Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

מחברים רוצים להכיר המועצה ההודית למחקר רפואי (ICMR; ITR-2020-2882) למימון תמיכה לד"ר נירמל ג'יי. ברצוננו גם להודות למענק האוניברסיטה של הנציבות על מתן מלגת מחקר זוטרה למנשה מלאני ולמתקן המעבדה האנליטית המרכזית, BITS-Pilani, קמפוס היידראבאד על אספקת מתקן תשתיתי.

פרוטוקול זה פועל על פי כל ההנחיות לטיפול בבעלי חיים המסופקות על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים, BITS-Pilani, קמפוס היידראבאד.
1. היסטולוגיה רשתית
<ol><li>עידוד וקיבעון של העין<ol>
<li>המתת חסד של חולדה זכרית ויסטאר סוכרתית בת 2 עד 3 חודשים יחד עם השליטה המותאמת לגיל (בת 14 ...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathophysiology+and+treatments.">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats.">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li><li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

היסטולוגיה היסטולוגיה רשתית מבוצעת כדי לדמיין את השינויים המורפולוגיים של תאי רשתית ושכבות. צעדים שונים, כולל בחירה של פתרון קבוע, משך קיבעון, התייבשות, והספגת פרפין, צריך להיות ממוטב. גודל הרקמה לא יעלה על 3 מ"מ, כמו חדירה קבועה הופכת איטית. 4% paraformaldehyde נפוץ מוביל ניתוק רשתית אפיל?...

