Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Auteurs willen graag de Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) voor financieringssteun aan Dr. Nirmal J. We willen ook de University Grant of Commission bedanken voor het verstrekken van Junior Research Fellowship aan Manisha Malani en Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus voor het verstrekken van infrastructurele faciliteiten.

Dit protocol volgt alle richtlijnen voor dierverzorging die worden verstrekt door de Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad campus.
1. Retinale histologie
<ol><li>Enucleatie en fixatie van het oog<ol>
<li>Euthanaseer een 2 tot 3 maanden oude diabetische Wistar mannelijke rat samen met de leeftijd-gematchte controle (14 tot 15 weken oud) met behulp van een hoge dosis pentobarbital (150 mg / kg) geïnjecteerd via de intraperitoneale route. Geen detecteer...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathophysiology+and+treatments.">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats.">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li><li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Histologie Retinale histologie wordt uitgevoerd om de morfologische veranderingen van retinale cellen en lagen te visualiseren. Verschillende stappen, waaronder de keuze van de fixatieve oplossing, de fixatieduur, uitdroging en paraffine-impregnatie, moeten worden geoptimaliseerd. De weefselgrootte mag niet groter zijn dan 3 mm, omdat de fixatieve penetratie langzaam wordt. De veelgebruikte 4% paraformaldehyde leidt tot netvliesloslating, zelfs in het gezonde oog vanwege de relatief hoge osmolariteit ...

Diabetische retinopathie (DR) is een van de meest complexe secundaire complicaties van diabetes mellitus. Het is ook de belangrijkste oorzaak van vermijdbare blindheid bij de beroepsbevolking wereldwijd. In een recente meta-analyse van 32,4 miljoen blinde mensen waren 830.000 (2,6%) mensen blind als gevolg van DR1. Het aandeel van verlies van gezichtsvermogen toegeschreven aan diabetes stond in 2015 op de zevende plaats met 1,06% (0,15-2,38) wereldwijd2,3.
Diabetische retinopathie wordt gediagnosticeerd door vasculaire afwijkingen in de achterste oculaire weefsels. Klinisch is het verdeeld in twee stadia - Non-Proliferatieve DR (NPDR) en Proliferatieve DR (PDR), gebaseerd op de vascularisatie in het netvlies. Hyperglycemie wordt beschouwd als de krachtige regulator van DR omdat het verschillende routes impliceert die betrokken zijn bij neurodegeneratie4,5, ontsteking6,7 en microvasculatuur8 in het netvlies. Meerdere metabole complicaties geïnduceerd als gevolg van hyperglycemie omvatten de accumulatie van geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's), polyolroute, hexosamineroute en eiwitkinase-C-route. Deze routes zijn verantwoordelijk voor celproliferatie (endotheelcellen), migratie (pericyten) en apoptose (neurale retinale cellen, pericyten en endotheelcellen) op basis van verschillende stadia van diabetische retinopathie. Deze metabole veranderingen kunnen leiden tot fysiologische veranderingen zoals netvliesloslating, verlies van retinale cellen, afbraak van de bloed-retinale barrière (BRB), aneurysma's en angiogenese9.
Streptozotocine (STZ) geïnduceerde type-1 diabetes is een gevestigde en goed geaccepteerde praktijk bij ratten voor het evalueren van diabetes pathogenese en de complicaties ervan. Diabetogene effecten van STZ zijn te wijten aan selectieve vernietiging van pancreaseilandjes β-cellen10. Als gevolg hiervan zullen de dieren insulinedeficiëntie, hyperglycemie, polydipsie en polyurie ondergaan, die allemaal kenmerkend zijn voor diabetes mellitus11 bij de mens type 1. Voor ernstige diabetesinductie wordt STZ toegediend met 40-65 mg / kg lichaamsgewicht intraveneus of intraperitoneaal tijdens de volwassenheid. Na ongeveer 72 uur vertonen deze dieren bloedglucosewaarden van meer dan 250 mg / dL10,12.
Om de fysiologische veranderingen van het netvlies als gevolg van neurodegeneratie, ontsteking en angiogenese te begrijpen, moeten verschillende technieken worden geoptimaliseerd in experimentele diermodellen. Structurele en functionele veranderingen in retinale cellen en retinale vaten kunnen worden bestudeerd door verschillende technieken zoals histologie, BRB-afbraaktest en fluorescentieangiografie.
Histologie omvat de studie van de anatomie van cellen, weefsels en organen op microscopisch niveau. Het legt een correlatie tussen de structuur en functie van cellen/weefsel. Verschillende stappen worden uitgevoerd om de microscopische veranderingen in de weefselstructuur te visualiseren en te identificeren, waardoor gezonde en zieke tegenhangers worden vergeleken13. Daarom is het essentieel om elke stap van de histologie zorgvuldig te standaardiseren. Verschillende stappen die betrokken zijn bij retinale histologie zijn fixatie van het monster, trimmen van het monster, uitdroging, opruimen, impregneren met paraffine, paraffine inbedding, sectie en kleuring (Hematoxyline en Eosine kleuring)13,14.
In een gezond netvlies wordt het transport van moleculen over het netvlies gecontroleerd door BRB, bestaande uit endotheelcellen en pericyten aan de binnenkant en retinale pigmentepitheelcellen aan de buitenkant. Innerlijke BRB-endotheelcellen en pericyten beginnen echter te degenereren tijdens de zieke toestand en BRB is ook aangetast15. Door deze BRB-afbraak lekken veel moleculen met een laag molecuulgewicht in glasvocht en netvliesweefsel16. Naarmate de ziekte vordert, lekken veel andere eiwitmoleculen (laag en hoog molecuulgewicht) ook in glasvocht en netvliesweefsel als gevolg van homeostasestoornissen17. Het leidt tot verschillende andere complicaties en uiteindelijk macula-oedeem en blindheid. Vandaar dat het kwantificeren van de eiwitniveaus in het glasvocht en het vergelijken van gezonde en diabetische toestanden BRB in gevaar bracht.
Fluorescentieangiografie is een techniek die wordt gebruikt om de bloedcirculatie van het netvlies en het vaatvlies te bestuderen met behulp van fluorescerende kleurstof. Het wordt gebruikt om vasculatuur van het netvlies en vaatvlies te visualiseren door fluoresceïnekleurstof te injecteren via intraveneuze route of hartinjectie18. Zodra de kleurstof is geïnjecteerd, bereikt deze eerst de retinale slagaders, gevolgd door retinale aderen. Deze circulatie van kleurstof wordt meestal voltooid binnen 5 tot 10 minuten na de injectie van kleurstof19. Het is een belangrijke techniek om verschillende posterieure segment oculaire ziekten te diagnosticeren, waaronder diabetische retinopathie en choroïdale neovascularisatie20. Het helpt bij het detecteren van grote en kleine vasculatuurveranderingen in normale en zieke omstandigheden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

