Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier le Conseil indien de la recherche médicale (ICMR; ITR-2020-2882) pour le soutien financier au Dr Nirmal J. Nous tenons également à remercier la subvention de la Commission de l’Université pour avoir fourni une bourse de recherche junior à Manisha Malani et le Laboratoire central d’analyse, BITS-Pilani, campus d’Hyderabad pour avoir fourni des infrastructures.

Ce protocole suit toutes les directives de soins aux animaux fournies par le Comité institutionnel d’éthique animale, BITS-Pilani, campus d’Hyderabad.
1. Histologie rétinienne
<ol><li>Énucléation et fixation de l’œil<ol>
<li>Euthanasier un rat mâle Wistar diabétique de 2 à 3 mois avec le témoin apparié selon l’âge (âgé de 14 à 15 semaines) à l’aide d’une dose élevée de pentobarbital (150 mg / kg) injectée par voie intrapéritonéale. Aucun batt...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Histologie L’histologie rétinienne est réalisée pour visualiser les changements morphologiques des cellules et des couches rétiniennes. Diverses étapes, y compris le choix de la solution fixative, la durée de fixation, la déshydratation et l’imprégnation à la paraffine, doivent être optimisées. La taille des tissus ne doit pas dépasser 3 mm, car la pénétration du fixateur devient lente. Le paraformaldéhyde à 4% couramment utilisé conduit à un décollement de la rétine même dans...

La rétinopathie diabétique (DR) est l’une des complications secondaires les plus complexes du diabète sucré. C’est aussi la principale cause de cécité évitable dans la population en âge de travailler dans le monde. Dans une méta-analyse récente portant sur 32,4 millions de personnes aveugles, 830 000 (2,6%) personnes étaient aveugles en raison de DR1. La proportion de perte de vision attribuée au diabète se classait au septième rang en 2015 à 1,06% (0,15-2,38) dans le monde2,3.
La rétinopathie diabétique est diagnostiquée par des anomalies vasculaires dans les tissus oculaires postérieurs. Cliniquement, il est divisé en deux étapes - DR non proliférative (NPDR) et DR proliférative (PDR), en fonction de la vascularisation de la rétine. L’hyperglycémie est considérée comme le puissant régulateur de la RD car elle implique plusieurs voies impliquées dans la neurodégénérescence4,5, l’inflammation6,7 et la microvascularisation8 dans la rétine. Les multiples complications métaboliques induites par l’hyperglycémie comprennent l’accumulation de produits finaux de glycation avancée (AGE), de la voie polyol, de la voie hexosamine et de la voie protéine kinase-C. Ces voies sont responsables de la prolifération cellulaire (cellules endothéliales), de la migration (péricytes) et de l’apoptose (cellules rétiniennes neurales, péricytes et cellules endothéliales) en fonction des différents stades de la rétinopathie diabétique. Ces altérations métaboliques peuvent entraîner des changements physiologiques tels que le décollement de la rétine, la perte de cellules rétiniennes, la dégradation de la barrière hémato-rétinienne (BRB), les anévrismes et l’angiogenèse9.
Le diabète de type 1 induit par la streptozotocine (STZ) est une pratique bien établie et bien acceptée chez le rat pour évaluer la pathogenèse du diabète et ses complications. Les effets diabétogènes de STZ sont dus à la destruction sélective des îlots pancréatiques β-cellules10. En conséquence, les animaux subiront une carence en insuline, une hyperglycémie, une polydipsie et une polyurie, qui sont toutes caractéristiques du diabète sucré de type 1 humain11. Pour l’induction sévère du diabète, STZ est administré à 40-65 mg / kg de poids corporel par voie intraveineuse ou intrapéritonéale à l’âge adulte. Après environ 72 h, ces animaux présentent une glycémie supérieure à 250 mg/dL10,12.
Pour comprendre les altérations physiologiques de la rétine dues à la neurodégénérescence, à l’inflammation et à l’angiogenèse, différentes techniques doivent être optimisées dans des modèles animaux expérimentaux. Les changements structurels et fonctionnels dans les cellules rétiniennes et les vaisseaux rétiniens peuvent être étudiés par diverses techniques telles que l’histologie, le test de dégradation BRB et l’angiographie par fluorescence.
L’histologie implique l’étude de l’anatomie des cellules, des tissus et des organes à un niveau microscopique. Il établit une corrélation entre la structure et la fonction des cellules/tissus. Plusieurs étapes sont effectuées pour visualiser et identifier les altérations microscopiques de la structure tissulaire, comparant ainsi les homologues sains et malades13. Par conséquent, il est essentiel de normaliser méticuleusement chaque étape de l’histologie. Diverses étapes de l’histologie rétinienne sont la fixation de l’échantillon, la coupe de l’échantillon, la déshydratation, le nettoyage, l’imprégnation avec de la paraffine, l’incorporation de paraffine, le sectionnement et la coloration (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine)13,14.
Dans une rétine saine, le transport des molécules à travers la rétine est contrôlé par BRB, composé de cellules endothéliales et de péricytes sur la face interne, et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes sur la face externe. Cependant, les cellules endothéliales internes du BRB et les péricytes commencent à dégénérer pendant la maladie, et le BRB est également compromis15. En raison de cette dégradation de la BRB, de nombreuses molécules de faible poids moléculaire s’infiltrent dans le tissu vitré et rétinien16. Au fur et à mesure que la maladie progresse, de nombreuses autres molécules protéiques (poids moléculaire faible et élevé) s’infiltrent également dans les tissus vitrés et rétiniens en raison de troubles de l’homéostasie17. Il conduit à diverses autres complications et finalement à l’œdème maculaire et à la cécité. Par conséquent, la quantification des niveaux de protéines dans le vitré et la comparaison des états sains et diabétiques ont compromis la BRB.
L’angiographie par fluorescence est une technique utilisée pour étudier la circulation sanguine de la rétine et de la choroïde à l’aide d’un colorant fluorescent. Il est utilisé pour visualiser le système vasculaire de la rétine et de la choroïde en injectant du colorant fluorescéine par voie intraveineuse ou par injection cardiaque18. Une fois le colorant injecté, il atteint d’abord les artères rétiniennes, suivies des veines rétiniennes. Cette circulation du colorant est généralement terminée dans les 5 à 10 minutes suivant l’injection du colorant19. C’est une technique importante pour diagnostiquer diverses maladies oculaires du segment postérieur, y compris la rétinopathie diabétique et la néovascularisation choroïdienne20. Il aide à détecter les changements vasculaires majeurs et mineurs dans les conditions normales et malades.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

