Name: quantification of the potential impact of glyphosate-based products on microbiomes
Uploaded: 2022-01-10T14:00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Finlands Akademi (bevilling nr. 311077 til Marjo Helander).

Interessekonflikter: ingen.

Denne protokol indeholder generel vejledning i, hvordan man kvantificerer effekten af GBP på mikrobiomer baseret på analysen af EPSPS-proteinet. Protokollen har tre vigtige kritiske trin: (i) Kvantificering af EPSPS-proteinet fra mikrobiomdata. Dette trin er kritisk, fordi EPSPS er herbicidets direkte målenzym. Således kan arter, der har en kopi af EPSPS-genet, blive påvirket af brugen af GBP. Ikke desto mindre kan selv arter, der mangler en kopi af EPSPS-genet, blive påvirket af herbicidet gennem alternative ikke-målmekanismer43,44. (ii) Hvis analysen af EPSPS-genet ikke indgår i undersøgelsens design, er det muligt at få et godt skøn ved at analysere 16S rRNA (bakterier) eller ITS (svampe). I dette tilfælde er det vigtigt at basere sig på en omfattende referencetabel (f.eks. indeholder ATGC-databasen sekvenser af EPSPS-proteinet fra flere nært beslægtede arter). iii) EPSPS-proteinet er opdelt i potentielt følsomt eller resistent over for glyphosat afhængigt af visse aminosyrerester fra EPSPS' aktive sted. Mutationer, der påvirker en enkelt aminosyre, kan dog ændre denne klassifikation45, og overgange mellem klasser kan forekomme på relativt kort tid14.
Organismers potentielle følsomhed over for glyphosat kan bestemmes ved hjælp af referencegenomer, aminosyremarkører og sekvensjusteringer. i) Referencegenomer: EPSPS-enzymet kan klassificeres som potentielt følsomt (klasse I [alfa eller beta]46,47) eller resistent (klasse II 48,49, III50 og IV51) over for glyphosat på grundlag af tilstedeværelsen af aminosyremarkører og -motiver (for så vidt angår klasse III). Disse aminosyremarkører og motiver er baseret på placeringen af aminosyrerester i EPSPS-proteinet af Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III) og Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). ii) Aminosyremarkører: Glyphosat interagerer med EPSPS-enzymet og konkurrerer med phosphoenolpyruvat (PEP, EPSPS-enzymets andet substrat)52,53. Hos visse arter giver små aminosyreændringer i EPSPS-sekvensen en højere affinitet for PEP og en resistens over for glyphosat 12,14,52,54,55. I andre sekvenser binder glyphosat EPSPS-sekvensen i en ikke-hæmmende konformation 45. Selv om mange resistente 12,14,48,49,52,54,55 og tolerante 56,57 EPSP-sekvenser over for glyphosat er blevet beskrevet, er det nuværende klassificeringssystem for EPSPS opdelt i fire hovedklasser (I-IV)12 (tabel 5 ). (iii) Sekvensjusteringer: For at klassificere et EPSPS-enzym udførte vi parvise justeringer med et program med flere sekvensjusteringsprogram-standardparametre35-af forespørgselssekvensen mod hver enkelt af referencesekvenserne (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS og sdEPSPS). Disse justeringer er nødvendige for at identificere aminosyrermarkørernes positioner i forespørgselssekvensen. Som følge heraf klassificeres et enzym som beskreveti klasse I, II og/eller IV baseret på tilstedeværelsen af aminosyremarkører og klasse III-baserede motivmarkører.
Protokollen er baseret på fire kendte typer EPSPS: den ene type er følsom, de tre andre er resistente). Imidlertid er ca. 10 % af EPSPS-sekvenserne i prokaryoter endnu uklassificerede (16 % i arkæer og 8 % i bakterier)12. Således bør yderligere forskning analysere disse sekvenser for at bestemme glyphosatfølsomheden. EPSPSClass-serveren giver mulighed for at teste nye genetiske markører. Identifikationen af kendte klasser i EPSPS er ligetil, som vist i afsnit 4.4. og figur 5. I de tilfælde, hvor brugerne ønsker at sammenligne deres egne forespørgsels- og referenceproteiner, giver serveren desuden mulighed for manuelt at medtage en referencesekvens og et sæt aminosyremarkører (figur 11). Denne mulighed kan bruges til at identificere nye klasser af EPSPS samt til at teste andre herbicider og målsekvenser.
