Name: measuring photophysiology of attached stage of colacium sp. by a cuvette-type fast repetition rate fluorometer
Uploaded: 2021-11-12T13:00:00
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本研究は、環境省の地方創生費補助金及び環境研究技術開発費(第5-1607号)の滋賀県共同研究費「水環境の健全性確保のための水質・湖底環境に関する研究」の支援を受けたものです。https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html。著者らは、英語のレビューのためにEnago(www.enago.jp)に感謝したいと思います。

1. サンプリング
<ol><li>バケツで水面から湖の水を集める。S. mucronata(図1A-C)に付着したColacium sp.を標的にするために、100μmのナイロンメッシュnet52を用いて0.5〜10Lの湖水にフィルターを当てた。 注: S. mucronata は、しばしば、葦(フグダニ)地域など、浅い、富栄養性、泥水で密集する。</li>
	<li>濃縮したサン...

このプロトコルは、自然環境における付着段階におけるColacium sp.の光生理学がAF-6培地中のプランクトン段階に匹敵することを初めて実証した。さらに、飢餓状態のS. mcronataの腸内内容物は、密度が≤5 inds·mL-1の場合、ベースラインおよびChl-a蛍光に影響を及ぼさなかった(図5および図6)。これらの結果は、このプロトコ?...

クロロフィル可変蛍光は、藻類光系II(PSII)光生理機能を測定するための有用なツールである。藻類は、過剰な光や栄養素欠乏などのさまざまな環境ストレスに反応し、PSII光生理機能を変化させます。高速繰り返し速度蛍光光度計(FRRf)は、PSII光生理学1,2を測定し、一次生産性1,3,4を推定するための一般的な方法であり、植物プランクトンPSII光生理学、ならびに広い空間的および時間的スケールにわたる一次生産性のモニタリングを可能にします5,6,7。FRRfは、PSII(σ PSII)吸収断面積、反応中心([RCII])濃度、最大光化学効率(Fv/Fm)、有効光化学効率(Fq′/Fm')、および非光化学クエンチ(NPQNSV)を同時に測定することができます(表1)。一般に、Fv/FmおよびFq′/Fm'はPSII活性8として定義され、 NPQNSVは相対放熱エネルギー9として定義される。
重要なことに、FRRfの単一ターンオーバー(ST)フラッシュは、一次キノン電子受容体QAを完全に減少させるが、プラストキノンプールは減少させない。逆に、パルス振幅変調(PAM)蛍光光度計からの複数回のターンオーバー(MT)フラッシュは、両方を低減することができます。ST法は、Fv/Fm、Fq′/Fm'、NPQNSV、およびσ PSII10の回復動態を同時に測定することにより、NPQNSVの可能性のある起源を特定する際にMT法よりも明確な利点を有する。現在までに、潜水艇型、キュベット型、フロースルー型など、いくつかのタイプのFRRf機器が市販されている。水中型FRRfは海洋や湖沼でのin situ測定を可能にし、キュベット型FRRfは少量のサンプル測定に適しています。フロースルー型は、表層水中の植物プランクトンの光生理機能を連続的に測定するために一般的に使用されています。
キュベット型を含むPAM蛍光光度計が幅広い被験者に対して開発されていることを考えると11、PAM蛍光光度計は藻類の光生理学研究においてFRRfsよりも依然として一般的です12。例えば、これらのツール間で試料室構造やキュベット容量はわずかに異なるにすぎないが、キュベット型PAMは植物プランクトン13,14,15,底生微細藻類16,17,18,氷藻19,およびエピゾイック藻類20に適用されているが、キュベット型FRRfは主に植物プランクトンに適用されている21,22,23。 限られた数の氷藻類コミュニティ24,25。その有効性を考えると、キュベット型FRRfは底生藻類およびエピゾイック藻類に等しく適用可能である。したがって、その適用を拡大することは、PSII光生理学、特にあまり知られていないエピゾイ藻類光生理学に対するかなりの洞察を提供するであろう。
エピゾイ藻類はほとんど注目されておらず、PSII光生理学を調べる研究はほとんどなく20,26、おそらく水生食物網における彼らの小さな役割が原因である27,28。しかし、エピゾイック藻類を含むエピバイオントは、繁殖率や生存率の増加など、動物プランクトン群集のダイナミクスにプラスの影響を与える可能性があり29,30、沈没率29,31の増加や視覚的捕食者に対する脆弱性29,31などのプロセスに悪影響を及ぼす可能性があります32,33,34,35,36。.したがって、動物プランクトン群集におけるエピバイオントの動態を制御する環境的および生物学的要因を探索することは極めて重要である。
エピゾイック藻類の中で、コラシウム・エーレンベルク1834(Euglenophyta)は、一般的な淡水、藻類群32、37、38、39(図1A−D)、非運動性プランクトン(図1E、F)、および運動性プランクトン段階を含む様々なライフステージを有する40、41.非運動性プランクトン期の間、細胞は粘液で覆われた単細胞プランクトン、凝集コロニー、または1層シートコロニーとして生きる42。付着段階では、Colacium sp.は、細胞の前端から排泄された粘液37,39,41を使用して基質生物(担子類)、特に微小甲殻類41,43に付着する。彼らのライフサイクルはまた、脱皮した外骨格または死んだバシビオットから切り離し、鞭毛と一緒に泳いで別の基質生物を見つけることを含む39。プランクトン期と付着期の両方が有糸分裂によって集団サイズを増加させる可能性があります40。それらの付着段階は、光44や微量元素41,45,46などの資源を集めるための進化的形質、または分散戦略27であると仮定されているが、これらの側面37,41,44に関する実験的証拠はほとんどなく、主要な付着メカニズムはほとんど知られていない。例えば、ロソウスキーとクグレンスは、コラシウムが基質カイアシ類41からマンガン(Mn)を得ると予想し、外骨格47に集中する。
