Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

يود المؤلفون أن ينوه بالمجلس الهندي للبحوث الطبية (ICMR; ITR-2020-2882) لتمويل الدعم المقدم إلى الدكتور نيرمال ج. نود أيضا أن نشكر منحة الجامعة للجنة على توفير زمالة بحثية مبتدئة لمانيشا مالاني ومرفق المختبرات التحليلية المركزي ، BITS-Pilani ، حرم حيدر أباد لتوفير مرافق البنية التحتية.

يتبع هذا البروتوكول جميع إرشادات رعاية الحيوان التي تقدمها لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية ، BITS-Pilani ، حرم حيدر أباد.
1. أنسجة الشبكية
<ol><li>استئصال العين وتثبيتها<ol>
<li>القتل الرحيم لفأر ويستار الذكر المصاب بالسكري من 2 إلى 3 أشهر جنبا إلى جنب مع التحكم المطابق للعمر (14...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathophysiology+and+treatments.">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats.">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li><li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

علم الأنسجة يتم إجراء علم الأنسجة الشبكية لتصور التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية وطبقاتها. يجب تحسين العديد من الخطوات ، بما في ذلك اختيار الحل المثبت ، ومدة التثبيت ، والجفاف ، وتشريب البارافين. يجب ألا يتجاوز حجم الأنسجة 3 مم ، حيث يصبح الاختراق المثبت بطيئا. يؤدي البارفو?...

