Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Die Autoren möchten den Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) zur Förderung von Dr. Nirmal J. Wir möchten uns auch bei der University Grant of Commission für die Bereitstellung eines Junior Research Fellowship für Manisha Malani und der Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad Campus, für die Bereitstellung infrastruktureller Einrichtungen bedanken.

Dieses Protokoll folgt allen Tierpflegerichtlinien, die von der Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad Campus, zur Verfügung gestellt werden.
1. Netzhauthistologie
<ol><li>Enukleation und Fixierung des Auges<ol>
<li>Euthanasieren Sie eine 2 bis 3 Monate alte diabetische männliche Wistar-Ratte zusammen mit der altersangepassten Kontrolle (14 bis 15 Wochen alt) mit einer hohen Dosis Pentobarbital (150 mg / kg), die intraperitoneal injiziert wird. Kein ...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathophysiology+and+treatments.">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats.">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li><li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Histologie Die Netzhauthistologie wird durchgeführt, um die morphologischen Veränderungen von Netzhautzellen und -schichten zu visualisieren. Verschiedene Schritte, einschließlich der Wahl der fixativen Lösung, der Fixationsdauer, der Dehydratation und der Paraffinimprägnierung, müssen optimiert werden. Die Gewebegröße sollte 3 mm nicht überschreiten, da die fixative Penetration langsam wird. Das häufig verwendete 4%ige Paraformaldehyd führt aufgrund der relativ hohen Osmolarität der Lösu...

Die diabetische Retinopathie (DR) ist eine der komplexesten sekundären Komplikationen des Diabetes mellitus. Es ist auch die Hauptursache für vermeidbare Blindheit in der Bevölkerung im erwerbsfähigen Alter weltweit. In einer kürzlich durchgeführten Meta-Analyse von 32,4 Millionen blinden Menschen waren 830.000 (2,6%) Menschen aufgrund von DR1 blind. Der Anteil des Sehverlusts, der auf Diabetes zurückzuführen ist, belegte 2015 mit 1,06% (0,15-2,38) weltweit den siebten Platz2,3.
Die diabetische Retinopathie wird durch Gefäßanomalien im hinteren Augengewebe diagnostiziert. Klinisch ist es in zwei Stadien unterteilt - Non-Proliferative DR (NPDR) und Proliferative DR (PDR), basierend auf der Vaskularisation in der Netzhaut. Hyperglykämie gilt als der potente Regulator von DR, da sie mehrere Wege impliziert, die an Neurodegeneration4,5, Entzündungen6,7 und Mikrovaskulaturen8 in der Netzhaut beteiligt sind. Zu den multiplen metabolischen Komplikationen, die aufgrund von Hyperglykämie induziert werden, gehören die Anhäufung von fortgeschrittenen Glykationsendprodukten (AGEs), Polyolweg, Hexosaminweg und Proteinkinase-C-Signalweg. Diese Signalwege sind verantwortlich für die Zellproliferation (Endothelzellen), Migration (Perizyten) und Apoptose (neuronale Netzhautzellen, Perizyten und Endothelzellen), die auf verschiedenen Stadien der diabetischen Retinopathie basieren. Diese metabolischen Veränderungen können zu physiologischen Veränderungen wie Netzhautablösung, Verlust von Netzhautzellen, Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB), Aneurysmen und Angiogenese führen9.
Streptozotocin (STZ) -induzierter Typ-1-Diabetes ist eine etablierte und akzeptierte Praxis bei Ratten zur Bewertung der Diabetes-Pathogenese und ihrer Komplikationen. Diabetogene Wirkungen von STZ sind auf die selektive Zerstörung der Pankreasinsel β-Zellen zurückzuführen10. Infolgedessen erleiden die Tiere Insulinmangel, Hyperglykämie, Polydipsie und Polyurie, die alle für den menschlichen Typ-1-Diabetes mellitus charakteristisch sind11. Bei schwerer Diabetes-Induktion wird STZ bei 40-65 mg/kg Körpergewicht intravenös oder intraperitoneal im Erwachsenenalter verabreicht. Nach etwa 72 h weisen diese Tiere einen Blutzuckerspiegel von mehr als 250 mg/dL10,12 auf.