רטינופתיה סוכרתית (DR) היא אחד הסיבוכים המשניים המורכבים ביותר של סוכרת. זהו גם הגורם המוביל לעיוורון ניתן למניעה באוכלוסייה בגיל העבודה ברחבי העולם. במטא-אנליזה שנערכה לאחרונה בקרב 32.4 מיליון עיוורים, 830,000 (2.6%) אנשים היו עיוורים עקב DR1. שיעור אובדן הראייה המיוחס לסוכרת דורג במקום השביעי בשנת 2015 עם 1.06% (0.15-2.38) ברחבי העולם 2,3.
רטינופתיה סוכרתית מאובחנת על ידי חריגות בכלי הדם ברקמות העין האחוריות. מבחינה קלינית, הוא מחולק לשני שלבים - DR לא שגשוג (NPDR) ו DR שגשוג (PDR), המבוסס על כלי הדם ברשתית. היפרגליקמיה נחשבת הרגולטור החזק של DR כפי שהוא מסבך מספר מסלולים המעורבים neurodegeneration4,5, דלקת6,7, ו microvasculature8 ברשתית. סיבוכים מטבוליים מרובים הנגרמים עקב היפרגליקמיה כוללים הצטברות של מוצרי קצה גליקציה מתקדמים (AGEs), מסלול פוליאול, מסלול הקסוסמין, מסלול קינאז-C חלבון. מסלולים אלה אחראים על התפשטות התאים (תאי אנדותל), הגירה (pericytes) ואפופטוזיס (תאי רשתית עצבית, pericytes, ותאי אנדותל) המבוססים על שלבים שונים של רטינופתיה סוכרתית. שינויים מטבוליים אלה יכולים להוביל לשינויים פיזיולוגיים כגון ניתוק רשתית, אובדן תאי רשתית, פירוק מחסום רשתית הדם (BRB), מפרצות, ו אנגיוגנזה9.
סטרפטוזוטוצין (STZ) הנגרמת על ידי סוכרת מסוג 1 היא פרקטיקה מבוססת ומקובלת בחולדות להערכת סוכרת פתוגנזה וסיבוכיה. ההשפעות Diabetogenic של STZ נובעים הרס סלקטיבי של אי הלבלב β תאים10. כתוצאה מכך, בעלי החיים יעברו מחסור באינסולין, היפרגליקמיה, פולידיפסיה ופוליאוריה, שכולם אופייניים לסוכרת מסוג 1 אנושית11. עבור אינדוקציה סוכרת חמורה, STZ מנוהל ב 40-65 מ"ג /ק"ג משקל גוף תוך ורידי או תוך-פריטוני במהלך הבגרות. לאחר כ 72 שעות, בעלי חיים אלה מציגים רמות הגלוקוז בדם גדול מ 250 מ"ג / dL10,12.
כדי להבין את השינויים הפיזיולוגיים של הרשתית עקב ניוון עצבי, דלקת, אנגיוגנזה, טכניקות שונות צריך להיות אופטימיזציה במודלים בעלי חיים ניסיוניים. שינויים מבניים ותפקודיים בתאי רשתית וכלי רשתית ניתן ללמוד על ידי טכניקות שונות כגון היסטולוגיה, בדיקת התמוטטות BRB, אנגיוגרפיה פלואורסצנטית.
היסטולוגיה כוללת את חקר האנטומיה של תאים, רקמות ואיברים ברמה מיקרוסקופית. זה יוצר מתאם בין המבנה והתפקוד של תאים / רקמה. מספר שלבים מבוצעים כדי לדמיין ולזהות את השינויים המיקרוסקופיים במבנה הרקמה, ובכך להשוות עמיתים בריאים וחולים13. לפיכך, חיוני לתקנן כל שלב של היסטולוגיה בקפדנות. שלבים שונים המעורבים בהיסטולוגיה של הרשתית הם קיבוע הדגימה, חיתוך הדגימה, התייבשות, ניקוי, הספגה עם פרפין, הטמעת פרפין, חתך וכתמים (כתמי המטוקסילין ואאוזין)13,14.
ברשתית בריאה, הובלת מולקולות על פני הרשתית נשלטת על ידי BRB, המורכב מתאי אנדותל ופריקים בצד הפנימי, ותאי אפיתל פיגמנט רשתית בצד החיצוני. עם זאת, תאי אנדותל BRB פנימיים ו pericytes להתחיל ניוון במהלך המצב החולה, ו BRB נפגע גם 15. עקב התמוטטות BRB זו, מולקולות משקל מולקולרי נמוך רבות דולפות לתוך רקמת הזגוגית והרשתית16. ככל שהמחלה מתקדמת, מולקולות חלבון רבות אחרות (משקל מולקולרי נמוך וגבוה) דולפות גם הן לרקמת הזגוגית והרשתית עקב הפרעות הומאוסטזיס17. זה מוביל לסיבוכים שונים אחרים ובסופו של דבר בצקת מקולרית ועיוורון. לפיכך, כימות רמות החלבון בזגוגית והשוואת מצבים בריאים וסוכרתיים מדדים נפגע BRB.
אנגיוגרפיה פלואורסצנטית היא טכניקה המשמשת לחקר זרימת הדם של הרשתית והכורואיד באמצעות צבע פלואורסצנטי. הוא משמש כדי לדמיין vasculature של הרשתית choroid על ידי הזרקת צבע פלואורסצ'ין באמצעות מסלול תוך ורידי או הזרקת לב18. ברגע שהצבע מוזרק, הוא מגיע תחילה לעורקי הרשתית, ואחריו ורידים ברשתית. מחזור זה של צבע הושלם בדרך כלל בתוך 5 עד 10 דקות מן הזרקת צבע19. זוהי טכניקה חשובה לאבחון מחלות עיניים שונות בחלק האחורי, כולל רטינופתיה סוכרתית וניאווסקולריזציה choroidal20. זה עוזר לזהות שינויים כלליים וקטנים בכלי דם גדולים וקטנים בתנאים נורמליים וחולים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

מחלת עיניים אחורית כמו רטינופתיה סוכרתית משנה את הפיזיולוגיה של הרשתית. רטינופתיה סוכרתית מאופיינת על ידי ניתוק רשתית, פירוק של מחסום רשתית הדם (BRB), ו אנגיוגנזה ברשתית. מודל חולדת in vivo הוא כלי ניסיוני בעל ערך כדי לבחון את השינויים במבנה ובתפקוד של הרשתית. אנו מציעים שלוש טכניקות ניסיוניות שונות במודל החולדה כדי לזהות שינויים מורפולוגיים של תאי רשתית, כלי רשתית, ו BRB נפגע. היסטולוגיה רשתית משמשת לחקר המורפולוגיה של תאי רשתית שונים. כמו כן, מדידה כמותית מבוצעת על ידי ספירת תאי רשתית ומדידת עובי של שכבות רשתית שונות. בדיקת פירוק BRB משמשת כדי לקבוע את הדליפה של חלבונים חוץ-עיניים מהפלזמה לרקמה הזגוגית עקב התמוטטות של BRB. אנגיוגרפיה פלואורסצנטית משמשת לחקר אנגיוגנזה ודליפת כלי דם על ידי הדמיית כלי דם ברשתית באמצעות צבע FITC-dextran.

