Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Forfattere vil gerne anerkende Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) til finansiering af støtte til Dr. Nirmal J. Vi vil også gerne takke University Grant of Commission for at give Junior Research Fellowship til Manisha Malani og Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus for at levere infrastrukturelle faciliteter.

Denne protokol følger alle retningslinjerne for dyrepleje fra Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad campus.
1. Retinal histologi
<ol><li>Enukleation og fiksering af øjet<ol>
<li>Aflive en 2 til 3 måneder gammel diabetisk Wistar hanrotte sammen med den aldersmatchede kontrol (14 til 15 uger gammel) ved hjælp af en høj dosis pentobarbital (150 mg / kg) injiceret gennem intraperitonealvejen. Intet påviseligt hjerteslag bekræfter dødsfaldet inden ...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathophysiology+and+treatments.">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats.">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li><li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Histologi Retinal histologi udføres for at visualisere de morfologiske ændringer af retinale celler og lag. Forskellige trin, herunder valg af fikseringsopløsning, fikseringsvarighed, dehydrering og paraffinimprægnering, skal optimeres. Vævsstørrelsen må ikke overstige 3 mm, da den fikserende penetration bliver langsom. Det almindeligt anvendte 4% paraformaldehyd fører til nethindeløsning selv i det sunde øje på grund af opløsningens relativt høje osmolaritet sammenlignet med vandig humor...

Diabetisk retinopati (DR) er en af de mest komplekse sekundære komplikationer af diabetes mellitus. Det er også den førende årsag til forebyggelig blindhed i befolkningen i den erhvervsaktive alder verden over. I en nylig metaanalyse af 32,4 millioner blinde var 830.000 (2,6 %) blinde på grund af DR1. Andelen af synstab, der tilskrives diabetes, rangerede syvende i 2015 på 1,06% (0,15-2,38) globalt2,3.
Diabetisk retinopati diagnosticeres ved vaskulære abnormiteter i det bageste okulære væv. Klinisk er det opdelt i to faser - Ikke-proliferativ DR (NPDR) og Proliferativ DR (PDR), baseret på vaskularisering i nethinden. Hyperglykæmi betragtes som den potente regulator af DR, da det implicerer flere veje involveret i neurodegeneration4,5, inflammation6,7 og mikrovaskulatur8 i nethinden. Flere metaboliske komplikationer induceret på grund af hyperglykæmi omfatter akkumulering af avancerede glykationsslutprodukter (AGE'er), polyolvej, hexosaminvej og proteinkinase-C-vej. Disse veje er ansvarlige for celleproliferation (endotelceller), migration (pericytter) og apoptose (neurale retinale celler, pericytter og endotelceller) baseret på forskellige stadier af diabetisk retinopati. Disse metaboliske ændringer kan føre til fysiologiske ændringer såsom nethindeløsning, tab af retinale celler, nedbrydning af blod-retinal barrieren (BRB), aneurismer og angiogenese9.
Streptozotocin (STZ) induceret type 1-diabetes er en veletableret og velaccepteret praksis hos rotter til evaluering af diabetespatogenese og dens komplikationer. Diabetogene virkninger af STZ skyldes selektiv destruktion af bugspytkirteløen β-celler10. Som følge heraf vil dyrene gennemgå insulinmangel, hyperglykæmi, polydipsi og polyuri, som alle er karakteristiske for human type 1-diabetes mellitus11. Ved svær diabetesinduktion administreres STZ ved 40-65 mg/kg legemsvægt intravenøst eller intraperitonealt i voksenalderen. Efter ca. 72 timer har disse dyr et blodsukkerniveau på over 250 mg/dL10,12.
For at forstå de fysiologiske ændringer i nethinden på grund af neurodegeneration, betændelse og angiogenese bør forskellige teknikker optimeres i eksperimentelle dyremodeller. Strukturelle og funktionelle ændringer i retinale celler og retinale kar kan studeres ved forskellige teknikker såsom histologi, BRB nedbrydning assay, og fluorescens angiografi.
Histologi indebærer undersøgelse af anatomien af celler, væv og organer på mikroskopisk niveau. Det etablerer en sammenhæng mellem strukturen og funktionen af celler / væv. Der udføres flere trin for at visualisere og identificere de mikroskopiske ændringer i vævsstrukturen og derved sammenligne sunde og syge modstykker13. Derfor er det vigtigt at standardisere hvert trin i histologi omhyggeligt. Forskellige trin involveret i retinal histologi er fiksering af prøven, trimning af prøven, dehydrering, clearing, imprægnering med paraffin, paraffinindlejring, sektionering og farvning (Hæmatoxylin og Eosin farvning)13,14.
I en sund nethinde styres transporten af molekyler over nethinden af BRB, der består af endotelceller og pericytter på indersiden og retinale pigmentepitelceller på ydersiden. Imidlertid begynder indre BRB-endotelceller og pericytter at degenerere under den syge tilstand, og BRB kompromitteres også15. På grund af denne BRB-nedbrydning lækker mange molekyler med lav molekylvægt ind i glasagtigt og retinalt væv16. Efterhånden som sygdommen skrider frem, lækker mange andre proteinmolekyler (lav og høj molekylvægt) også ind i glas- og retinalvæv på grund af homeostaseforstyrrelse17. Det fører til forskellige andre komplikationer og i sidste ende makulært ødem og blindhed. Derfor, kvantificere proteinniveauerne i glaslegemet og sammenligne sunde og diabetiske tilstande foranstaltninger kompromitteret BRB.
Fluorescensangiografi er en teknik, der bruges til at studere blodcirkulationen i nethinden og choroid ved hjælp af fluorescerende farvestof. Det bruges til at visualisere vaskulatur i nethinden og choroid ved at injicere fluoresceinfarvestof via intravenøs vej eller hjerteinjektion18. Når farvestoffet er injiceret, når det først retinale arterier, efterfulgt af retinale vener. Denne cirkulation af farvestof afsluttes normalt inden for 5 til 10 minutter fra injektionen af farvestof19. Det er en vigtig teknik til at diagnosticere forskellige posterior segment okulære sygdomme, herunder diabetisk retinopati og choroidal neovaskularisering20. Det hjælper med at opdage større og mindre vaskulaturændringer i normale og syge forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