اعتلال الشبكية السكري (DR) هو واحد من أكثر المضاعفات الثانوية تعقيدا لمرض السكري. كما أنه السبب الرئيسي للعمى الذي يمكن الوقاية منه بين السكان في سن العمل في جميع أنحاء العالم. في تحليل تلوي حديث ل 32.4 مليون شخص كفيف ، كان 830،000 شخص (2.6٪) مكفوفين بسبب DR1. احتلت نسبة فقدان البصر المنسوبة إلى مرض السكري المرتبة السابعة في عام 2015 بنسبة 1.06٪ (0.15-2.38) على مستوى العالم2,3.
يتم تشخيص اعتلال الشبكية السكري عن طريق تشوهات الأوعية الدموية في أنسجة العين الخلفية. سريريا ، ينقسم إلى مرحلتين - DR غير التكاثري (NPDR) و DR التكاثري (PDR) ، بناء على الأوعية الدموية في شبكية العين. يعتبر ارتفاع السكر في الدم المنظم القوي ل DR لأنه ينطوي على العديد من المسارات المشاركة في التنكس العصبي4,5 والالتهاب 6,7 والأوعية الدموية الدقيقة8 في شبكية العين. تشمل المضاعفات الأيضية المتعددة الناجمة عن ارتفاع السكر في الدم تراكم المنتجات النهائية المتقدمة للغليكاتيون (AGEs) ، ومسار البوليول ، ومسار الهيكسوسامين ، ومسار بروتين كيناز-سي. هذه المسارات مسؤولة عن تكاثر الخلايا (الخلايا البطانية) ، والهجرة (pericytes) ، وموت الخلايا المبرمج (خلايا الشبكية العصبية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا البطانية) بناء على مراحل مختلفة من اعتلال الشبكية السكري. يمكن أن تؤدي هذه التغيرات الأيضية إلى تغيرات فسيولوجية مثل انفصال الشبكية ، وفقدان خلايا الشبكية ، وانهيار حاجز الدم والشبكية (BRB) ، وتمدد الأوعية الدموية ، وتكوين الأوعية الدموية9.
مرض السكري من النوع 1 الناجم عن الستربتوزوتوسين (STZ) هو ممارسة راسخة ومقبولة جيدا في الفئران لتقييم التسبب في مرض السكري ومضاعفاته. ترجع الآثار السكرية ل STZ إلى التدمير الانتقائي لخلايا جزيرة البنكرياس β 10. ونتيجة لذلك ، ستخضع الحيوانات لنقص الأنسولين ، وارتفاع السكر في الدم ، و polydipsia ، و polyuria ، وكلها خصائص لمرض السكري من النوع 1 البشري11. بالنسبة لتحريض مرض السكري الحاد ، يتم إعطاء STZ عند 40-65 مجم / كجم من وزن الجسم عن طريق الوريد أو داخل الصفاق خلال مرحلة البلوغ. بعد حوالي 72 ساعة ، تقدم هذه الحيوانات مستويات الجلوكوز في الدم أكبر من 250 ملغ / ديسيلتر 10,12.
لفهم التغيرات الفسيولوجية في شبكية العين بسبب التنكس العصبي والالتهابات وتكوين الأوعية الدموية ، يجب تحسين التقنيات المختلفة في النماذج الحيوانية التجريبية. يمكن دراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في خلايا الشبكية وأوعية الشبكية من خلال تقنيات مختلفة مثل علم الأنسجة وفحص انهيار BRB وتصوير الأوعية الفلورية.
يتضمن علم الأنسجة دراسة تشريح الخلايا والأنسجة والأعضاء على المستوى المجهري. وهو ينشئ علاقة بين بنية ووظيفة الخلايا / الأنسجة. يتم تنفيذ عدة خطوات لتصور وتحديد التغيرات المجهرية في بنية الأنسجة ، وبالتالي مقارنة النظراء الأصحاء والمريضين 13. وبالتالي ، من الضروري توحيد كل خطوة من خطوات علم الأنسجة بدقة. الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها علم أنسجة الشبكية هي تثبيت العينة ، وتقليم العينة ، والجفاف ، وإزالة ، والتشريب بالبارافين ، وتضمين البارافين ، والتقسيم ، والتلطيخ (تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين) 13،14.
في شبكية العين السليمة ، يتم التحكم في نقل الجزيئات عبر شبكية العين بواسطة BRB ، الذي يتكون من الخلايا البطانية والخلايا المحيطة على الجانب الداخلي ، والخلايا الظهارية الصباغية الشبكية على الجانب الخارجي. ومع ذلك ، تبدأ الخلايا البطانية BRB الداخلية والخلايا المحيطة في التدهور أثناء الحالة المريضة ، كما أن BRB معرض للخطر أيضا15. بسبب هذا الانهيار BRB ، تتسرب العديد من جزيئات الوزن الجزيئي المنخفض إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية 16. مع تقدم المرض ، تتسرب العديد من جزيئات البروتين الأخرى (الوزن الجزيئي المنخفض والمرتفع) أيضا إلى الأنسجة الزجاجية والشبكية بسبب اضطراب التوازن 17. يؤدي إلى مضاعفات أخرى مختلفة وفي نهاية المطاف وذمة بقعية وعمى. وبالتالي ، فإن تحديد مستويات البروتين في الجسم الزجاجي ومقارنة الحالات الصحية والسكري يضر بمقاييس BRB.
تصوير الأوعية الفلورية هو تقنية تستخدم لدراسة الدورة الدموية للشبكية والمشيمية باستخدام صبغة الفلورسنت. يتم استخدامه لتصور الأوعية الدموية في شبكية العين والمشيمية عن طريق حقن صبغة الفلوريسين عبر الوريد أو حقن القلب18. بمجرد حقن الصبغة ، تصل أولا إلى شرايين الشبكية ، تليها أوردة الشبكية. عادة ما يتم الانتهاء من هذا الدوران للصبغة في غضون 5 إلى 10 دقائق من حقن الصبغة19. إنها تقنية مهمة لتشخيص مختلف أمراض العين في الجزء الخلفي، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري والأوعية الدموية الجديدة المشيمية20. يساعد على اكتشاف التغيرات الرئيسية والثانوية في الأوعية الدموية في الحالات الطبيعية والمريضة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

يغير مرض العين في الجزء الخلفي مثل اعتلال الشبكية السكري فسيولوجيا الشبكية. يتميز اعتلال الشبكية السكري بانفصال الشبكية ، وانهيار حاجز الشبكية الدموي (BRB) ، وتكوين الأوعية الدموية في الشبكية. نموذج الفئران في الجسم الحي هو أداة تجريبية قيمة لدراسة التغيرات في بنية ووظيفة شبكية العين. نقترح ثلاث تقنيات تجريبية مختلفة في نموذج الفئران لتحديد التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية ، والأوعية الدموية الشبكية ، و BRB المعرضة للخطر. يستخدم علم أنسجة الشبكية لدراسة مورفولوجيا خلايا الشبكية المختلفة. أيضا ، يتم إجراء القياس الكمي عن طريق عدد خلايا الشبكية وقياس سمك طبقات الشبكية المختلفة. يستخدم اختبار انهيار BRB لتحديد تسرب البروتينات خارج العين من البلازما إلى الأنسجة الزجاجية بسبب انهيار BRB. يستخدم تصوير الأوعية الدموية الفلوري لدراسة تولد الأوعية الدموية وتسرب الأوعية الدموية عن طريق تصور الأوعية الدموية في الشبكية باستخدام صبغة FITC-dextran.