ここでは、プランクトン藻類のPSII光生理機能の測定方法およびキュベット型FRRfを用いたColacium sp.細胞による付着藻類(動物プランクトンへの付着)の標的化の関連適用方法について説明する。444nm、512nm、633nmを中心としたフラッシュ励起エネルギーを提供する3つの発光ダイオード(LED)を搭載したAct2システムを使用しています48。ここで、444nm(青色)はクロフィルa(Chl-a)の吸収ピークに対応し、512nm(緑色)および633nm(オレンジ色)はフィコエリスリンおよびフィコシアニンの吸収ピークにそれぞれ対応する。蛍光シグナル検出ピークは682nmで、半値帯域幅は30nmです。 Colacium sp.のプランクトン期を自然環境下で見つけることは困難であるため、実験のためにそれらの付着期を採取した。多数の基質生物の中で、Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae;図1A,B,G)は、泳ぐ速度が遅く、体の大きさが大きく(400〜650μm)、ユニークな挙動(水面に逆さまにぶら下がっている)のために、扱いが最も簡単なものの1つです。したがって、このプロトコルは、コラシウム - バシビオン系のケーススタディとして、S. mucronataに付着したColacium sp.を使用する。腸内容物に由来する蛍光を避けるために、S. mucronataは飢餓状態であった。以前の研究では、腸内内容物(摂取された藻類)からの蛍光シグナルが40分後に5倍の減少を示すことが報告されていたので49、90分の飢餓は、栄養素欠乏などのColacium sp.への実験的ストレスの影響を最小限に抑えながら、腸内含有量の蛍光がFRRf測定に影響を与える可能性を最小限に抑えるのに十分であると予想しました。さらに、このプロトコルを適用して、Colacium sp.の結合メカニズムを明らかにし、カルシウム(Ca)とマンガン(Mn)の2つの金属がプランクトンと付着段階の両方の光生理機能にどのように影響するかを決定しました。カルシウムは光合成経路50において複数の方法で重要な役割を果たしており、PSII51の酸素発生錯体を構築するためには両方の金属が必要です。カルシウムとマンガンは甲殻類の動物プランクトン47の甲羅に高濃度であるため、このライフステージが付着段階でS. mucronataからこれらの元素を取得すれば、Colacium sp. 光生理学はプランクトン段階のCaとMnの濃縮により顕著に反応する可能性があると仮定します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act2Run</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-08711</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-25031</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-00382</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-05522</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Chlorella</td>
			<td>Recenttec, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>20 mg C&#183;mL&#8722;1 ; store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastOcean Act2</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe-citrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>093-00952</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCLP-880PF</td>
			<td>Nippon Medical and Chemical Instruments 
			&#160;Co., Ltd., Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>With LED light bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04292</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>167-04241</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>137-00402</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl3&#183;4H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>139-00722</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01861</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02472</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-02542</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-03231</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton Counter</td>
			<td>Matsunami Glass, Osaka, Japan</td>
			<td>S6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pylex test tube</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td>With rim, 16 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>203-00851</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B12</td>
			<td>Wako</td>
			<td>226-00343</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B6</td>
			<td>Wako</td>
			<td>165-05401</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>264-00402</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring photophysiology of attached stage of colacium sp. by a cuvette-type fast repetition rate fluorometer