Analysen af EPSPS-klassen bestemmes ved sekvensanalyse og tilstedeværelsen/fraværet af aminosyremarkører. Dette er et foreløbigt skøn, der kan bruges til hypotesetest på området. Aminosyremarkører er blevet bestemt i litteraturen baseret på empiriske og observationsstudier 46,47,48,49,50,51. Referenceproteinsekvenser til bestemmelse af EPSPS-klassen er dog kun blevet testet i et begrænset antal arter og kan lejlighedsvis ikke forklare resistens over for glyphosat. Virkningen af kompenserende mutationer og EPSPS-associerede domæner (hovedsagelig i svampe) kan også påvirke følsomheden over for glyphosat58. Dette papirs analyse er baseret på fire EPSPS-klasser. En undersøgelse af bakterier i det humane tarmmikrobiom viste, at omkring 30 % af dem var uklassificerede (dvs. EPSPS-proteiner fra disse arter tilhører ikke nogen af de kendte klasser), og der er behov for yderligere undersøgelser for at identificere andre EPSPS-klasser. Det skal også bemærkes, at EPSPS-proteinsekvensen i bakterier og planter er unidomain, mens svampe-EPSPS-proteiner indeholder flere domæner59. Således kan en proteinfoldning i svampe føre til en anden reaktion fra EPSPS-enzymet på glyphosat. Desuden tages der ikke hensyn til yderligere resistensmekanismer, der ikke er mål (f.eks. effluxpumper og overekspression af EPSPS-genet 13) eller følsomhed over for glyphosat (f.eks. glyphosats virkning på mitokondrietransportkæden12).
Selvom GBP'er har eksisteret som et herbicid siden 1974 og er blevet udbredt siden 1991, er dette den første bioinformatikmetode til at bestemme organismers potentielle følsomhed over for glyphosat. Metoden er baseret på identifikation af kendte aminosyrerester i målsekvensen. Vores metode giver således et baseline estimat af glyphosats potentielle effekt på arten. I den nærmeste fremtid bør nye bioinformatikmetoder omfatte yderligere klasser af EPSPS-proteinet for at bestemme den potentielle følsomhed over for glyphosat af uklassificerede sekvenser 12,54,55. I betragtning af at EPSPS-enzymets nøjagtige opførsel kan variere efter enkelte aminosyreændringer 12,14,52,54,55, bør der yderligere i silico-forsøg tages hensyn til små variationer i foldningen af EPSPS-proteinet samt effekten af de EPSPS-associerede domæner på proteinstrukturen i svampe58 . Desuden har det vist sig, at tolerance over for glyphosat kan frembringes ved overekspression af EPSPS-proteinet56,57; således kan bioinformatikanalyser baseret på forbedring af kodonbrug60 anvendes til at identificere nye EPSPS-sekvenser, der maksimerer eller minimerer genekspression.
Landmænd, politikere og beslutningstagere har akut brug for en grundig forståelse af de risici, der er forbundet med den store brug af pesticider. Således er både bioinformatiske værktøjer, der afslører organismernes potentielle følsomhed over for pesticider og velreplikaterede, randomiserede og feltrealistiske eksperimentelle undersøgelser udført i forskellige miljøer, nødvendige. Den præsenterede bioinformatiske metode, der er designet til at undersøge organismers følsomhed over for glyphosat, kan moduleres for andre pesticider. Tilsvarende kan metoderne til eksperimentel økologi anvendes til at studere eventuelle relaterede økologiske spørgsmål. Sammen kan metoderne bruges til at demonstrere tab mellem feltobservationer, genomiske data og pesticidbrug. Alle præsenterede metoder er uvurderlige i risikovurderingen. Bioinformatiske metoder kan f.eks. anvendes til overvågning af mikrobielle tilpasninger til landbrugskemikalier og til at tilvejebringe en kvantitativ metode til at teste de potentielle andre tilknyttede risici, såsom en stigning i patogeners resistens over for landbrugskemikalier, negative virkninger på mikrober, der anvendes som biologiske bekæmpelsesmidler i integreret bekæmpelse af skadegørere (IPM), og antibiotikaresistens i bakterier.

