Name: measuring photophysiology of attached stage of colacium sp. by a cuvette-type fast repetition rate fluorometer
Uploaded: 2021-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фондом совместных исследований префектуры Сига под названием «Исследование качества воды и среды дна озера для защиты надежности водной среды» в рамках японского гранта на региональное возрождение и Фонда исследований и развития технологий в области окружающей среды (No 5-1607) министерства окружающей среды Японии. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Авторы хотели бы поблагодарить Enago (www.enago.jp) за обзор английского языка.

1. Отбор проб
<ol><li>Соберите озерную воду с поверхности ведром. Для нацеливания Colacium sp. прикрепляют к S. mucronata (рисунок 1A-C) фильтруют 0,5-10 л озерной воды с использованием 100 мкм нейлоновой сетки 52. ПРИМЕЧАНИЕ: S. mucronata часто плотно...

Этот протокол впервые продемонстрировал, что фотофизиология Colacium sp. во время прикрепленной стадии в естественной среде сопоставима с его планктонной стадией в среде AF-6. Кроме того, кишечное содержимое голодающего S. mucronata не влияло на исходный уровень и флуоресценцию Chl-a, ...

Переменная флуоресценция хлорофилла является полезным инструментом для измерения фотофизиологии фотосистемы водорослей II (PSII). Водоросли реагируют на различные экологические стрессы, такие как избыток света и дефицит питательных веществ, изменяя свою фотофизиологию PSII. Флуорометр с быстрой частотой повторения (FRRf) является распространенным методом измерения фотофизиологии PSII1,2 и оценки первичной продуктивности1,3,4, что позволяет контролировать фотофизиологию фитопланктона PSII, а также первичную продуктивность в широких пространственных и временных масштабах5,6,7. FRRf может одновременно измерять поперечное сечение поглощения PSII (σ PSII), концентрацию реакционного центра ([RCII]), максимальную фотохимическую эффективность (Fv / Fm), эффективную фотохимическую эффективность (Fq'/Fm') и нефотохимическую закалку (NPQNSV) (таблица 1). В общем, Fv/Fm и Fq′/Fm′ определяются как активность PSII8, в то время как NPQNSV определяется как относительная теплоотдачаемая энергия9.
Важно отметить, что вспышки одиночного оборота (ST) FRRf полностью уменьшают первичный акцептор электронов хинона, QA, но не пул пластохинонов. И наоборот, вспышки с множественным оборотом (MT) от флуорометра с амплитудной модуляцией импульсов (PAM) могут уменьшить и то, и другое. Метод ST имеет явное преимущество перед методом MT при выявлении возможного происхождения NPQNSV путем одновременного измерения кинетики восстановления Fv/Fm, Fq'/Fm', NPQNSV и σ PSII10. На сегодняшний день коммерчески доступны несколько типов инструментов FRRf, таких как погружной тип, кюветный тип и проточный тип. Погружной тип FRRf позволяет проводить измерения in situ в океанах и озерах, в то время как FRRf кюветного типа подходит для измерения небольших объемов проб. Проточный тип обычно используется для непрерывного измерения фотофизиологии фитопланктона в поверхностных водах.
Учитывая развитие флуорометров PAM, в том числе кюветного типа, для широкого круга субъектов11, флуорометры PAM по-прежнему более распространены, чем FRRfs в исследованиях фотофизиологии водорослей12. Например, хотя структура камеры образца и емкость кюветы между этими инструментами отличаются незначительно, PAM кюветного типа был применен к фитопланктонам13,14,15, бентическим микроводорослям16,17,18, ледяным водорослям19 и эпизойным водорослям20, в то время как FRRf типа кюветы был применен в основном к фитопланктонам21,22,23 и ограниченное число сообществ ледяных водорослей24,25. Учитывая свою эффективность, frRf кюветного типа в равной степени применим к бентическим и эпизойным водорослям. Таким образом, расширение его применения даст значительное представление о фотофизиологии PSII, особенно для менее известной эпизойной фотофизиологии водорослей.
Эпизойные водоросли получили мало внимания, и лишь немногие исследования изучали их фотофизиологию PSII20,26, скорее всего, из-за их незначительной роли в водных пищевых сетях27,28. Однако эпибионты, включая эпизойные водоросли, могут положительно влиять на динамику сообщества зоопланктона, такую как увеличение показателей размножения и выживаемости29,30, а также негативно влиять на процессы, такие как увеличение скорости погружения29,31 и уязвимость к визуальным хищникам32,33,34,35,36 . Поэтому изучение экологических и биологических факторов, контролирующих динамику эпибионтов в сообществах зоопланктона, имеет решающее значение.
Среди эпизойных водорослей Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) представляет собой распространенную пресноводную группу водорослей32,37,38,39 с различными стадиями жизни, включая присоединенные (рисунок 1A-D), неподвижные планктонные (рисунок 1E,F) и подвижные планктонные стадии40,41 . Во время неподвижной планктонной стадии клетки живут как одноклеточные планктоны, агрегированные колонии или однослойные листовые колонии, покрытые слизью42. В присоединенной стадии Colacium sp. использует слизь, выведенную из переднего конца клетки37,39,41, для прикрепления к субстратным организмам (базибионтам), в частности микрокрустацианам41,43. Их жизненный цикл также включает в себя отделение от линького экзоскелета или мертвого базибоонта и плавание с их жгутиками, чтобы найти другой субстратный организм39. Как планктонные, так и прикрепленные стадии могут увеличить размер своей популяции с помощью mitosis40. Хотя предполагается, что их прикрепленная стадия является эволюционной чертой для сбора ресурсов, таких как свет44 и микроэлементы41,45,46, или в качестве стратегии дисперсии27, имеется мало экспериментальных данных об этих аспектах37,41,44, а ключевые механизмы прикрепления в значительной степени неизвестны. Например, Росовски и Кугренс ожидали, что Colacium получает марганец (Mn) из субстрата copepods41, сконцентрированного в экзоскелете47.