Um die physiologischen Veränderungen der Netzhaut durch Neurodegeneration, Entzündung und Angiogenese zu verstehen, sollten verschiedene Techniken in experimentellen Tiermodellen optimiert werden. Strukturelle und funktionelle Veränderungen in Netzhautzellen und Netzhautgefäßen können durch verschiedene Techniken wie Histologie, BRB-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie untersucht werden.
Histologie beinhaltet das Studium der Anatomie von Zellen, Geweben und Organen auf mikroskopischer Ebene. Es stellt eine Korrelation zwischen der Struktur und Funktion von Zellen/Gewebe her. Es werden mehrere Schritte durchgeführt, um die mikroskopischen Veränderungen in der Gewebestruktur zu visualisieren und zu identifizieren und dabei gesunde und kranke Gegenstücke zu vergleichen13. Daher ist es wichtig, jeden Schritt der Histologie sorgfältig zu standardisieren. Verschiedene Schritte in der Netzhauthistologie sind die Fixierung der Probe, das Trimmen der Probe, Dehydratisierung, Clearing, Imprägnierung mit Paraffin, Paraffineinbettung, Schnitt und Färbung (Hämatoxylin- und Eosin-Färbung)13,14.
In einer gesunden Netzhaut wird der Transport von Molekülen über die Netzhaut durch BRB gesteuert, das aus Endothelzellen und Perizyten auf der Innenseite und retinalen Pigmentepithelzellen auf der Außenseite besteht. Innere BRB-Endothelzellen und Perizyten beginnen jedoch während des erkrankten Zustands zu degenerieren, und BRB ist ebenfalls kompromittiert15. Aufgrund dieses BRB-Abbaus gelangen viele niedermolekulare Moleküle in Glaskörper und Netzhautgewebe16. Wenn die Krankheit fortschreitet, treten aufgrund von Homöostasestörungen auch viele andere Proteinmoleküle (niedriges und hohes Molekulargewicht) in Glaskörper und Netzhautgewebe aus17. Es führt zu verschiedenen anderen Komplikationen und letztendlich zu Makulaödemen und Blindheit. Daher kompromittierten die Quantifizierung der Proteinspiegel im Glaskörper und der Vergleich von gesunden und diabetischen Zuständen das BRB.
Die Fluoreszenzangiographie ist eine Technik, die verwendet wird, um die Blutzirkulation der Netzhaut und der Aderhaut mit Fluoreszenzfarbstoff zu untersuchen. Es wird verwendet, um das Gefäßsystem der Netzhaut und der Aderhaut zu visualisieren, indem Fluoresceinfarbstoff über intravenösen Weg oder Herzinjektion injiziert wird18. Sobald der Farbstoff injiziert ist, erreicht er zuerst die Netzhautarterien, gefolgt von Netzhautvenen. Diese Zirkulation von Farbstoff wird normalerweise innerhalb von 5 bis 10 Minuten nach der Injektion von Farbstoff19 abgeschlossen. Es ist eine wichtige Technik zur Diagnose verschiedener Augenerkrankungen des hinteren Segments, einschließlich diabetischer Retinopathie und choroidaler Neovaskularisation20. Es hilft, größere und kleine Gefäßveränderungen unter normalen und kranken Zuständen zu erkennen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

Eine Augenerkrankung des hinteren Segments wie die diabetische Retinopathie verändert die Physiologie der Netzhaut. Die diabetische Retinopathie ist gekennzeichnet durch eine Netzhautablösung, den Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) und die retinale Angiogenese. Ein In-vivo-Rattenmodell ist ein wertvolles experimentelles Werkzeug, um die Veränderungen in der Struktur und Funktion der Netzhaut zu untersuchen. Wir schlagen drei verschiedene experimentelle Techniken im Rattenmodell vor, um morphologische Veränderungen von Netzhautzellen, retinalen Gefäßen und kompromittiertem BRB zu identifizieren. Die Netzhauthistologie wird verwendet, um die Morphologie verschiedener Netzhautzellen zu untersuchen. Die quantitative Messung erfolgt auch durch retinale Zellzählung und Dickenmessung verschiedener Netzhautschichten. Ein BRB-Abbauassay wird verwendet, um das Austreten von extraokularen Proteinen aus dem Plasma in Glaskörper aufgrund des Abbaus von BRB zu bestimmen. Die Fluoreszenzangiographie wird verwendet, um die Angiogenese und das Austreten von Blutgefäßen zu untersuchen, indem retinale Gefäße mit FITC-Dextran-Farbstoff sichtbar gemacht werden.