En bageste segment øjensygdom som diabetisk retinopati ændrer nethindens fysiologi. Diabetisk retinopati er kendetegnet ved en retinal løsrivelse, nedbrydning af blod-retinal barrieren (BRB) og retinal angiogenese. En in vivo rottemodel er et værdifuldt eksperimentelt værktøj til at undersøge ændringerne i nethindens struktur og funktion. Vi foreslår tre forskellige eksperimentelle teknikker i rottemodellen til at identificere morfologiske ændringer af retinale celler, retinal vaskulatur og kompromitteret BRB. Retinal histologi bruges til at studere morfologien af forskellige retinale celler. Kvantitativ måling udføres også ved retinal celletælling og tykkelsesmåling af forskellige retinale lag. Et BRB-nedbrydningsassay bruges til at bestemme lækage af ekstraokulære proteiner fra plasmaet til glasagtigt væv på grund af nedbrydning af BRB. Fluorescensangiografi bruges til at studere angiogenese og lækage af blodkar ved at visualisere retinal vaskulatur ved hjælp af FITC-dextran farvestof.

Retinal histologi I diabetisk nethinden gennemgår retinale celler degeneration. Derudover øges tykkelsen af nethindelagene på grund af ødem22. De billeder, der er opnået efter hematoxylin- og Eosinfarvning, kan bruges til celletal og måling af tykkelsen af forskellige lag, som vist i figur 2 ved hjælp af ImageJ.
Blod-retinal barriere nedbrydning assay Da BRB er kompromitteret hos diabetiske rot...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Diabetisk retinopati er en af de førende årsager til blindhed. Histologi, blod-retinal barriere nedbrydning assay og fluorescens angiografi er værdifulde teknikker til at forstå nethinden patofysiologi, hvilket yderligere kan forbedre den effektive lægemiddelscreening mod diabetisk retinopati.