Здесь мы описываем, как измерить фотофизиологию PSII планктонных водорослей и связанный с этим метод применения для нацеливания на прикрепленные водоросли (присоединение к зоопланктону) с помощью клеток Colacium sp. с использованием FRRf типа кюветы. Мы используем систему Act2, оснащенную тремя светодиодами (СВЕТОДИОДАМИ), которые обеспечивают энергию возбуждения вспышки с центром в 444 нм, 512 нм и 633 нм48. Здесь 444 нм (синий) соответствует пику поглощения хрофилла a (Chl-a), в то время как 512 нм (зеленый) и 633 нм (оранжевый) соответствуют пикам поглощения фикоэритрина и фикоцианина соответственно. Пик обнаружения флуоресцентного сигнала составляет 682 нм с половинной полосой пропускания 30 нм. Поскольку трудно найти планктонную стадию Colacium sp. в естественных средах, их прикрепленная стадия была собрана для экспериментов. Среди многочисленных субстратных организмов, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Рисунок 1A, B, G) является одним из самых простых в обращении из-за их медленной скорости плавания, большого размера тела (400-650 мкм) и уникального поведения (висящего вниз головой на поверхности воды). Поэтому этот протокол использует Colacium sp., прикрепленный к S. mucronata, в качестве примера системы Colacium-basibiont. Чтобы избежать флуоресценции, полученной из содержимого кишечника, S. mucronata голодали. Поскольку в предыдущем исследовании сообщалось, что флуоресцентный сигнал от содержимого кишечника (проглоченных водорослей) показывает пятикратное снижение через 40 мин49, мы ожидали, что 90-минутного голодания будет достаточно, чтобы свести к минимуму возможность флуоресценции содержимого кишечника, влияющей на измерение FRRf с минимальными эффектами экспериментального стресса для Colacium sp., такими как дефицит питательных веществ. Кроме того, этот протокол был применен для уточнения механизма присоединения Colacium sp. и определения того, как два металла, кальций (Ca) и марганец (Mn), влияют на фотофизиологию как планктонной, так и прикрепленной стадий. Кальций играет ключевую роль в путях фотосинтеза50 несколькими способами, и оба металла необходимы для создания кислород-эволюционирующих комплексов PSII51. Поскольку кальций и марганец высоко сконцентрированы в панцире ракообразных zooplankton47, мы предполагаем, что фотофизиология Colacium sp. может более заметно реагировать на обогащение Ca и Mn во время планктонной стадии, если эта стадия жизни получает эти элементы от S. mucronata во время прикрепленной стадии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrodisc syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act2Run</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-08711</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>031-25031</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-00382</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-05522</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-03682</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrated Chlorella</td>
			<td>Recenttec, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>20 mg C&#183;mL&#8722;1 ; store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastOcean Act2</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe-citrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>093-00952</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3&#183;6H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>091-00872</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCLP-880PF</td>
			<td>Nippon Medical and Chemical Instruments 
			&#160;Co., Ltd., Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>With LED light bulbs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>160-04292</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>167-04241</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>137-00402</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl3&#183;4H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>139-00722</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA</td>
			<td>Wako</td>
			<td>343-01861</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-02472</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaNO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-02542</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>015-03231</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton Counter</td>
			<td>Matsunami Glass, Osaka, Japan</td>
			<td>S6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pylex test tube</td>
			<td>CTG Ltd., West Molesey, UK</td>
			<td></td>
			<td>With rim, 16 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>203-00851</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B12</td>
			<td>Wako</td>
			<td>226-00343</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vit. B6</td>
			<td>Wako</td>
			<td>165-05401</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#183;7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>264-00402</td>
			<td>AF-6 medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring photophysiology of attached stage of colacium sp. by a cuvette-type fast repetition rate fluorometer