היסטולוגיה רשתית ברשתית הסוכרתית, תאי הרשתית עוברים ניוון. בנוסף, עובי שכבות הרשתית להגדיל עקב בצקת22. התמונות המתקבלות לאחר כתמי המטוקסילין ואאוזין יכולות לשמש לספירת תאים ומדידה של עובי שכבות שונות, כפי שמוצג באיור 2 באמצעות ImageJ.
<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

רטינופתיה סוכרתית היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. היסטולוגיה, בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, ואנגיוגרפיה פלואורסצנטית הן טכניקות בעלות ערך להבנת הפתופיזיולוגיה של הרשתית, אשר יכול לשפר עוד יותר את ההקרנה היעילה של סמים נגד רטינופתיה סוכרתית.

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

המטרה הכוללת של טכניקות אלה היא להעריך את הפתופיזיולוגיה הרשתית במודל חולדת רטינופתיה סוכרתית הנגרמת על ידי סטרפטוזוטוצין. רטינופתיה סוכרתית היא אחת הגורם המוביל לעיוורון. החיפוש המתמשך נמשך כדי לגלות סוכנים פרמקולוגיים עם יעילות טובה יותר ופעולה ארוכה יותר לטיפול רטינופתיה סוכרתית.התהליך של גילוי סוכנים פרמקולוגיים במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ממלא תפקיד חיוני. מודלים אלה של בעלי חיים מסייעים להבין את השינויים המבניים והתפקודיים של רקמות המקטע האחורי של העין. לכן, אנחנו נפגין שלוש טכניקות שונות כדי ללמוד את השינויים האלה בסוגיות המגזר האחורי.אנו מדגימים היסטולוגיה כדי לחקור שינויים מורפולוגיים של תאי רשתית בשכבות, בדיקת פירוק BRB כדי לחקור BRB נפגע על ידי כימות חלבון דלף בזגוגית מפלזמה, וגם אנגיוגרפיה פלואורסצ'ה לדמיין כלי רשתית באמצעות צבע FITC-dextran. המתת חסד חולדה באמצעות מינון גבוה של pentobarbital ולאשר את מותו ללא פעימות לב לגילוי. Enucleate העין על ידי ביצוע חתכים באמצעות להב אזמל על האף ואזורי הזמן של העין.ואז לחתוך לאורך הקצוות שלה כדי להסיר את העין משקע מסלולית. הסר את עודף השומן המקיף את העין ומניחים אותו ב 5 מ"ל של פתרון קבוע. לדגור על העין בתמיסה קבועה במשך 24 עד 48 שעות.לאחר קיבעון, להסיר את העין מן הפתרון הקבוע ולהעביר צלחת פטרי מלא 10 מ"ל PBS. באמצעות מיקרו מלקחיים, להחזיק את העין עם עצב הראייה ולעשות ניק ב pars פלאנה בעזרת מספריים מיקרו. חותכים את כל השוליים של הקרנית כדי להפריד את הכוס הקדמית ואת העין האחורית.הסר את העדשה ולחתוך את עצב הראייה. חותכים את הכוס האחורית לשני חצאים, עובר דרך עצב הראייה. מעבירים כל חצי לקלטות הנפרדות.לייבש את הרקמה על ידי הגדלת בהדרגה את הריכוז של אתנול מ 50% ל 100% אתנול. ולבסוף, לנקות את האתנול עם קסילן. להפרות את הרקמה עם פרפין מחומם מראש ב 60 מעלות צלזיוס להחליף קסילן ברקמה.הכן את בלוקי הפרפין באמצעות תבנית פלדה להחזיק את הרקמה ואת הקלטת כבסיס שלה. בעת הכנת הבלוק, חלק הדיסק האופטי של העין צריך להתמודד עם החלק התחתון של עובש פלדה. ממלאים את הקסטה בפרפין ומעבירים אותה למשטח קריר.הר את הלהב והקלטת על המחזיקים המתאימים על מיקרוטום. בעזרת מיקרוטומיה, חותכים את שעוות הפרפין העודפת וחותכים סרט של חמישה עד שישה חלקים בעובי של 5 מיקרומטר. העבר את הסרט אל פני השטח של אמבט מים שחומם מראש כדי לפתוח את הסרט.