescenza basale o sulla clorofilla una fluorescenza da s.mucronata fino a 5 individui per millilitro. Tuttavia, la massima efficienza fotochimica e la tempra non fotochimica sono state significativamente influenzate quando la densità di s. mucronata era di 7,5 individui per millilitro.La variazione stagionale nella fitofisiologia delle specie di colacium durante la fase di attaccamento e lo stadio planctonico per la fase stazionaria nel mezzo AF-6 hanno mostrato un'efficienza fotochimica massima media simile e una tempra non fotochimica. Per lo stadio attaccato delle specie di colacium in condizioni di oscurità, non vi è stata alcuna differenza significativa nei parametri fotofisiologici, tranne che la tempra non fotochimica è superiore per il manganese rispetto al calcio dopo tre ore e a bassa intensità luminosa a 21 ore. Per lo stadio planctonico, la sezione trasversale di assorbimento di PS2 era significativamente inferiore nel manganese rispetto al trattamento con calcio a tre ore.L'efficienza fotochimica efficace era significativamente più alta, ma la tempra non fotochimica era inferiore nel trattamento con manganese rispetto al controllo a 21 ore. Sotto l'aumentare della luce, il manganese tendeva a diminuire la sezione trasversale di assorbimento della PS2 a tre ore, nella tempra non fotochimica a 21 ore, aumentando l'efficienza fotochimica effettiva a tre ore. Il calcio ha leggermente migliorato la tempra non fotochimica sotto luce crescente.Tuttavia, ha diminuito l'efficienza fotochimica effettiva a tre ore. La cosa più importante è l'effetto degli organismi del substrato. Se le alghe sono attaccate a diverse specie o materiali, l'effetto può essere diverso.Oltre a questo protocollo, la misurazione della fissazione del carbonio o dei tassi di produzione di ossigeno sono utili per chiarire la risposta della produttività del calcio alle manipolazioni sperimentali. Questo protocollo ci consente di chiarire come l'attività fotosintetica delle alghe attaccate risponde ai cambiamenti ambientali.

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