Een posterieure segment oogziekte zoals diabetische retinopathie verandert de fysiologie van het netvlies. Diabetische retinopathie wordt gekenmerkt door een netvliesloslating, afbraak van de bloed-retinale barrière (BRB) en retinale angiogenese. Een in vivo rattenmodel is een waardevol experimenteel hulpmiddel om de veranderingen in de structuur en functie van het netvlies te onderzoeken. We stellen drie verschillende experimentele technieken voor in het rattenmodel om morfologische veranderingen van retinale cellen, retinale vasculatuur en gecompromitteerde BRB te identificeren. Retinale histologie wordt gebruikt om de morfologie van verschillende retinale cellen te bestuderen. Ook wordt kwantitatieve meting uitgevoerd door retinale celgetal- en diktemeting van verschillende retinale lagen. Een BRB-afbraaktest wordt gebruikt om de lekkage van extraoculaire eiwitten uit het plasma naar glasachtig weefsel te bepalen als gevolg van de afbraak van BRB. Fluorescentieangiografie wordt gebruikt om angiogenese en lekkage van bloedvaten te bestuderen door retinale vasculatuur te visualiseren met behulp van FITC-dextran-kleurstof.

Retinale histologie In het diabetische netvlies ondergaan retinale cellen degeneratie. Bovendien neemt de dikte van de retinale lagen toe als gevolg van oedeem22. De beelden verkregen na hematoxyline- en eosinekleuring kunnen worden gebruikt voor het aantal cellen en het meten van de dikte van verschillende lagen, zoals weergegeven in figuur 2 met behulp van ImageJ.
Bloed-retinale barrièreafbraaktest<br...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Histologie, bloed-retinale barrièreafbraaktest en fluorescentieangiografie zijn waardevolle technieken om de pathofysiologie van het netvlies te begrijpen, wat de efficiënte screening van geneesmiddelen tegen diabetische retinopathie verder zou kunnen verbeteren.

Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Het algemene doel van deze technieken is om de retinale pathofysiologie in het streptozotocine-geïnduceerde diabetische retinopathie rattenmodel te evalueren. De diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. De voortdurende zoektocht gaat door naar farmacologische middelen met een betere werkzaamheid en een langere werking om diabetische retinopathie te behandelen.Het proces van het ontdekken van farmacologische middelen in preklinische diermodellen speelt een vitale rol. Deze diermodellen helpen om de structurele en functionele veranderingen van de achterste segmentweefsels van het oog te begrijpen. Daarom zullen we drie verschillende technieken demonstreren om deze veranderingen in de problemen met het achterste segment te bestuderen.We demonstreren histologie om morfologische veranderingen van retinale cellen in lagen te bestuderen, BRB-afbraaktest om gecompromitteerde BRB te bestuderen door gelekt eiwit in het glasvocht uit plasma te kwantificeren, en ook fluoresce-angiografie om retinale vasculatuur te visualiseren met behulp van FITC-dextran-kleurstof. Euthanaseer de rat met een hoge dosis pentobarbital en bevestig de dood zonder detecteerbare hartslag. Enucleeer het oog door incisies te maken met behulp van een scalpelmes op de neus- en temporale gebieden van het oog.Snijd vervolgens langs de randen om het oog uit de orbitale kom te verwijderen. Verwijder het overtollige vet rond het oog en plaats het in 5 ml fixatieve oplossing. Incubeer het oog in een fixatieve oplossing gedurende 24 tot 48 uur.Verwijder na fixatie het oog uit de fixatieve oplossing en breng het over naar de petrischaal gevuld met 10 ml PBS. Houd met behulp van een microtang het oog vast met de oogzenuw en maak een inkeping op pars plana met behulp van een microschaar. Snijd door de hele rand van het hoornvlies om de voorste beker en de achterste oogbeker te scheiden.Verwijder de lens en snijd de oogzenuw door. Snijd de achterste cup in twee helften en passeer de oogzenuw. Breng elke helft over in de afzonderlijke cassettes.Droog het weefsel uit door de concentratie ethanol geleidelijk te verhogen van 50% naar 100% ethanol. En tot slot, verwijder de ethanol met xyleen. Impregneer het weefsel met voorverwarmde paraffine bij 60 graden Celsius om xyleen in het weefsel te vervangen.Bereid de paraffineblokken voor met behulp van een stalen mal om het weefsel en de cassette als basis vast te houden. Tijdens het voorbereiden van het blok moet het optische schijfgedeelte van het oog naar de onderkant van de stalen mal kijken. Vul de cassette met paraffine en breng deze over op een koel oppervlak.Monteer het mes en de cassette op de respectievelijke houders op microtoom. Knip met behulp van een microtoom de overtollige paraffinewas en knip een lint van vijf tot zes secties met een dikte van 5 micrometer. Breng het lint over op het oppervlak van het voorverwarmde waterbad om het lint uit te vouwen.Verzamel de secties op een glazen dia bedekt met albumine. Laat de glijbanen een nacht drogen bij 37 graden Celsius. Om hematoxyline- en eosinekleuring uit te voeren, verwarmt u de dia's gedurende 1 uur op 60 graden Celsius om de paraffine te smelten.Volg de kleuringsprocedure zoals gegeven in manuscript. Begin met de rehydratatie van weefsel en vervolgens met hematoxyline, gevolgd door eosine. Droog nu het weefsel uit en voeg montagemedium toe aan de secties.Plaats de afdekplaat op secties en visualiseer onder de lichtmicroscoop. Om bloed-retinale barrièreafbraaktest uit te voeren, verdooft u de rat met ketamine en xylazine en bevestigt u de anesthetische toestand door teen knijpen. Lokaliseer het hart en plaats een spuit van 1 ml met een naald van 24 gauge om het bloed te trekken door een hartpunctie.Zodra het voldoende bloed is verzameld, brengt u het over naar de met EDTA bedekte buis. Meng het voorzichtig om hemolyse te voorkomen. Enucleeer het oog en breng het onmiddellijk over op droogijs.Begin onder bevroren omstandigheden met de dissectie van het oog door het hoornvlies en de lens te verwijderen. Trek het glasvocht uit het achterste oogsegment met een tang zonder enige besmetting van het netvlies. Breng het over in de homogeniseerbuis met drie tot vier kralen.Homogeniseer de monsters met behulp van kradelhomogenisator op gemiddelde snelheid gedurende 10 seconden. Breng bloed- en glasvochthumormonsters over in microcentrifugebuizen om verder te verwerken. Centrifugeer beide monsters bij 5, 200 g gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius.Voeg met behulp van een meerkanaalspion 250 microliter Bradford-reagens toe aan putten. Verdun glasvochtmonsters 10 keer en plasmamonsters 20 keer met PBS. Voeg 5 microliter verdunde monsters toe aan Bradford-reagens en meng goed.Incubeer de monsters gedurende 20 tot 30 minuten en meet vervolgens de absorptie op 590 nanometer met behulp van een 96-well plaatlezer. De intensiteit van het monster is recht evenredig met de concentratie van