Флуорометр с высокой частотой повторения (FRRf) является полезным методом для измерения фотосистемы II (PSII) фотофизиологии и первичной производительности. Хотя FRRf может измерять поперечное сечение поглощения PSII (σ PSII), максимальную фотохимическую эффективность (Fv / Fm), эффективную фотохимическую эффективность (Fq'/Fm') и нефотохимическое гашение (NPQNSV) для различных эукариотических водорослей и цианобактерий, почти все исследования FRRf на сегодняшний день сосредоточены на фитопланктоне. Здесь протокол описывает, как измерить фотофизиологию PSII эпизойной водоросли Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), в своей присоединенной стадии (прикрепленной к зоопланктону), с использованием кюветного типа FRRf. Во-первых, мы оценили влияние субстратного зоопланктона (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) на базовую флуоресценцию и σ PSII, Fv/Fm, Fq'/Fm' и NPQNSV планктонного Colacium sp. Чтобы подтвердить эту методологию, мы записали фотофизиологические измерения прикрепленного Colacium sp. на S. mucronata и сравнили эти результаты с его планктонной стадией. Репрезентативные результаты показали, как протокол может определить влияние кальция (Ca) и марганца (Mn) на фотофизиологию Colacium sp. и идентифицировать различные эффекты обогащения Mn между прикрепленной и планктонной стадиями. Наконец, мы обсудим приспособляемость этого протокола к другим перифитным водорослям.

Не было выявлено значимого влияния исходной флуоресценции (рис. 5) или флуоресценции Chl-a (Рисунок 6) У S. mucronata до 5 особей (inds.) mL−1. Однако Fv/Fm и NPQNSV были значительно затронуты, когда S. mucronata составлял 7,5 inds·mL...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer at JoVE.com

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Флуорометр с высокой частотой повторения (FRRf) является полезным методом для измерения фотосистемы II фотофизиологии и первичной производительности. Здесь мы описываем протокол измерения PSII фотофизиологии эпизойных водорослей , Colacium sp. на субстратном зоопланктоне с использованием frRf кюветного типа.

Измерение фотофизиологии прикрепленной стадии Colacium sp. с помощью флуорометра с быстрой частотой повторения типа кюветы