أنسجة الشبكية في شبكية العين السكرية ، تخضع خلايا الشبكية للتنكس. بالإضافة إلى ذلك ، يزداد سمك طبقات الشبكية بسبب الوذمة 22. يمكن استخدام الصور التي تم الحصول عليها بعد تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين لعدد الخلايا وقياس سمك الطبقات المختلفة ، كما هو موضح في <strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

اعتلال الشبكية السكري هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى. تعد الأنسجة وفحص انهيار الحاجز الدموي والشبكية وتصوير الأوعية الفلورية تقنيات قيمة لفهم الفيزيولوجيا المرضية للشبكية ، والتي يمكن أن تعزز الفحص الفعال للأدوية ضد اعتلال الشبكية السكري.

التقييم الفسيولوجي المرضي للشبكية في نموذج الفئران

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

الهدف العام من هذه التقنيات هو تقييم الفيزيولوجيا المرضية للشبكية في نموذج اعتلال الشبكية السكري الناجم عن الستربتوزوتوسين. اعتلال الشبكية السكري هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى. يستمر البحث المستمر لاكتشاف العوامل الدوائية ذات الفعالية الأفضل والعمل الأطول لعلاج اعتلال الشبكية السكري.تلعب عملية اكتشاف العوامل الدوائية في النماذج الحيوانية قبل السريرية دورا حيويا. تساعد هذه النماذج الحيوانية على فهم التغيرات الهيكلية والوظيفية لأنسجة الجزء الخلفي من العين. لذلك ، سنعرض ثلاث تقنيات مختلفة لدراسة هذه التغييرات في مشكلات الجزء الخلفي.نحن نعرض علم الأنسجة لدراسة التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية في الطبقات ، وفحص انهيار BRB لدراسة BRB المخترق عن طريق تحديد كمية البروتين المتسرب في الجسم الزجاجي من البلازما ، وكذلك تصوير الأوعية الدموية الفلورية لتصور الأوعية الدموية الشبكية باستخدام صبغة FITC-dextran. القتل الرحيم للفئران باستخدام جرعة عالية من البنتوباربيتال وتأكيد وفاته مع عدم وجود نبضات قلب يمكن اكتشافها. استئصال العين عن طريق إجراء شقوق باستخدام شفرة مشرط على المناطق الأنفية والصدغية من العين.ثم قطع على طول حوافه لإزالة العين من المقبس المداري. إزالة الدهون الزائدة المحيطة بالعين ووضعها في 5 مل من محلول مثبت. احتضان العين في محلول مثبت لمدة 24 إلى 48 ساعة.بعد التثبيت ، قم بإزالة العين من المحلول المثبت ونقلها إلى طبق بتري مملوء ب 10 مل PBS. باستخدام ملقط صغير ، امسك العين بالعصب البصري واصنع في pars plana بمساعدة مقص صغير. قطع من خلال كامل هامش القرنية لفصل الكوب الأمامي وكوب العين الخلفي.قم بإزالة العدسة وقطع العصب البصري. قطع الكوب الخلفي إلى نصفين ، مرورا بالعصب البصري. انقل كل نصف إلى أشرطة كاسيت منفصلة.تجفيف الأنسجة عن طريق زيادة تركيز الإيثانول تدريجيا من 50٪ إلى 100٪ من الإيثانول. وأخيرا ، قم بمسح الإيثانول باستخدام الزيلين. تشريب الأنسجة بالبارافين المسخن مسبقا عند 60 درجة مئوية ليحل محل الزيلين في الأنسجة.تحضير كتل البارافين باستخدام قالب فولاذي للحفاظ على الأنسجة والكاسيت كقاعدة لها. أثناء تحضير الكتلة ، يجب أن يواجه جزء القرص البصري من العين الجزء السفلي من القالب الفولاذي. املأ الكاسيت بالبارافين وانقله إلى سطح بارد.قم بتركيب الشفرة والكاسيت على الحاملات المعنية على الميكروتوم. باستخدام ميكروتوم ، قم بتقليم شمع البارافين الزائد وقص شريطا من خمسة إلى ستة أقسام بسماكة 5 ميكرومتر. انقل الشريط إلى سطح الحمام المائي الذي تم تسخينه مسبقا لكشف الشريط.