高速繰り返し速度蛍光光度計(FRRf)は、光システムII(PSII)光生理学および一次生産性を測定するための有益な方法です。FRRfは、様々な真核生物藻類およびシアノバクテリアについて、PSII吸収断面(σ PSII)、最大光化学効率(Fv/Fm)、有効光化学効率(Fq′/Fm')、および非光化学消光(NPQNSV)を測定することができるが、これまでのFRRf研究のほとんどすべてが植物プランクトンに焦点を当てている。ここで、プロトコルは、エピゾイック藻類コラシウムspのPSII光生理機能を測定する方法を記載する。エーレンベルク1834(Euglenophyta)は、その付着段階(動物プランクトンに付着)において、キュベット型FRRfを使用した。まず、基質動物プランクトン(Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae)がベースライン蛍光およびσ PSII,Fv/Fm,Fq'/Fm',NPQNSVのプランクトンコラシウムsp.に及ぼす影響を推定した。この方法論を検証するために、我々はS. mucronataに付着したColacium sp.の光生理学的測定値を記録し、これらの結果をそのプランクトン段階と比較した。代表的な結果は、プロトコルがコラシウム属の光生理学に対するカルシウム(Ca)およびマンガン(Mn)の効果を決定し、結合段階とプランクトン段階との間のMn濃縮の様々な効果を同定する方法を示した。最後に、他の周生藻類に対するこのプロトコルの適応性について議論する。

5個体(inds.)mL−1までのS. mucronataによるベースライン蛍光(図5)またはChl-a蛍光(図6)の有意な影響はなかった。しかし、Fv/FmおよびNPQNSVは、S. mucronataが7.5 inds·mL−1のときに有意に影響を受けた。そこで、付着段階におけるコラシウム属の光生理機能を測定するために、コ?...

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Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

高速繰り返し速度蛍光光度計(FRRf)は、光システムII光生理学および一次生産性を測定するための有益な方法である。ここでは、キュベット型FRRfを用いて基質動物プランクトン上のエピゾイ藻類、 コラシウム 属のPSII光生理機能を測定するためのプロトコールについて説明する。