Netzhauthistologie In der diabetischen Netzhaut erleiden Netzhautzellen eine Degeneration. Darüber hinaus nimmt die Dicke der Netzhautschichten aufgrund von Ödem22 zu. Die nach der Hämatoxylin- und Eosinfärbung erhaltenen Bilder können für die Zellzählung und die Messung der Dicke verschiedener Schichten verwendet werden, wie in Abbildung 2 mit ImageJ gezeigt.
Blut-Netzhaut-Barriere-Abbau-Assay<br...

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Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Histologie, Blut-Netzhaut-Schranken-Abbauassay und Fluoreszenzangiographie sind wertvolle Techniken, um die Pathophysiologie der Netzhaut zu verstehen, was das effiziente Arzneimittelscreening gegen diabetische Retinopathie weiter verbessern könnte.

Retinale pathophysiologische Bewertung in einem Rattenmodell

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Das übergeordnete Ziel dieser Techniken ist es, die retinale Pathophysiologie im Streptozotocin-induzierten diabetischen Retinopathie-Rattenmodell zu bewerten. Die diabetische Retinopathie ist eine der Hauptursachen für Blindheit. Die kontinuierliche Suche nach pharmakologischen Wirkstoffen mit besserer Wirksamkeit und längerer Wirkung zur Behandlung der diabetischen Retinopathie geht weiter.Der Prozess der Entdeckung pharmakologischer Wirkstoffe in präklinischen Tiermodellen spielt eine entscheidende Rolle. Diese Tiermodelle helfen, die strukturellen und funktionellen Veränderungen der hinteren Segmentgewebe des Auges zu verstehen. Daher werden wir drei verschiedene Techniken demonstrieren, um diese Veränderungen in den hinteren Segmentproblemen zu untersuchen.Wir demonstrieren Histologie, um morphologische Veränderungen von Netzhautzellen in Schichten zu untersuchen, BRB-Breakdown-Assay zur Untersuchung von kompromittiertem BRB durch Quantifizierung von ausgetretenem Protein im Glaskörper aus Plasma und auch Fluoreszenzangiographie, um retinale Gefäße mit FITC-Dextran-Farbstoff zu visualisieren. Euthanasieren Sie die Ratte mit einer hohen Dosis von Pentobarbital und bestätigen Sie ihren Tod ohne nachweisbaren Herzschlag. Enukleieren Sie das Auge, indem Sie Einschnitte mit einer Skalpellklinge an den Nasen- und Schläfenregionen des Auges vornehmen.Schneiden Sie dann entlang der Kanten, um das Auge aus der Orbitalhöhle zu entfernen. Entfernen Sie das überschüssige Fett, das das Auge umgibt, und legen Sie es in 5 ml Fixierlösung. Inkubieren Sie das Auge in fixativer Lösung für 24 bis 48 Stunden.Entfernen Sie nach der Fixierung das Auge aus der Fixierlösung und geben Sie es in die Petrischale, die mit 10 ml PBS gefüllt ist. Halten Sie mit einer Mikropinzette das Auge mit Sehnerv und machen Sie mit Hilfe einer Mikroschere einen Riegel an Pars plana. Schneiden Sie den gesamten Rand der Hornhaut durch, um die vordere Tasse und die hintere Augenmuschel zu trennen.Entfernen Sie die Linse und schneiden Sie den Sehnerv ab. Schneiden Sie den hinteren Becher in zwei Hälften und passieren Sie den Sehnerv. Jede Hälfte in die einzelnen Kassetten geben.Dehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie die Konzentration von Ethanol schrittweise von 50% auf 100% Ethanol erhöhen. Und schließlich, klären Sie das Ethanol mit Xylol. Imprägnieren Sie das Gewebe mit vorgewärmtem Paraffin bei 60 Grad Celsius, um Xylol im Gewebe zu ersetzen.Bereiten Sie die Paraffinblöcke mit einer Stahlform vor, um das Gewebe und die Kassette als Basis zu halten. Während