Retinal patofysiologisk evaluering i en rottemodel

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Det overordnede mål med disse teknikker er at evaluere retinal patofysiologi i streptozotocin-induceret diabetisk retinopati rottemodel. Den diabetiske retinopati er en af de førende årsager til blindhed. Den kontinuerlige søgning foregår for at opdage farmakologiske midler med bedre effekt og længere virkning til behandling af diabetisk retinopati.Processen med at opdage farmakologiske agenser i prækliniske dyremodeller spiller en afgørende rolle. Disse dyremodeller hjælper med at forstå de strukturelle og funktionelle ændringer i øjets bageste segmentvæv. Derfor demonstrerer vi tre forskellige teknikker til at studere disse ændringer i de bageste segmentproblemer.Vi demonstrerer histologi for at studere morfologiske ændringer af retinale celler i lag, BRB-nedbrydningsassay for at studere kompromitteret BRB ved at kvantificere lækket protein i glaslegemet fra plasma og også fluoresceangiografi for at visualisere retinal vaskulatur ved hjælp af FITC-dextran farvestof. Afliv rotte ved hjælp af høj dosis pentobarbital og bekræft dens død uden påviselig hjerterytme. Enukleere øjet ved at lave snit ved hjælp af et skalpelblad på øjets nasale og tidsmæssige områder.Skær derefter langs kanterne for at fjerne øjet fra orbitalstikket. Fjern det overskydende fedt, der omgiver øjet, og læg det i 5 ml fikseringsopløsning. Inkuber øjet i fiksativ opløsning i 24 til 48 timer.Efter fiksering skal du fjerne øjet fra den fikserende opløsning og overføre til petriskål fyldt med 10 ml PBS. Brug mikro tang til at holde øjet med optisk nerve og lav et nick på pars plana ved hjælp af mikro saks. Skær gennem hele hornhindens margen for at adskille den forreste kop og den bageste kop øjet.Fjern linsen og skær synsnerven. Skær den bageste kop i to halvdele, der passerer gennem synsnerven. Overfør hver halvdel til de separate kassetter.Dehydrere vævet ved gradvist at øge koncentrationen af ethanol fra 50% til 100% ethanol. Og til sidst skal du rydde ethanolen med xylen. Imprægnerer vævet med forvarmet paraffin ved 60 grader Celsius for at erstatte xylen i vævet.Forbered paraffinblokkene ved hjælp af en stålform til at holde vævet og kassetten som base. Under forberedelsen af blokken skal den optiske skivedel af øjet vende mod bunden af stålformen. Fyld kassetten med paraffin og overfør den til en kølig overflade.Monter bladet og kassetten på de respektive holdere på mikrotomet. Brug et mikrotome til at trimme overskydende paraffinvoks og skære et bånd på fem til seks sektioner med en tykkelse på 5 mikrometer. Overfør båndet til overfladen af forvarmet vandbad for at folde båndet ud.Saml sektionerne på et glasglas belagt med albumin. Lad gliderne tørre natten over ved 37 grader Celsius. For at udføre Hæmatoxylin og Eosin farvning, forvarm diasene ved 60 grader Celsius i 1 time for at smelte paraffinen.Følg farvningsproceduren som angivet i manuskriptet. Begynd med rehydrering af væv, og derefter plet med hæmatoxylin efterfulgt af Eosin. Dehydrer nu vævet og tilsæt monteringsmedium på sektionerne.Placer dækslet på sektioner og visualiser under lysmikroskop. For at udføre blod-retinal barriere nedbrydning assay, bedøve rotten ved hjælp af ketamin og xylazin og bekræfte bedøvelsestilstanden ved tåklemme. Find hjertet og indsæt 1 ml sprøjte med 24-gauge nål for at trække blodet ved hjertepunktering.Når det tilstrækkelige blod er opsamlet, overføres det til EDTA-belagt rør. Bland det forsigtigt for at forhindre hæmolyse. Enukleere øjet og straks overføre det til tøris.Under frosne forhold begynder dissektion af øjet ved fjernelse af hornhinde og linse. Træk glaslegemet fra det bageste segment af øjet ved hjælp af tang uden forurening fra nethinden. Overfør det til homogeniseringsrør med tre til fire perler.Homogeniser prøverne ved hjælp af perlehomogenisator ved medium hastighed i 10 sekunder. Overfør blod og glasagtige humorprøver til mikrocentrifugerør for at behandle yderligere. Centrifugering af begge prøver ved 5.200 g i 10 minutter ved 4 grader Celsius.Brug en flerkanalspipette til at tilføje 250 mikroliter Bradford-reagens i brønde. Fortynd glasagtige prøver 10 gange og plasmaprøver 20 gange ved hjælp af PBS. Tilsæt 5 mikroliter fortyndede prøver til Bradford-reagenset og bland godt.Inkuber prøverne i 20 til 30 minutter, og mål derefter absorbansen ved 590 nanometer ved hjælp af en 96-brønds pladelæser. Prøvens intensitet er direkte proportional med koncentrationen af protein. For at udføre fluorescensangiografi bedøves rotten ved hjælp af 3% isofluran og bekræfter bedøvelsestilstanden ved tåstans.Dyp halen i varmt vand, inden du injicerer farvestoffet. 