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Этот протокол измеряет фотосинтетическую активность прикрепленных водорослей, в то время как они все еще прикрепляются к планктону, как и в природе. Основным преимуществом этого метода является то, что измерение фотофизиологии может быть выполнено в режиме реального времени без отвлечения образца. Чтобы изучить влияние особей зоопланктона на базовую флуоресценцию, приготовьте взрослую scapholeberis mucronata из культуры без каких-либо прикрепленных организмов.Теперь голодайте людей в FLW при 20 градусах Цельсия в течение не менее 90 минут, чтобы избежать флуоресценции от содержимого кишечника. Налейте 1,5 миллилитра FWL в кювету. Подберите нужное количество с.Мукронаты особей используют пипетку под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении и переносят их в кювету. Добавьте FLW, чтобы довести объем образца до 2-миллилитров и позволить ему акклиматизироваться при слабом освещении при 20 градусах Цельсия за 15 минут до быстрого измерения частоты повторения флуорометра. Затем нажмите «Действовать, чтобы запустить», чтобы начать измерение и повторить измерения более трех раз на образец.Считывание значения F0 с результирующего графика. Подберите виды колациума линькой панцирем с помощью пипетки под оптическим микроскопом при 100-кратном увеличении и промыть их FLW. Асептически инокулируют виды колациума в среде AF-6 в 10-миллилитровой стеклянной трубке на чистом стенде.Поддерживайте культуру при температуре NC2 в камере роста, осторожно встряхивая стеклянную трубку вручную, по крайней мере, один раз в день, чтобы предотвратить осаждение клеток. Чтобы изучить влияние особей зоопланктона на флуоресценцию хлорофилла из видов colacium, используйте взрослую s. mucronata без каких-либо прикрепленных организмов.Чтобы избежать флуоресценции содержимого кишечника, голодайте людей в FLW в течение не менее 90 минут. Установите флуорометр с быстрой частотой повторения типа кюветы. Теперь налейте 1,5 миллилитра субобразца предварительно культивируемых видов колациума в кювету.Затем переведите нужное количество особей s. mucronata в эти кюветы и доведите объем образца до 2-миллилитров с фильтрованной средой. Акклиматизируйте людей при слабом освещении при 20 градусах Цельсия в течение 15 минут, прежде чем проводить быстрое измерение частоты повторений флуорометра.Нажмите на акт, чтобы запустить», чтобы начать измерение, повторяя измерения более трех раз на образец. Считывание значений F0 и FM с результирующего графика. Чтобы скорректировать базовую флуоресценцию, фильтруйте культуральную среду с помощью фильтра размером 0,2 микрометра и измеряйте флуоресценцию.Вычтите F0 исходного образца из F0 и FM видов колация или измените значение пустой коррекции в настройках на вкладке опций. Изолируйте особей s. mucronata с видами colacium с помощью пипетки под оптическим микроскопом.Затем промыть s. mucronata с помощью FLW. Трансфер с.мукронаты вводят в 100-миллилитры FLW и сохраняют их в темных условиях при температуре NC2 в течение 90 минут для голодания. Налейте 1,5 миллилитра FLW в кювету. Перевод около десяти с.Особи мукроната с видами colacium в кювету и добавляют FLW, чтобы довести образец до 2-миллилитров. Акклиматизируйте особей при слабом освещении при температуре N2C в течение 15 минут и измеряйте флуоресценцию хлорофилла, как указано в тексте рукописи. Чтобы перечислить количество прикрепленных клеток, зафиксируйте образец с 2% глутаровым альдегидом после измерения скорости быстрого повторения флуорометра.Затем делайте снимки на нескольких фокусных глубинах и положениях s. mucronata под световым микроскопом. Не было выявлено значимого влияния на исходную флуоресценцию или флуоресценцию хлорофилла a по s.мукроната до 5 особей на миллилитр. Однако максимальная фотохимическая эффективность и нефотохимическая тушение были значительно затронуты, когда плотность s. mucronata составляла 7,5 особей на миллилитр.Сезонные изменения в фитофизиологии видов колациума на стадии присоединения и планктонной стадии для стационарной фазы в среде AF-6 показали сходную среднюю максимальную фотохимическую эффективность и нефотохимическое закалку. Для присоединенной стадии видов колациума в темных условиях не было выявлено существенной разницы в фотофизиологических параметрах, за исключением того, что нефотохимическое закалка для марганца выше, чем кальций через три часа, и при низкой интенсивности света через 21 час. Для планктонной стадии поперечное сечение поглощения PS2 было значительно ниже в марганце, чем обработка кальцием через три часа.Эффективная фотохимическая эффективность была значительно выше, но нефотохимическая закалка была ниже при обработке марганцем, чем контрольная через 21 час. При увеличении света марганец, как правило, уменьшал поперечное сечение поглощения PS2 через три часа, при нефотохимическом закалке через 21 час, одновременно увеличивая эффективную фотохимическую эффективность через три часа. Кальций незначительно улучшал нефотохимическое гашение при увеличении света.Однако это снизило эффективную фотохимическую эффективность через три часа. Самое главное – это действие субстратных организмов. Если водоросли прикреплены к разным видам или материалам, эффект может быть разным.В дополнение к этому протоколу, измерение фиксации углерода или скорости производства кислорода полезно для уточнения реакции продуктивности кальция на экспериментальные манипуляции. Этот протокол позволяет уточнить, как фотосинтетическая активность прикрепленных водорослей реагирует на изменения окружающей среды.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Подготовка нейронных культур от Midgastrula этапе эмбрионы дрозофилы

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Хроматин Иммунопреципитация Пробирной для тканеспецифические Гены использованием ранней стадии эмбрионы мыши

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Измерение Быстрые потоки кальция в кардиомиоциты

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Улучшение Шанс белка кристаллизации случайным Microseed Matrix скрининга

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

Функция контроля и морфология сосудистой Завербован факторов, секретируемых быстрорастущих опухолевых генерирующих клеток

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Один канал сотового прилагается патч-зажим записи

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Создание<em&gt; Enterobacter</em&gt; Зр. ЕГУ ауксотрофов Использование транспозонный мутагенез

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Цветочные DIP-трансформация льна (<em&gt; Linum Usitatissimum</em&gt;) Для создания трансгенных потомство с высоким трансформации Оценить

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...