Une maladie oculaire du segment postérieur comme la rétinopathie diabétique modifie la physiologie de la rétine. La rétinopathie diabétique se caractérise par un décollement de la rétine, une rupture de la barrière hémato-rétinienne (BRB) et une angiogenèse rétinienne. Un modèle de rat in vivo est un outil expérimental précieux pour examiner les changements dans la structure et la fonction de la rétine. Nous proposons trois techniques expérimentales différentes dans le modèle du rat pour identifier les changements morphologiques des cellules rétiniennes, du système vasculaire rétinien et de la BRB compromise. L’histologie rétinienne est utilisée pour étudier la morphologie de diverses cellules rétiniennes. En outre, la mesure quantitative est effectuée par le nombre de cellules rétiniennes et la mesure de l’épaisseur de différentes couches rétiniennes. Un test de dégradation BRB est utilisé pour déterminer la fuite de protéines extraoculaires du plasma vers le tissu vitré en raison de la dégradation de BRB. L’angiographie par fluorescence est utilisée pour étudier l’angiogenèse et les fuites des vaisseaux sanguins en visualisant le système vasculaire rétinien à l’aide du colorant FITC-dextran.

Histologie rétinienne Dans la rétine diabétique, les cellules rétiniennes subissent une dégénérescence. De plus, l’épaisseur des couches rétiniennes augmente en raison de l’œdème22. Les images obtenues après coloration à l’hématoxyline et à l’éosine peuvent être utilisées pour le comptage cellulaire et la mesure de l’épaisseur de différentes couches, comme le montre la figure 2 à l’aide d’ImageJ.
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Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

La rétinopathie diabétique est l’une des principales causes de cécité. L’histologie, le test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne et l’angiographie par fluorescence sont des techniques précieuses pour comprendre la physiopathologie de la rétine, ce qui pourrait améliorer encore le dépistage efficace des médicaments contre la rétinopathie diabétique.