der Vorbereitung des Blocks sollte der optische Scheibenteil des Auges dem Boden der Stahlform zugewandt sein. Füllen Sie die Kassette mit Paraffin und geben Sie sie auf eine kühle Oberfläche.Befestigen Sie die Klinge und die Kassette auf den jeweiligen Haltern auf Mikrotom. Schneiden Sie mit einem Mikrotom das überschüssige Paraffinwachs ab und schneiden Sie ein Band aus fünf bis sechs Abschnitten mit einer Dicke von 5 Mikrometern. Übertragen Sie das Band auf die Oberfläche des vorgewärmten Wasserbades, um das Band zu entfalten.Sammeln Sie die Abschnitte auf einem mit Albumin beschichteten Glasobjektträger. Lassen Sie die Rutschen über Nacht bei 37 Grad Celsius trocknen. Um Hämatoxylin und Eosin zu färben, heizen Sie die Objektträger bei 60 Grad Celsius für 1 Stunde vor, um das Paraffin zu schmelzen.Befolgen Sie das Färbeverfahren, wie es im Manuskript angegeben ist. Beginnen Sie mit der Rehydratation von Gewebe und färben Sie dann mit Hämatoxylin gefolgt von Eosin. Dehydrieren Sie nun das Gewebe und fügen Sie Montagemedium auf die Abschnitte hinzu.Legen Sie den Deckzettel auf Abschnitte und visualisieren Sie ihn unter dem Lichtmikroskop. Um einen Blut-Netzhaut-Barriere-Abbau-Assay durchzuführen, betäuben Sie die Ratte mit Ketamin und Xylazin und bestätigen Sie den Anästhesiezustand durch Zehenkneipe. Suchen Sie das Herz und führen Sie 1 ml Spritze mit 24-Gauge-Nadel ein, um das Blut durch Herzpunktion zu entnehmen.Sobald das ausreichende Blut gesammelt ist, geben Sie es in ein EDTA-beschichtetes Rohr. Mischen Sie es vorsichtig, um Hämolyse zu verhindern. Enukleieren Sie das Auge und übertragen Sie es sofort auf Trockeneis.Beginnen Sie unter gefrorenen Bedingungen mit der Sezierung des Auges durch Entfernung von Hornhaut und Linse. Ziehen Sie den Glaskörper aus dem hinteren Augensegment mit einer Pinzette ohne Kontamination durch die Netzhaut. Übertragen Sie es auf ein homogenisierendes Rohr mit drei bis vier Perlen.Homogenisieren Sie die Proben mit einem Perlenhomogenisator bei mittlerer Geschwindigkeit für 10 Sekunden. Blut- und Glaskörperproben in Mikrozentrifugenröhrchen zur weiteren Verarbeitung überführen. Zentrifugieren Sie beide Proben bei 5.200 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius.Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette und fügen Sie 250 Mikroliter Bradford-Reagenz in Vertiefungen hinzu. Verdünnen Sie Glaskörperproben 10 Mal und Plasmaproben 20 Mal mit PBS. Fügen Sie 5 Mikroliter verdünnte Proben zu Bradford-Reagenz hinzu und mischen Sie gut.Inkubieren Sie die Proben für 20 bis 30 Minuten und messen Sie dann die Absorption bei 590 Nanometern mit einem 96-Well-Plattenleser. Die Intensität der Probe ist direkt proportional zur Proteinkonzentration. Um eine Fluoreszenzangiographie durchzuführen, betäuben Sie die Ratte mit 3% Isofluran und bestätigen Sie den Anästhesiezustand durch Zehenschlag.Tauchen Sie den Schwanz in warmes Wasser, bevor Sie den Farbstoff injizieren. Injizieren Sie 1 ml 50 mg FITC-Dextran-Lösung pro ml in die laterale Schwanzvene. Lassen Sie den Farbstoff 5 bis 10 Minuten zirkulieren.Euthanasieren Sie die Ratte mit Pentobarbital und bestätigen Sie ihren Tod ohne nachweisbaren Herzschlag. Enukleieren Sie das Auge und fahren Sie mit der Vorbereitung der flachen Montierung fort. Um die retinale flache Montierung vorzubereiten, legen Sie das Auge auf einen faserfreien Kimwipe und schneiden Sie den vorderen Teil des Auges ab.Ziehen