Den store brug af pesticider i det moderne landbrug er helt klart en stor bidragyder til nedgangen i biodiversiteten1. Dette papir fokuserer på glyphosat, fordi glyphosatbaserede produkter (GBP'er) er blevet de mest anvendte pesticider globalt på grund af deres effektivitet og overkommelige pris 2,3. Ud over at dræbe ukrudt i landbrugsmarker anvendes GBP'er almindeligvis i silvikultur, bymiljøer og hjemmehaver; Desuden er de blevet erklæret for ugiftige for organismer uden for målgruppen, hvis de anvendes i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Et stigende antal nylige undersøgelser har imidlertid vist, at restkoncentrationer af glyphosat og dets nedbrydningsprodukter kan tilbageholdes og transporteres i jordbunden og derved have kaskadevirkninger på organismer uden for målgruppen 4,5,6,7,8 . Virkningerne af glyphosat er ikke kun begrænset til planter - shikimatvejen er også til stede i mange svampe og prokaryoter. Glyphosat er rettet mod enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsyntase (EPSPS) i shikimatvejen, også kendt som aroA9. Dette enzym er i centrum af shikimatvejen i syntesen af de tre essentielle aromatiske aminosyrer (phenylalanin, tyrosin og tryptofan), og det er til stede i de fleste prokaryoter, planter og svampe10,11. Nogle mikrobielle arter har udviklet delvis eller absolut resistens over for glyphosat ved hjælp af flere mekanismer, herunder mutationer i EPSPS-sekvenserne. Det er således blevet foreslået, at brugen af GBP'er kan have en direkte effekt på plante- og dyremikrobiomer, herunder det humane tarmmikrobiom 12,13,14. Ikke desto mindre kan anvendelsen af GBP have en negativ indvirkning på stort set alle økosystemtjenester og -tjenester, der er afhængige af mikrober og mikrobe-faciliterede processer. De deraf følgende trusler kan vedrøre biokemiske jordprocesser, bestøvningsbiologi og dyrs og menneskers trivsel. Dette kræver en mere omfattende forståelse af, hvordan glyphosat påvirker shikimatveje og metoder til at vurdere mikrobers følsomhed over for glyphosat.
I denne protokol præsenterer vi en pipeline til test af effekten af glyphosat og GBP på mikrobiomet, fra feltforsøg til bioinformatikanalyser. Vi beskriver i detaljer en nyligt offentliggjort bioinformatikmetode, der kan bruges til at bestemme organismers potentielle følsomhed over for glyphosat12. Så vidt forskerne ved, er dette det første og hidtil eneste bioinformatikværktøj til at vurdere enzymet EPSPS's iboende følsomhed over for den aktive komponent i GBP'er. Denne bioinformatikmetode er baseret på påvisning af kendte aminosyremarkører i glyphosatmålenzymet (EPSPS)12. Pipelinen er opdelt i fem hovedarbejdsfaser (figur 1): 1) en kort introduktion til to felteksperimenter for at teste effekten af GBP'er, 2) et kort resumé af mikrobiomanalyser (16S rRNA, ITS og EPSPS-gen ), 3) indsamling af EPSPS-sekvenser fra offentlige arkiver, 4) bestemmelse af organismers potentielle følsomhed over for glyphosat og 5) vurdering af EPSPS-klassen fra universelle mikrobielle markører (16S rRNA og ITS).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td >INVITEK Molecular</td>
			<td >1037100300</td>
			<td >Genomic DNA extraction from plant tissues</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dNTP mix (10 mM each)</td>
			<td >BIO-RAD</td>
			<td >1852196</td>
			<td>For PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GoTaq G2 DNA Polymerase kit</td>
			<td >Promega</td>
			<td >M7848</td>
			<td>PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Invisorb Spin Plant Mini Kit</td>
			<td >Agilent</td>
			<td>G2939B</td>
			<td>To check the concentration and quality of PCR products</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ion Chip Minifuge</td>
			<td >sage science</td>
			<td >PIP0001</td>
			<td>For size fractionation of PCR amplicons</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ion PGM System</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >4462921</td>
			<td>For targeted sequencing of microbial PCR products</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ion PGM Torrent Server</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >4483643</td>
			<td>For targeted sequencing of microbial PCR products</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pippinprep</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >4479672</td>
			<td>For targeted sequencing of microbial PCR products</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure tank</td>
			<td >Berthoud</td>
			<td >102140</td>
			<td>For sprayin glyphosate based products in field</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >R0192</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotary tiller</td>
			<td >Grillo</td>
			<td>984511</td>
			<td>For tilling the soil in experimental plots</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >S1000 ThermalCycler</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >Custom-made</td>
			<td>For PCR amplification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the potential impact of glyphosate-based products on microbiomes