1 ml 50 mg pr. ml FITC-dextran-opløsning injiceres i lateral halevene. Lad farvestoffet cirkulere i 5 til 10 minutter.Afliv rotten ved hjælp af pentobarbital og bekræft dens død uden påviseligt hjerteslag. Enukleere øjet og fortsæt til fladmonteringsforberedelse. For at forberede retinal flad montering skal du placere øjet på en fiberfri Kimwipe og skære den forreste del af øjet.Træk langsomt linsen sammen med den glasagtige humor fra det bageste segment af øjet. Overfør det bageste segment til petriskål fyldt med PBS og skær synsnerven. Placer nu spidsen af den spidse tang mellem sclera og nethinden.Flyt den forsigtigt langs koppens kant for at sikre, at nethinden ikke er fastgjort til sclera på noget tidspunkt. Skær nær den optiske skive, således at nethinden helt løsner sig fra scleraen. Når det er bekræftet, at nethinden ikke er fastgjort til sclera på nogen side, skal du skubbe den langsomt ind i PBS-opløsningen.Ved hjælp af en tang overføres nethinden til et rent glasglas uden at forårsage skade på det. Brug mikrosaks eller skalpelblad til at lave fire snit på nethinden, som vist, for at opdele det i fire kvadranter. Fjern overskydende PBS fra retinale omgivelser, og tilføj anti-fading monteringsmedium på retinal flat mount.Dæk det med et dækslip og visualiser det flade beslag under konfokalmikroskop. Det er vigtigt at bemærke her, at hele processen med fluorescensangiografi udføres under minimalt lys for at undgå slukning af fluorescens fra FITC-dextranfarvestof. Hos diabetisk rotte gennemgår retinale celler degeneration, hvilket fører til yderligere komplikationer.Disse strukturelle ændringer kan visualiseres ved histologi teknik til at bestemme celleantallet og tykkelsen af nethinden. I tilfælde af diabetiske rotter øges tykkelsen af retinale lag på grund af ødem. Derfor hjælper denne teknik med at screene forskellige potentielle farmakologiske midler til behandling af diabetisk retinopati.Metaboliske ændringer i nethinden på grund af diabetes forårsager tab af pericytter og nedbrydning af blod-retinal barriere. Da der er lækage af protein og andre biomolekyler i nethinden og glaslegemet, øges niveauerne af totalt protein i glaslegemet hos diabetiske rotter. Forebyggelse af nedbrydning af blod-retinal barriere kan betydeligt hæmme udviklingen af diabetisk retinopati.Ved diabetisk retinopati øges ekspressionen af vaskulær endotelvækstfaktor, hvilket fører til dannelse af nye kar. Disse kar forstyrrer den normale retinale struktur, og derfor er dens innervering af primær bekymring for behandling af diabetisk retinopati. Fluorescensangiografiteknik bruges til at visualisere nye blodkar og også lækage af blodkar, som fremhævet her.Angiogenese er imidlertid kun fremtrædende efter seks til 12 måneders diabetesinduktion. Denne teknik hjælper os med at kvantificere virkningen af lægemiddelbehandling på innervering af angiogenese og vaskulær lækage. Den fremtidige behandling af diabetisk retinopati kræver mere effektive farmakologiske midler, men de fremtidige behandlinger kan kun opnås gennem bedre forståelse af sygdomspatogenesen.Mastering af disse teknikker kan hjælpe forskere med at få en bedre forståelse af patogenese af diabetisk retinopati, hvilket kan føre til en opdagelse af bedre farmakologiske interventioner.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

En model af kronisk Nutrient Infusion i Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Evaluering af tumorinfiltrerende leukocytundergrupper i en subkutan Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus Autofluorescens for Vurdering af retinale sygdomme

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom-inducerende Procedure i en<em&gt; In vivo</em&gt; Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluering af cerebral Blood flow Autoregulation i rotter ved hjælp af Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Standardiseret histomorforisk evaluering af slidgigt i en kirurgisk musemodel

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Oxygen-induceret retinopati Model for iskæmiske retinale sygdomme hos gnavere

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

Akupunktur i en rotte model af astma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal Pigment Epitel Transplantation i en ikke-human primat model for degenerative retinale sygdomme

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Evaluering af leverglukoseproduktion i en polycystisk ovarie syndrom musemodel

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...