Sie langsam die Linse, zusammen mit dem Glaskörper, aus dem hinteren Segment des Auges. Übertragen Sie das hintere Segment in eine mit PBS gefüllte Petrischale und schneiden Sie den Sehnerv ab. Platzieren Sie nun die Spitze der spitzen Pinzette zwischen Sklera und Netzhaut.Bewegen Sie es vorsichtig entlang des Randes der Tasse, um sicherzustellen, dass die Netzhaut zu keinem Zeitpunkt an der Sklera befestigt ist. In der Nähe der optischen Scheibe schneiden, so dass sich die Netzhaut vollständig von der Sklera löst. Sobald bestätigt ist, dass die Netzhaut auf keiner Seite an Sklera befestigt ist, drücken Sie sie langsam in die PBS-Lösung.Übertragen Sie die Netzhaut mit Hilfe einer Pinzette auf einen sauberen Glasschieber, ohne sie zu beschädigen. Machen Sie mit einer Mikroschere oder einer Skalpellklinge vier Schnitte auf der Netzhaut, wie gezeigt, um sie in vier Quadranten zu unterteilen. Entfernen Sie überschüssiges PBS aus der Netzhautumgebung und fügen Sie Anti-Fading-Montagemedium auf der retinalen flachen Halterung hinzu.Decken Sie es mit einem Deckglas ab und visualisieren Sie die flache Halterung unter dem konfokalen Mikroskop. Es ist wichtig zu beachten, dass der gesamte Prozess der Fluoreszenzangiographie unter minimalem Licht durchgeführt wird, um das Abschrecken der Fluoreszenz aus FITC-Dextran-Farbstoff zu vermeiden. Bei diabetischen Ratten erleiden die Netzhautzellen eine Degeneration, die zu weiteren Komplikationen führt.Diese strukturellen Veränderungen können durch Histologietechnik visualisiert werden, um die Zellzahl und -dicke der Netzhaut zu bestimmen. Bei diabetischen Ratten nimmt die Dicke der Netzhautschichten aufgrund von Ödemen zu. Daher hilft diese Technik, verschiedene potenzielle pharmakologische Wirkstoffe zur Behandlung der diabetischen Retinopathie zu untersuchen.Metabolische Veränderungen in der Netzhaut aufgrund von Diabetes verursachen den Verlust von Perizyten und den Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke. Da Protein und andere Biomoleküle in die Netzhaut und den Glaskörper austreten, steigt der Gesamtproteinspiegel im Glaskörper von diabetischen Ratten. Die Verhinderung des Abbaus der Blut-Netzhaut-Schranke könnte das Fortschreiten der diabetischen Retinopathie erheblich behindern.Bei der diabetischen Retinopathie steigt die Expression des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors, was zur Bildung neuer Gefäße führt. Diese Gefäße stören die normale Netzhautstruktur, und daher ist ihre Innervation von primärer Bedeutung für die Behandlung der diabetischen Retinopathie. Die Fluoreszenzangiographie-Technik wird verwendet, um neue Blutgefäße und auch das Auslaufen von Blutgefäßen zu visualisieren, wie hier hervorgehoben.Die Angiogenese ist jedoch erst nach sechs bis 12 Monaten Diabetes-Induktion prominent. Diese Technik hilft uns, die Wirkung der medikamentösen Behandlung auf die Innervation der Angiogenese und der vaskulären Leckage zu quantifizieren. Die zukünftige Behandlung der diabetischen Retinopathie erfordert effizientere pharmakologische Wirkstoffe, aber die zukünftigen Behandlungen können nur durch ein besseres Verständnis der Krankheitspathogenese erreicht werden.Die Beherrschung dieser Techniken könnte den Forschern helfen, die Pathogenese der diabetischen Retinopathie besser zu verstehen, was zu einer Entdeckung besserer pharmakologischer Interventionen führen könnte.

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