Glyphosatbaserede produkter (GBP) er de mest almindelige bredspektrede herbicider på verdensplan. Målet for glyphosat er enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsyntase (EPSPS) i shikimatvejen, som er næsten universel i planter. Inhiberingen af enzymet stopper produktionen af tre essentielle aminosyrer: phenylalanin, tyrosin og tryptofan. EPSPS er også til stede i svampe og prokaryoter, såsom arkæer og bakterier; Anvendelsen af GBP kan således have en indvirkning på mikrobiomsammensætningen af jordbund, planter, planteædere og sekundære forbrugere. Denne artikel har til formål at præsentere generelle retningslinjer for vurdering af effekten af GBP på mikrobiomer fra feltforsøg til bioinformatikanalyser og give et par testbare hypoteser. To feltforsøg præsenteres for at teste GBP på organismer uden for målgruppen. For det første udtages og analyseres planterelaterede mikrober fra 10 replikerede kontrol- og GBP-behandlingsplotter, der simulerer no-till-beskæring. I det andet forsøg blev der opnået prøver fra forsøgsparceller befrugtet af enten fjerkrægødning indeholdende glyphosatrester eller ikke-behandlet kontrolgødning. Bioinformatikanalyse af EPSPS-proteinsekvenser anvendes til at bestemme mikrobernes potentielle følsomhed over for glyphosat. Det første skridt i estimeringen af effekten af GBP på mikrobiomer er at bestemme deres potentielle følsomhed over for målenzymet (EPSPS). Mikrobielle sekvenser kan opnås enten fra offentlige arkiver eller ved hjælp af PCR-forstærkning. I de fleste feltstudier er mikrobiomsammensætningen imidlertid blevet bestemt ud fra universelle DNA-markører såsom 16S rRNA og den interne transskriberede afstandslinje (ITS). I disse tilfælde kan følsomheden over for glyphosat kun estimeres gennem en sandsynlighedsanalyse af EPSPS-sekvenser ved hjælp af nært beslægtede arter. Kvantificeringen af organismers potentielle følsomhed over for glyphosat baseret på EPSPS-enzymet giver en robust tilgang til yderligere forsøg med henblik på at undersøge mål- og ikke-målresistente mekanismer.

Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en generel pipeline, fra feltforsøg til bioinformatikanalyser, der kvantificerer organismers potentielle følsomhed over for herbicidet glyphosat. I forsøg 2 var den gennemsnitlige glyphosatkoncentration i vagtelfoderet 164 mg/kg, og den gennemsnitlige glyphosatkoncentration af udskillelsesprøverne (urin og fækalt stof kombineret) var 199 mg/kg. Strøelse indsamlet fra vagtler fodret med GBP-forurenet foder havde i gennemsnit 158 mg/kg og kontrolstrøelse på 0,17 mg/kg glyphosat (tabel 3). I feltforsøgene reagerede plantearterne forskelligt på rester af glyphosat i jorden (afsnit 1). Biomasse af havre og majroer var større i kontroljord sammenlignet med GBP-behandlet jord. Fababønner og kartoffel syntes imidlertid at drage fordel af GBP-behandling i slutningen afvækstsæsonen 15. Glyphosat i fjerkrægødning reducerede plantevæksten i græs (Festuca pratensis) og jordbær (Fragaria x vescana) (afsnit 1). Mikrobiotaanalyserne fra feltforsøgene er endnu ikke fuldt analyseret og præsenteres ikke her (afsnit 2). Resultaterne af denne protokol giver, når de læses enten direkte (som vist i afsnit 3 og 4) eller indirekte (afsnit 5), et mål for andelen af potentielt følsomme og resistente organismer over for glyphosat i et datasæt (figur 9). Anvendelsen af denne metode blev testet med en samling EPSPS-proteinsekvenser fra mikrobielle arter af det centrale humane tarmmikrobiom, der blev opnået fra offentlige arkiver12. I undersøgelsen blev 890 stammer fra de 101 mest udbredte bakteriearter analyseret med EPSPSClass-metoden for at kvantificere andelen af følsomme og resistente bakterier. Resultaterne viste, at 54% af arterne i det centrale menneskelige tarmmikrobiom er potentielt følsomme over for glyphosat12. Denne tendens ses også i det meste af den prokaryote verden; Derudover er andelen af potentielt følsomme arter i eukaryoter (hovedsagelig planter og svampe) endnu højere12. Desuden har vi brugt denne metode til at kvantificere ændringer i følsomhed i EPSPS-proteinet på et mikrorevolutionært niveau (figur 10)14. Vi identificerede ændringer i følsomhedsstatus i 12 ud af 32 nært beslægtede grupper af analyserede prokaryoter (tabel 4)14. Således kan den kontinuerlige anvendelse af GBP'erne producere mikrobiel dysbiose (dvs. en ubalance mellem følsomme og resistente bakteriearter) i plante-, dyre- og jordmikrobiomer. Desuden er det blevet antaget, at en stigning i glyphosatresistente bakterier kan fremme multiresistente mikrobiomer 14,41,42. Denne protokol kaster således lys over fortolkningen af alle disse scenarier, da EPSPS-klassificeringsmetoden giver et direkte skøn over mikrobiomers iboende følsomhed over for glyphosat. På grund af EPSPS-proteinets iboende følsomhed over for glyphosat fylogenetisk konserveret14 er det muligt at ekstrapolere resultaterne fra eksisterende datasæt til ukendte mikrobiomer (figur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig01.jpg"> Figur 1: Generel pipeline Dette er en generel pipeline til analyse af følsomhed over for GBP fra felteksperimenter til bioinformatikanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig02.jpg"> Figur 2: Feltforsøg 1 for at teste virkningerne af GBP-rester på afgrødeplanterelaterede mikrober. Forsøgsfeltet består af skiftevis 10 kontrolparceller og 10 GBP behandlingsarealer (23 m x 1,5 m) med 1,5 m brækbånd mellem parceller. To gange om året siden 2014 blev GBP-plottene behandlet med kommercielle GBP (glyphosatkoncentration 450 g L-1, påføringshastighed 6,4 L ha-1 i 5 liter ledningsvand pr. Grund) og kontrolarealerne med samme mængde ledningsvand uden glyphosat. Behandlingerne blev påført med en håndbetjent trykbeholder ved hjælp af en plasthætte i sprinklerspidsen for at beskytte GBP'er mod at sprede sig uden for behandlingsplotterne. Efter en to-ugers sikkerhedsperiode efter GBP-ansøgningen blev havre (Avena sativa), fababønner (Vicia faba) og majroer (Brassica rapa subsp. oleifera) sået, og kartofler (Solanum tuberosum) blev plantet i grundene. Mikrobiotaprøver fra de undersøgte afgrødeplanter, blade og rødder, er blevet indsamlet flere gange siden forsøgets start i 2014. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig03.jpg"> Figur 3: Feltforsøg 2 testede konsekvenserne af GBP-rester i gødningsgødning for to flerårige afgrøder og deres tilhørende mikrobiota. Strøelse indsamlet fra et 12-måneders fugleforsøg med japanske vagtler fodret med kontrol eller GBP-forurenet foder blev brugt som gødningsgødning i et feltforsøg. Forsøgsfeltet bestod af 18 kontrol- og 18 GBP-plots (1 m x 1 m) arrangeret i et 6 x 6 skakbrætgitter. Sengetøjet blev spredt på forsøgsmarken to gange, i august 2018 og maj 2019 (25 L / plot). Kontrolplotter blev befrugtet med strøelse indsamlet fra vagtler fodret med kontrolfoder og GBP-tomter med strøelse fra vagtler fodret med GBP-forurenet foder. Rester af glyphosat i kontrolstrøelse var 0,17 mg/kg glyphosat, og i GBP-strøelse var mængden 158 mg/kg glyphosat. To endofytsymbiotiske (E+), to endofytfrie (E-) Festuca pratensis og to Fragaria x vescana blev plantet pr. grund i september 2018, cirka en måned efter spredningen af de første strøelser. Målinger af plantens ydeevne og egnethed samt prøveudtagning for rod- og bladassocieret mikrobiota blev udført i to på hinanden følgende vækstsæsoner (2019 & 2020). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig04.jpg"> Figur 4: Analyse af den mikrobielle taxa ved anvendelse af 16S rRNA-gen/ITS-region og mikrobiomers følsomhed over for glyphosat ved anvendelse af EPSPS-genet . (A) Analyse af 16S rRNA- eller ITS-sekvenser til identifikation af mikrobiel taxa. (B) Analyse af EPSPS-sekvenser for at identificere mikrobers følsomhed over for glyphosat (GS-glyphosatfølsom/GR-glyphosatresistent) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig05.jpg"> Figur 5: Algoritme til identifikation af klassen af EPSPS-proteinsekvenser. Indgangen er en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format. Algoritmen udfører sammenligninger med kendte aminosyremarkører i referenceproteinsekvenser, der bestemmer den potentielle følsomhed over for glyphosat. Algoritmen blev implementeret på den frit tilgængelige webserver EPSPSClass29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig06.jpg"> Figur 6: Grundlæggende indgange og udgange fra EPSPSClass-webserveren. A) Input: en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format. B) Output 1 - identitet: brøkdel af aminosyremarkører, der er til stede i forespørgselssekvenserne (klasse I-IV) og motiverne (klasse III). (C) Output 2 - identitet: justeringer af forespørgsels- og referencesekvenserne. (D) Output 3 - parvise justeringer af forespørgsels- og referencesekvenserne. E) EPSPS-referencesekvenser: Vibrio cholerae (vcEPSPS, klasse I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klasse II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klasse III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klasse IV). (F) Links til at udføre yderligere blastp-søgninger og identifikation af bevarede domæner <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig07.jpg"> Figur 7: Adgang til forudberegnede datasæt af EPSPS-sekvenser. Følg angivelserne i figuren for at få adgang til det forudberegnede datasæt for EPSPS-sekvenser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig08.jpg"> Figur 8: Eksempel på, hvordan man estimerer den potentielle følsomhed i mikrobiomprojekter uden EPSPS-sekvenser. Eksemplet bruger værdier fra databasen alignable Tight Genomic Clusters30, som indeholder sekvenser fra prokaryote arter. Hypotetiske arter fra et mikrobiomprojekt er Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci og Sulfolobus islandicus. Følsomhedsscoren for glyphosat beregnes som Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig09.jpg"> Figur 9: Skema for fortolkningen af resultaterne fra denne protokol og hypotetiske evolutionære scenarier. (A) I et mikrobiom er andelen af potentiel følsomhed (i grøn) og resistens (i rød) bakterier ca. 50:50. Sorte prikker betegner mikrobielle arter uklassificeret; således er deres følsomhed over for glyphosat ukendt. I nogle mikrobiomer er andelen af følsomme bakterier lidt højere, som i det humane tarmmikrobiom12. (B) Over tid kan brugen af glyphosat føre til mikrobiel dysbiose (dvs. en ubalance i andelen af følsomme og resistente bakterier), hvilket kan føre til forskellige hypotetiske scenarier. C) Hypotetisk tilfælde 1 (ingen udvælgelse): Anvendelsen af glyphosat påvirker ikke mikrobiomet; andelen af følsomme og resistente bakterier forbliver således konstant. D) Hypotetisk tilfælde 2: Anvendelsen af glyphosat fjerner bakterier, der er følsomme over for glyphosat, fra befolkningen. Vi spekulerer i, at dette scenario kan være dosisafhængigt. (E) Hypotetisk tilfælde 3: Selektionstryk fra brugen af glyphosat forstærker mutationer i EPSPS-genet , der ændrer bakteriernes følsomhedsstatus. Således bliver hele den mikrobielle befolkning resistent over for glyphosat. Desuden kan der i dette scenario være en stigning i multiresistente bakterier. F) Hypotetisk tilfælde 4: Anvendelsen af glyphosat ændrer sammensætningen af visse bakteriearter og skaber en ubalance over for resistente bakterier, mens nogle bakteriearter forbliver uændrede, muligvis på grund af yderligere resistente mekanismer såsom effluxpumper eller ved overekspression af EPSPS-genet 13. Dette scenarie kan også føre til en stigning i glyphosatresistente bakterier samt en stigning i bakterieresistens over for yderligere antibiotika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig09large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10v2.jpg"> Figur 10: Fordeling af den forventede følsomhed over for glyphosat på tværs af artstræet. Cirkeldiagrammer angiver andelen af arter, der formodes at være følsomme (grønne) eller resistente (røde) over for glyphosat og uklassificerede (sorte). Denne figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Rainio et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63109/63109fig10.jpg"> Figur 11: Input og output fra EPSPSClass-webserveren til test af brugerens egen referencesekvens. (A) Input 1: forespørgselssekvens. B) Indgang 2: referencesekvens. C) Input 3: aminosyremarkører i referencesekvenserne. D) Output: identitet: brøkdel af aminosyremarkører i forespørgselssekvenserne (klasse I-IV og brugerens egne referencesekvenser). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/63109fig10large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: Liste over primere til PCR-amplifikation af 16S rRNA-gen og ITS-region i mikrobiomanalyse <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%201-63109R2.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 2: Koder for enzymet 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsyntase (EPSPS) i forskellige databaser <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%202_63109R2.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 3: Gennemsnitlig glyphosatkoncentration <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%203-63109R2.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 4: Sammenfattende tabel over procentdelen af arter, der er følsomme/resistente over for glyphosat. Denne tabel er blevet tilpasset med tilladelse fra Rainio et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%204-63109R2.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 5: Aminosyrermarkørernes positioner i referencesekvenserne <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63109/Table%205-63109R2.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes at JoVE.com