het eiwit. Om fluorescentieangiografie uit te voeren, verdooft u de rat met 3% isofluraan en bevestigt u de verdovingstoestand door teenstoot.Dompel de staart in warm water voordat u de kleurstof injecteert. Injecteer 1 ml van 50 mg per ml FITC-dextran oplossing in de laterale staartader. Laat de kleurstof 5 tot 10 minuten circuleren.Euthanaseer de rat met pentobarbital en bevestig zijn dood door geen detecteerbare hartslag. Enucleeer het oog en ga verder met flat mount voorbereiding. Om retinale flat mount voor te bereiden, plaatst u het oog op een vezelvrije Kimwipe en snijdt u het voorste deel van het oog.Trek langzaam de lens, samen met de glasvochthumor, uit het achterste segment van het oog. Breng het achterste segment over in een petrischaal gevuld met PBS en snijd de oogzenuw door. Plaats nu de punt van de puntige tang tussen sclera en netvlies.Beweeg het voorzichtig langs de rand van de beker om ervoor te zorgen dat het netvlies op geen enkel moment aan sclera is bevestigd. Snijd in de buurt van de optische schijf, zodat het netvlies volledig loskomt van de sclera. Zodra is bevestigd dat het netvlies aan geen enkele kant aan sclera is bevestigd, duwt u het langzaam in de PBS-oplossing.Breng met behulp van een tang het netvlies over op een schone glasplaat zonder deze te beschadigen. Maak met behulp van een microschaar of scalpelmes vier sneden op het netvlies, zoals getoond, om het in vier kwadranten te verdelen. Verwijder overtollige PBS uit de retinale omgeving en voeg anti-vervagend montagemedium toe aan de retinale flat mount.Bedek het met een coverslip en visualiseer de platte houder onder een confocale microscoop. Het is belangrijk om hier op te merken dat het hele proces van fluorescentieangiografie wordt uitgevoerd onder minimaal licht om het doven van fluorescentie van FITC-dextran-kleurstof te voorkomen. Bij diabetische ratten ondergaan de retinale cellen degeneratie, wat leidt tot verdere complicaties.Deze structurele veranderingen kunnen worden gevisualiseerd door histologietechniek om het celnummer en de dikte van het netvlies te bepalen. In het geval van diabetische ratten neemt de dikte van retinale lagen toe als gevolg van oedeem. Vandaar dat deze techniek helpt bij het screenen van verschillende potentiële farmacologische middelen om diabetische retinopathie te behandelen.Metabole veranderingen in het netvlies als gevolg van diabetes veroorzaken verlies van pericyten en afbraak van de bloed-retinale barrière. Omdat er lekkage van eiwitten en andere biomoleculen in het netvlies en het glasvocht is, nemen de niveaus van totaal eiwit toe in het glasvocht van diabetische ratten. Het voorkomen van de afbraak van de bloed-retinale barrière kan de voortgang van diabetische retinopathie aanzienlijk belemmeren.Bij diabetische retinopathie neemt de expressie van vasculaire endotheelgroeifactor toe die leiden tot de vorming van nieuwe bloedvaten. Deze vaten verstoren de normale retinale structuur en daarom is de innervatie ervan van primair belang voor de behandeling van diabetische retinopathie. Fluorescentieangiografietechniek wordt gebruikt om nieuwe bloedvaten en ook lekkage van bloedvaten te visualiseren, zoals hier wordt benadrukt.Angiogenese is echter pas prominent na zes tot 12 maanden diabetesinductie. Deze techniek helpt ons om het effect van medicamenteuze behandeling op innervatie van angiogenese en vasculaire lekkage te kwantificeren. De toekomstige behandeling van diabetische retinopathie heeft efficiëntere farmacologische middelen nodig, maar de toekomstige behandelingen kunnen alleen worden bereikt door een beter begrip van de pathogenese van de ziekte.Het beheersen van deze technieken zou onderzoekers kunnen helpen om een beter begrip te krijgen van de pathogenese van diabetische retinopathie, wat zou kunnen leiden tot een ontdekking van betere farmacologische interventies.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Een model van Chronisch Nutrient Infusion in het Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Evaluatie van tumor-infiltrerende leukocyten subsets in een subcutane tumormodel

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kwantitatieve fundus autofluorescentie voor de beoordeling van Netvliesaandoeningen

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoom-inducerende Procedure in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Model en Whole-mount Retina Voorbereiding

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluatie van cerebrale bloedstroom autoregulatie in de rat met behulp van laser doppler flowmetrie

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Gestandaardiseerde Histomormetrische evaluatie van artrose in een chirurgisch muismodel

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

Acupunctuur in een Rattenmodel van Astma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Evaluatie van leverglucoseproductie in een muismodel met polycysteus ovariumsyndroom

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...