اجمع الأقسام على شريحة زجاجية مغلفة بالألبومين. اترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. لأداء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين ، قم بتسخين الشرائح مسبقا عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لإذابة البارافين.اتبع إجراء التلطيخ كما هو موضح في المخطوطة. ابدأ بإماهة الأنسجة ، ثم تلطخ بالهيماتوكسيلين متبوعا باليوسين. الآن ، جفف الأنسجة وأضف وسط التركيب على الأقسام.ضع زلة الغطاء على الأقسام وتصورها تحت المجهر الضوئي. لإجراء فحص انهيار حاجز الدم والشبكية ، قم بتخدير الفئران باستخدام الكيتامين والزيلازين وتأكيد حالة التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم. حدد موقع القلب وأدخل حقنة 1 مل مع إبرة قياس 24 لسحب الدم عن طريق ثقب القلب.بمجرد جمع الدم الكافي ، قم بنقله إلى أنبوب مغلف ب EDTA. امزجه بلطف لمنع انحلال الدم. قم بتحريك العين ونقلها على الفور إلى الثلج الجاف.في ظل الظروف المجمدة ، ابدأ تشريح العين عن طريق إزالة القرنية والعدسة. اسحب الجسم الزجاجي من الجزء الخلفي من العين باستخدام ملقط دون أي تلوث من شبكية العين. نقله إلى أنبوب التجانس مع ثلاثة إلى أربعة خرزات.تجانس العينات باستخدام مجانس الخرز بسرعة متوسطة لمدة 10 ثوان. نقل عينات الدم والفكاهة الزجاجية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لمزيد من المعالجة. الطرد المركزي لكل من العينات في 5،200 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 250 ميكرولتر من كاشف برادفورد إلى الآبار. تمييع العينات الزجاجية 10 مرات وعينات البلازما 20 مرة باستخدام PBS. أضف 5 ميكرولترات من العينات المخففة إلى كاشف برادفورد واخلطها جيدا.احتضن العينات لمدة 20 إلى 30 دقيقة، ثم قم بقياس الامتصاص عند 590 نانومتر باستخدام قارئ صفائح 96 بئرا. كثافة العينة تتناسب طرديا مع تركيز البروتين. لإجراء تصوير الأوعية الفلورية ، قم بتخدير الفئران باستخدام 3٪ isoflurane وتأكيد حالة التخدير عن طريق لكمة إصبع القدم.اغمس الذيل في الماء الدافئ قبل حقن الصبغة. حقن 1 مل من 50 ملغ لكل مل FITC-dextran محلول في الوريد الذيل الجانبي. اترك الصبغة تدور لمدة 5 إلى 10 دقائق.القتل الرحيم للفئران باستخدام pentobarbital وتأكيد وفاته عن طريق عدم وجود نبضات قلب يمكن اكتشافها. قم بتحريك العين والمضي قدما في إعداد التثبيت المسطح. لتحضير حامل مسطح للشبكية ، ضع العين على كيمويب خال من الألياف واقطع الجزء الأمامي من العين.اسحب العدسة ببطء ، إلى جانب الفكاهة الزجاجية ، من الجزء الخلفي من العين. انقل الجزء الخلفي إلى طبق بتري مملوء ب PBS واقطع العصب البصري. الآن ، ضع طرف الملقط المدبب بين الصلبة والشبكية.حركه برفق على طول حافة الكأس للتأكد من أن شبكية العين غير متصلة بالصلبة في أي وقت. قطع بالقرب من القرص البصري ، بحيث تنفصل شبكية العين تماما عن الصلبة. بمجرد التأكد من أن شبكية العين غير متصلة بالصلبة من أي جانب ، ادفعها ببطء إلى محلول PBS.بمساعدة ملقط ، انقل شبكية العين إلى شريحة زجاجية نظيفة دون التسبب في أي ضرر لها. باستخدام مقص صغير أو شفرة مشرط ، قم بإجراء أربعة جروح على شبكية العين ، كما هو موضح ، لتقسيمها إلى أربعة أرباع. أزل PBS الزائد من محيط الشبكية وأضف وسط تركيب مضاد للتلاشي على حامل الشبكية المسطح.