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Glyphosatbaserede produkter (GBP) er de mest almindelige bredspektrede herbicider på verdensplan. I denne artikel introducerer vi generelle retningslinjer for at kvantificere effekten af GBP på mikrobiomer, fra feltforsøg til bioinformatikanalyser.

Kvantificering af den potentielle indvirkning af glyphosatbaserede produkter på mikrobiomer

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Her leverer vi en arbejdsgang, der inkluderer den bedste bioinformatikmetode til at udføre forsøgene for at vurdere effekten af glyphosat på mikrobiomer. Den største fordel er, at det giver en robust testbar hypotese til fremtidige felt- og laboratorieeksperimenter. Den beskrevne metode kan anvendes på en række forskellige systemer, herunder planter, dyr og mikrober.Hver del af metoden er ret ligetil. Måske er den mest udfordrende del at integrere et tværfagligt team, der er i stand til at udføre forskellige dele af arbejdet. Suni Matthew, en forsker fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren.Til at begynde med skal du starte eksperiment et ved at opdele forsøgsfeltet i 10 replikater af kontrol og GBP-behandling med bufferstrimler af vegetation mellem plottene. Behandl kontrolarealerne med postevand og GBP-plottene med kommerciel GBP for at efterligne den maksimalt tilladte dosering af glyphosat i landbrugspraksis. Prøve mikrobiota fra forsøgsplanter.Saml 10 replikater af planteprøverne fra marken, læg dem straks på is og bring dem til laboratoriet til videre behandling. Til forsøg to skal du samle strøelse, herunder træspåner, afføring og noget spildt foder fra vagtler fodret med GBP-forurenet eller kontrollere foder i et 12-måneders fugleforsøg. Send strøelsesprøverne til et akkrediteret laboratorium for glyphosatkoncentrationsmålingerne umiddelbart efter, at det er spredt.Plant flerårige græs- og jordbærplanter i hvert plot for at studere deres rod- og bladmikrobiota. Identificer og fjern de endofytiske mikrober ved at vaske og sterilisere planteprøverne. Når prøverne er steriliseret, ekstraherer genomisk DNA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt plante-DNA-ekstraktionssæt efter producentens protokol.Ved hjælp af en indlejret tilgang forstærkes de variable regioner V6 til V8 af 16S rRNA-genet og gør PCR-masterblanding for det krævede antal prøver som beskrevet i tekstmanuskriptet. Til den første runde af PCR skal du bruge primere 799 fremad og 1492 omvendt. Konfigurer forstærkningsprofilen i termocyklisten i 35 cyklusser.For at verificere forstærkning skal du udføre elektroforese ved hjælp af fem mikroliter forstærket produkt og derefter fortynde resten 25 mikroliter af PCR-produktet i autoklaveret ultrarent vand i forholdet mellem en og 10. Brug de universelle primere 1062 fremad og 1390 omvendt til at udføre den anden runde af forstærkning med 25 cyklusser. Fortynd de resulterende PCR-produkter i autoklaveret ultrarent vand i et lige forhold.Udfør den tredje runde af forstærkning med otte cyklusser for at mærke produkterne med stregkoderne og P1-adaptersekvensen. Kontroller koncentrationen i kvalitet af PCR-produkter på en bioanalytiker, og pool de mængder, der udgør 30 nanogram DNA af hver prøve i et 1,5 ml rør for at forberede et ækvamolært bibliotek. Vælg ampliconerne i størrelse 350 til 550 basepar efter størrelsesfraktionering ved hjælp af et automatiseret DNA-størrelsesvalgssystem på en agarosegelkassette.Saml eluten indeholdende ampliconer af den angivne størrelse i et hætteglas i kassetten, hvilket resulterer i et oprenset 16S rRNA-genbibliotek. Overfør det opsamlede eluent til et 1,5 ml rør og kontroller renheden og koncentrationen på bioanalysen. Fortynd DNA-biblioteket ved hjælp af autoklaveret ultrarent vand til en endelig koncentration på 26 picomolære.For at forstærke ITS-området skal du efter opsætning af reaktionen med ITS-primere indstille forstærkningsprofilen på termocyklisten. Analyser derefter fem mikroliter af det forstærkede produkt på 1,5% agarosegel og fortynd de resterende 25 mikroliter produkt i forholdet mellem en og 10 ved hjælp af autoklaveret ultrarent vand. Lav PCR-mastermix til det krævede antal prøver med stregkodemærkede fremadrettede primere og P1-adaptermærkede omvendte primere.Brug det fortyndede PCR-produkt som skabelon til at udføre den anden runde af forstærkning. I lighed med bibliotekets forberedelse til 16S rRNA-genet skal biblioteket forberedes til den rensede ITS-region. Igangsætte bioinformatikanalyserne af EPSPS-proteinsekvensen.Vurder forespørgselssekvensens potentielle følsomhed over for glyphosat fra serverens leverede output, hvor output et viser den brøkdel af aminosyremarkører, der er til stede i forespørgselssekvenserne, og antallet af motiver. Output to viser justeringer af forespørgsels- og referencesekvenserne baseret på restmarkører. Output tre viser fulde parvise justeringer af forespørgsels- og referencesekvenserne.Output fire viser EPSPS-referencesekvenser af Vibrio cholerae, Coxiella burnetii, Brevundimonas vesicularis og Streptomyces davawensis. I slutningen af outputsiden finder du links til eksterne værktøjer såsom BLASTp og bevarede domæner for yderligere at analysere forespørgsels-EPSPS-sekvensen. Når du har identificeret EPSPS-sekvenserne fra de offentlige registre, kan du få adgang til disse datasæt fra EPSPS-klasseserverens hovedside, der indeholder taksonomiske oplysninger, og EPSPS-klassen på over 50.000 sekvenser.Afvej planternes overjordiske biomasse i slutningen af marksæsonen for at sammenligne planternes vækst i GBP og kontrolarealer. I et regneark skal du kortlægge de bakterielle OTU'er til mikrobiomeeksperimenter i forudberegnede datasæt. Og baseret på en probabilistisk score beregnes den iboende følsomhed over for glyphosat.Denne metode blev brugt til at kvantificere ændringer i følsomheden i EPSPS-proteinet på et mikro evolutionært niveau. Vi identificerede ændringer i følsomhedsstatus i 12 ud af 32 nært beslægtede grupper af analyserede prokaryoter. Således kan de glyphosatbaserede produkters kontinuerlige anvendelse producere mikrobiel dysbiose i plante-, dyre- og jordmikrobiomer.Sørg for kvaliteten af præ- og post-PCR-procedurer for at opnå optimale ampliconbiblioteker. Sørg også for, at EPSPS-proteinsekvensen ikke er delvis, før du bruger softwaren. Ved feltforsøg skal du sørge for at forhindre forurening af kontroller med glyphosat.