キュベット型高速繰り返し速度蛍光光度計による コラシウム 属の付着ステージの光生理機能の測定

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

このプロトコルは、自然界と同様に、付着した藻類がまだプランクトンに付着している間に、付着した藻類の光合成活性を測定する。この技術の主な利点は、サンプルの気を散らすことなく、光生理学の測定をリアルタイムで行うことができることです。ベースライン蛍光に対する動物プランクトン個体の影響を調べるために、付着した生物を含まない培養物から成体のスカポレベリス・ムクロナータを調製する。次に、腸内含量からの蛍光を避けるために、FLW中の個体を摂氏20度で少なくとも90分間飢えさせる。1.5ミリリットルのFWLをキュベットに注ぐ。希望の数の s を拾います。ムクロナータ個体は、光学顕微鏡下でピペットを用いて倍率100倍で、キュベット内に移した。FLWを追加してサンプル量を最大2ミリリットルにし、高速繰り返し率蛍光光度計測定の前に15分間、摂氏20度の低照度下で順応できるようにします。次に、「実行する行為」をクリックして測定を開始し、サンプルごとに測定を3回以上繰り返します。結果のプロットからF0値を読み取ります。光学顕微鏡下でピペットを用いて脱皮甲羅でコラシウム種を100倍の倍率で拾い上げ、FLWで洗浄する。クリーンベンチ上の10ミリリットルのガラス管にAF-6培地中のコラシウム種を無菌的に接種する。増殖チャンバー内で培養物をNC2温度に維持し、細胞沈降を防ぐために少なくとも1日1回は手でガラス管を優しく振る。コラシウム種からの蛍光であるクロロフィルに対する動物プランクトン個体の影響を調べるには、生物を付着させない成虫のs. mucronataを使用する。腸内容物からの蛍光を避けるために、FLW中の個体を少なくとも90分間飢えさせる。キュベット式高速繰り返し速度蛍光光度計を設置。次に、前培養コラシウム種の1.5ミリリットルのサブサンプルをキュベットに注ぎます。次いで、所望の数のs. mucronata個体をこれらのキュベットに移し、濾過された媒体でサンプル量を最大2ミリリットルにする。20°Cの低照度下で15分間個体を順応させてから、高速繰り返し速度蛍光光度計測定を行います。「act to run」をクリックして測定を開始し、サンプルごとに測定を3回以上繰り返します。結果のプロットからF0値とFM値を読み取ります。ベースライン蛍光を補正するには、0.2マイクロメートルの注ぎ口サイズのフィルターを使用して培養液をろ過し、蛍光を測定します。コラシウム種の F0 および FM からベースラインサンプルの F0 を減算するか、[オプション] タブの設定で空白の補正値を変更します。光学顕微鏡下でピペットを使用して、コラシウム種を持つ s. mucronata 個体を分離します。その後、FLWを用いてムクロナータを洗浄する。を転送します。ムクロナータを100ミリリットルのFLWに入れ、NC2温度で暗条件下で90分間飢餓状態に保ちます。1.5ミリリットルのFLWをキュベットに注ぐ。約10秒の転送。コラシウム種を含むムクロナータ個体をキュベットに入れ、FLWを加えてサンプルを最大2ミリリットルにする。N2C温度の低照度下で15分間個体を順応させ、テキスト原稿に記載されているようにクロロフィルの蛍光を測定する。付着細胞数を列挙するには、高速繰り返し速度蛍光光度計測定を行った後、サンプルを2%グルタルアルデヒドで固定する。その後、光学顕微鏡下でs. mucronataのいくつかの焦点深度と位置で写真を撮ります。sによるベースライン蛍光またはクロロフィルa蛍光に対して有意な影響はなかった。ムクロナータは1ミリリットルあたり最大5個体。しかし、最大光化学効率および非光化学消光は、s. mucronata密度が1ミリリットルあたり7.5個体であった場合に有意に影響を受けた。AF-6培地中の固定相に対する付着段階およびプランクトン段階におけるコラシウム種の植物生理機能の季節変動は、同様の平均最大光化学効率および非光化学消光を示した。暗条件下でのコラシウム種の付着段階については、非光化学的消光がカルシウムよりもマンガンの方が高く、21時間で低い光強度であることを除いて、光生理学的パラメータに有意差はなかった。プランクトン期については、PS2吸収断面が3時間でカルシウム処理よりもマンガンで有意に低かった。効果的な光化学的効率は有意に高かったが、非光化学的急冷は、21時間での対照よりもマンガン処理において低かった。増加した光の下で、マンガンは、21時間で非光化学クエンチにおいて、3時間でPS2吸収断面を減少させる傾向があったが、3時間で有効な光化学効率を増加させる。カルシウムは、増加する光の下で非光化学消光をわずかに改善した。しかし、3時間で有効な光化学効率が低下した。最も重要なことは、基質生物の効果です。藻類が異なる種または材料に付着した場合、その効果は異なる可能性がある。このプロトコールに加えて、炭素固定または酸素生成速度の測定は、実験操作に対するカルシウム生産性の応答を明らかにするのに有用である。このプロトコルにより、付着した藻類の光合成活性が環境変化にどのように反応するかを明らかにすることができます。

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