قم بتغطيته بغطاء وتصور الحامل المسطح تحت المجهر البؤري. من المهم أن نلاحظ هنا أن العملية الكاملة لتصوير الأوعية الدموية الفلورية يتم إجراؤها تحت الحد الأدنى من الضوء لتجنب إخماد التألق من صبغة FITC-dextran. في الفئران المصابة بالسكري ، تخضع خلايا الشبكية للتنكس ، مما يؤدي إلى مزيد من المضاعفات.يمكن تصور هذه التعديلات الهيكلية بواسطة تقنية علم الأنسجة لتحديد عدد الخلايا وسماكة شبكية العين. في حالة الفئران المصابة بالسكري ، يزداد سمك طبقات الشبكية بسبب الوذمة. وبالتالي ، تساعد هذه التقنية على فحص مختلف العوامل الدوائية المحتملة لعلاج اعتلال الشبكية السكري.التغيرات الأيضية في شبكية العين بسبب مرض السكري تسبب فقدان pericytes وانهيار حاجز الدم في شبكية العين. نظرا لوجود تسرب للبروتين والجزيئات الحيوية الأخرى إلى شبكية العين والجسم الزجاجي ، تزداد مستويات البروتين الكلي في الجسم الزجاجي للفئران السكرية. يمكن أن يؤدي منع انهيار الحاجز الدموي الشبكي إلى إعاقة تقدم اعتلال الشبكية السكري بشكل كبير.في اعتلال الشبكية السكري ، يزيد التعبير عن عامل النمو البطاني الوعائي الذي يؤدي إلى تكوين أوعية جديدة. هذه الأوعية تزعج بنية الشبكية الطبيعية ، وبالتالي فإن تعصيبها هو مصدر قلق أساسي لعلاج اعتلال الشبكية السكري. يتم استخدام تقنية تصوير الأوعية الدموية الفلورية لتصور الأوعية الدموية الجديدة وكذلك تسرب الأوعية الدموية ، كما هو موضح هنا.ومع ذلك ، فإن تكوين الأوعية الدموية بارز فقط بعد ستة إلى 12 شهرا من تحريض مرض السكري. تساعدنا هذه التقنية على تحديد تأثير العلاج بالعقاقير على تعصيب تولد الأوعية الدموية وتسرب الأوعية الدموية. يحتاج العلاج المستقبلي لاعتلال الشبكية السكري إلى عوامل دوائية أكثر كفاءة ، ولكن لا يمكن تحقيق العلاجات المستقبلية إلا من خلال فهم أفضل للإمراض المرضية.يمكن أن يساعد إتقان هذه التقنيات الباحثين على الحصول على فهم أفضل حول التسبب في اعتلال الشبكية السكري ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف تدخلات دوائية أفضل.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

نموذج من تسريب المغذيات المزمنة في الفئران

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

تقييم-التسلل ورم خلايا الدم البيضاء مجموعات فرعية في ورم تحت الجلد نموذج

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

الكمية قاع العين تألق ذاتي لتقييم أمراض الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

الإجراءات في يحفز الزرق<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج الفأر وجبل لالجامع إعداد الشبكية

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

تقييم التنظيم التلقائي لتدفق الدم الدماغي في الفئران باستخدام الليزر دوبلر الجريان

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

تقييم قياسي للفزة الهيستومترية لهشاشة العظام في نموذج الماوس الجراحي

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

الأكسجين الناجم عن نموذج اعتلال الشبكية لأمراض الشبكية الإقفاري في القوارض

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

الوخز بالإبر في نموذج الفئران من الربو

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

زرع ظهارة صبغة الشبكية في نموذج الرئيسيات غير البشرية لأمراض الشبكية التنكسية

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

تقييم إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج ماوس متلازمة المبيض المتعدد الكيسات

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...