Research

JoVE Journal

Environment

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

High-throughput Fluorometric Måling af Potentiel Jord Ekstracellulære enzymaktiviteter

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

Metoder til Lettere Mikrobiel vækst på cellulosefabrikken affaldsstrømme og karakterisering af Bionedbrydningspotentialet af Kulturperler Mikrober

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae

Kvantificering af tungmetaller og andre uorganiske forureninger på produktivitet mikroalger

Increasing demand for renewable fuels has researchers investigating the feasibility of alternative feedstocks, such as microalgae. Inherent advantages ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

En Duplex Digital PCR analyse for Samtidig Kvantificering af<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Og Human Fækal-associerede HF183 Marker i Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Forberedelse af DMMTAV og DMDTAV bruger DMAV for miljømæssige programmer: syntese, rensning og bekræftelse

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

Kvantificering af endogene Auxin og Cytokinin under internodium kultur af Ipecac

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

The Effect of the Application of Thyme Essential Oil on Microbial Load During Meat Drying

Effekten af anvendelsen af timian æteriske olie på mikrobielle belastning under kød tørring

Meat is a high protein meal that is used in the preparation of jerky, a popular food snack, where preservation and safety are important. To assure food ...

The Hawaii Protocol for Scientific Monitoring of Coffee Berry Borer: a Model for Coffee Agroecosystems Worldwide

Hawaii protokol for videnskabelig overvågning af kaffe bær soegeren: en Model for kaffe Agroecosystems hele verden

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at ...

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Kemiske Isolation, kvantificering og adskillelse af huden lipider fra krybdyr

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Xylem vand distribution i woody planter visualiseret med en Cryo-scanning elektronmikroskop

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...