Évaluation physiopathologique rétinienne dans un modèle de rat

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

L’objectif global de ces techniques est d’évaluer la physiopathologie rétinienne dans le modèle de rat de rétinopathie diabétique induite par la streptozotocine. La rétinopathie diabétique est l’une des principales causes de cécité. La recherche continue est en cours pour découvrir des agents pharmacologiques avec une meilleure efficacité et une action plus longue pour traiter la rétinopathie diabétique.Le processus de découverte d’agents pharmacologiques dans des modèles animaux précliniques joue un rôle essentiel. Ces modèles animaux aident à comprendre les altérations structurelles et fonctionnelles des tissus du segment postérieur de l’œil. Par conséquent, nous allons démontrer trois techniques différentes pour étudier ces altérations dans les problèmes du segment postérieur.Nous démontrons l’histologie pour étudier les changements morphologiques des cellules rétiniennes dans les couches, le test de dégradation BRB pour étudier la BRB compromise en quantifiant les protéines fuyantes dans le vitré à partir du plasma, et aussi l’angiographie fluoresce pour visualiser le système vasculaire rétinien à l’aide du colorant FITC-dextran. Euthanasier le rat en utilisant une forte dose de pentobarbital et confirmer sa mort sans rythme cardiaque détectable. Énucléez l’œil en faisant des incisions à l’aide d’une lame de scalpel sur les régions nasale et temporale de l’œil.Ensuite, coupez le long de ses bords pour retirer l’œil de l’orbite orbitale. Retirez l’excès de graisse entourant l’œil et placez-le dans 5 mL de solution fixatrice. Incuber l’œil dans une solution fixative pendant 24 à 48 heures.Après la fixation, retirer l’œil de la solution fixatrice et transférer dans une boîte de Petri remplie de 10 mL de PBS. À l’aide de micro-pinces, tenez l’œil avec le nerf optique et faites une entaille au pars plana à l’aide de micro-ciseaux. Coupez toute la marge de la cornée pour séparer la coupe antérieure et la coupe de l’œil postérieure.Retirez la lentille et coupez le nerf optique. Coupez la coupe postérieure en deux moitiés, en passant par le nerf optique. Transférez chaque moitié dans les cassettes séparées.Déshydratez les tissus en augmentant progressivement la concentration d’éthanol de 50% à 100% d’éthanol. Et enfin, nettoyez l’éthanol avec du xylène. Imprégner le tissu avec de la paraffine préchauffée à 60 degrés Celsius pour remplacer le xylène dans le tissu.Préparez les blocs de paraffine à l’aide d’un moule en acier pour maintenir le tissu et la cassette comme base. Lors de la préparation du bloc, la partie du disque optique de l’œil doit faire face au fond du moule en acier. Remplissez la cassette de paraffine et transférez-la sur une surface fraîche.Montez la lame et la cassette sur les supports respectifs sur microtome. À l’aide d’un microtome, coupez l’excès de cire de paraffine et coupez un ruban de cinq à six sections d’une épaisseur de 5 micromètres. Transférez le ruban sur la surface du bain-marie préchauffé pour déplier le ruban.Recueillir les sections sur une lame de verre recouverte d’albumine. Laissez les lames sécher pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Pour effectuer la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, préchauffez les lames à 60 degrés Celsius pendant 1 heure pour faire fondre la paraffine.Suivez la procédure de coloration indiquée dans le manuscrit. Commencez par la réhydratation des tissus, puis colorez avec de l’hématoxyline suivie d’éosine. Maintenant, déshydratez le tissu et ajoutez un milieu de montage sur les sections.Placez le couvercle sur des sections et visualisez au microscope optique. Pour effectuer un test de dégradation de la barrière hémato-rétinienne, anesthésiez le rat à l’aide de kétamine et de xylazine et confirmez l’état anesthésique par pincement des orteils. Localisez le cœur et insérez une seringue de 1 mL avec une aiguille de calibre 24 pour prélever le sang par ponction cardiaque.Une fois que le sang suffisant est recueilli, transférez-le dans un tube enduit d’EDTA. Mélangez-le doucement pour éviter l’hémolyse. Énucléez l’œil et transférez-le immédiatement à la glace sèche.Dans des conditions de congélation, commencez la dissection de l’œil par l’ablation de la cornée et du cristallin. Tirez le vitré du segment postérieur de l’œil à l’aide d’une pince sans aucune contamination de la rétine. Transférez-le dans un tube d’homogénéisation avec trois à quatre perles.Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur de billes à vitesse moyenne pendant 10 secondes. Transférer des échantillons de sang et d’humeur vitrée dans des tubes de microcentrifugation pour les traiter davantage. Centrifuger les deux échantillons à 5 200 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius.À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 250 microlitres de réactif Bradford dans les puits. Diluer les échantillons vitrés 10 fois et les échantillons plasmatiques 20 fois à l’aide de PBS. Ajouter 5 microlitres d’échantillons dilués au réactif Bradford et bien mélanger.Incuber les échantillons pendant 20 à 30 minutes, puis mesurer l’absorbance à 590 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques à 96 puits. L’intensité de l’échantillon est directement proportionnelle à la concentration en protéines. Pour effectuer une angiographie par fluorescence, anesthésiez le rat à l’aide de 3% d’isoflurane et confirmez l’état anesthésique par coup de poing.Trempez la queue dans de l’eau tiède avant d’injecter le colorant. Injecter 1 mL de 50 mg par mL de solution de FITC-dextran dans la veine latérale de la queue. Laissez le colorant circuler pendant 5 à 10 minutes.Euthanasier le rat à l’aide de pentobarbital et confirmer sa mort par aucun battement de cœur détectable. Énucléez l’œil et procédez à la préparation du montage à plat. Pour préparer le montage plat rétinien, placez l’œil sur un Kimwipe sans fibres et coupez la partie antérieure de l’œil.Tirez lentement la lentille, avec l’humeur vitrée, du segment postérieur de l’œil. Transférer le segment postérieur dans une boîte de Petri remplie de PBS et couper le nerf optique. Maintenant, placez la pointe de la pince pointue entre la sclérotique et la rétine.Déplacez-le doucement tout le long du bord de la coupe pour vous assurer que la rétine n’est attachée à la sclérotique à aucun moment. Couper près du disque optique, de sorte que la rétine se détache complètement de la sclérotique. Une fois qu’il est confirmé que la rétine n’est attachée à la sclérotique d’aucun côté, poussez-la lentement dans la solution pbsienne.À l’aide d’une pince, transférez la rétine sur une lame de verre propre sans lui causer de dommages. À l’aide d’un micro-ciseau ou d’une lame de scalpel, faites quatre coupes sur la rétine, comme indiqué, pour la diviser en quatre quadrants. Retirez l’excès de PBS de l’environnement rétinien et ajoutez un support de montage anti-décoloration sur le support plat rétinien.Couvrez-le avec un couvercle et visualisez la monture plate au microscope confocal. Il est important de noter ici que l’ensemble du processus d’angiographie par fluorescence est effectué sous un minimum de lumière pour éviter la trempe de la fluorescence du colorant FITC-dextran. Chez le rat diabétique, les cellules rétiniennes subissent une dégénérescence, ce qui entraîne d’autres complications.Ces altérations structurelles peuvent être visualisées par une technique d’histologie pour déterminer le nombre de cellules et l’épaisseur de la rétine. Dans le cas des rats diabétiques, l’épaisseur des couches rétiniennes augmente en raison de l’œdème. Par conséquent, cette technique aide à dépister divers agents pharmacologiques potentiels pour traiter la rétinopathie diabétique.Les changements métaboliques dans la rétine dus au diabète provoquent la perte de péricytes et la rupture de la barrière hémato-rétinienne. Comme il y a fuite de protéines et d’autres biomolécules dans la rétine et le vitré, les niveaux de protéines totales augmentent dans le vitré des rats diabétiques. La prévention de la dégradation de la barrière hémato-rétinienne pourrait entraver considérablement la progression de la rétinopathie diabétique.Dans la rétinopathie diabétique, l’expression du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire augmente, ce qui conduit à la formation de nouveaux vaisseaux. Ces vaisseaux perturbent la structure rétinienne normale et, par conséquent, son innervation est une préoccupation majeure pour traiter la rétinopathie diabétique. La technique d’angiographie par fluorescence est utilisée pour visualiser de nouveaux vaisseaux sanguins et des fuites de vaisseaux sanguins, comme souligné ici.Cependant, l’angiogenèse n’est importante qu’après six à 12 mois d’induction du diabète. Cette technique nous aide à quantifier l’effet du traitement médicamenteux sur l’innervation de l’angiogenèse et les fuites vasculaires. Le traitement futur de la rétinopathie diabétique nécessite des agents pharmacologiques plus efficaces, mais les futurs traitements ne peuvent être réalisés que par une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie.La maîtrise de ces techniques pourrait aider les chercheurs à mieux comprendre la pathogenèse de la rétinopathie diabétique, ce qui pourrait conduire à la découverte de meilleures interventions pharmacologiques.

Research

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Medicine

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