לאסוף את החלקים על שקופית זכוכית מצופה אלבומין. אפשר את השקופיות להתייבש לילה ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לבצע כתמי המטוקסילין ואאוזין, מחממים מראש את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי להמיס את הפרפין.בצע את הליך ההכתמה כפי שניתן בכתב היד. התחל עם rehydration של רקמות, ולאחר מכן כתם עם המטוקסילין ואחריו אאוזין. עכשיו, לייבש את הרקמה ולהוסיף מדיום הרכבה על החלקים.מניחים את תלוש הכיסוי על מקטעים ומדמיינים תחת מיקרוסקופ אור. כדי לבצע בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, להרדים את החולדה באמצעות קטמין וקסילאזין ולאשר את מצב ההרדמה על ידי צביטת בוהן. אתר את הלב והכנס מזרק 1 מ"ל עם מחט 24-מד כדי לצייר את הדם על ידי ניקוב לב.לאחר איסוף הדם המספיק, העבר אותו לצינור מצופה EDTA. מערבבים אותו בעדינות כדי למנוע המוליזה. עורר את העין והעבר אותה מיד לקרח יבש.בתנאים קפואים, להתחיל את הניתוח של העין על ידי הסרת הקרנית והעדשה. משוך את הזגוגית מן החלק האחורי של העין באמצעות מלקחיים ללא כל זיהום מרשתית. העבר אותו לצינור הומוגני עם שלושה עד ארבעה חרוזים.הומוגניזציה הדגימות באמצעות הומוגניזר חרוזים במהירות בינונית במשך 10 שניות. העבר דם ודגימות הומור זגוגיות לתוך צינורות microcentrifuge כדי לעבד עוד יותר. צנטריפוגה שתי הדגימות ב 5, 200 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.בעזרת פיפטה רב ערוצית, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של ריאגנט ברדפורד לבארות. לדלל דגימות זגוגית 10 פעמים ודגימות פלזמה 20 פעמים באמצעות PBS. מוסיפים 5 מיקרוליטרים של דגימות מדוללות לריגנט ברדפורד ומערבבים היטב.לדגור על הדגימות במשך 20 עד 30 דקות, ולאחר מכן למדוד את הספיגה ב 590 ננומטר באמצעות קורא צלחת 96-well. עוצמת המדגם היא פרופורציונלית ישירות לריכוז החלבון. כדי לבצע אנגיוגרפיה פלואורסצנטית, להרדים את החולדה באמצעות 3% איזופלוריין ולאשר את מצב ההרדמה על ידי אגרוף הבוהן.טובלים את הזנב במים חמים לפני הזרקת הצבע. להזריק 1 מ"ל של 50 מ"ג לכל mL FITC-dextran פתרון לתוך וריד זנב לרוחב. אפשר את הצבע להסתובב במשך 5 עד 10 דקות.להרדים את החולדה באמצעות pentobarbital ולאשר את מותו על ידי פעימות לב לגילוי. לעטוף את העין ולהמשיך להכנת הרכבה שטוחה. כדי להכין הרכבה שטוחה ברשתית, מניחים את העין על קימוויפה ללא סיבים וחותכים את החלק הקדמי של העין.משכו באיטיות את העדשה, יחד עם ההומור הזגוגי, מהחלק האחורי של העין. מעבירים את החלק האחורי לצלחת פטרי מלאה ב- PBS וחותכים את עצב הראייה. עכשיו, למקם את קצה המלקחיים המחודדים בין סקלרה ורשתית.הזיזו אותו בעדינות לאורך כל שפת הכוס כדי לוודא שהרשתית אינה מחוברת לסקלרה בשום שלב. חותכים ליד הדיסק האופטי, כך שהרשתית מתנתקת לחלוטין מהסקלרה. ברגע שהוא אישר כי רשתית אינה מחוברת sclera מכל צד, לדחוף אותו לאט לתוך פתרון PBS.בעזרת מלקחיים, מעבירים את הרשתית למגלשת זכוכית נקייה מבלי לגרום לה נזק. באמצעות מיקרו מספריים או להב אזמל, לעשות ארבעה חתכים על הרשתית, כפי שמוצג, כדי לחלק אותו לארבעה רבעים. הסר PBS עודף מסביבת הרשתית והוסף מדיום הרכבה אנטי דהייה על הרכבה שטוחה ברשתית.לכסות אותו עם כיסוי ולדמיין את ההרכבה השטוחה תחת מיקרוסקופ קונפוקל. חשוב לציין כאן כי כל התהליך של אנגיוגרפיה פלואורסצנטית מבוצע תחת אור מינימלי כדי למנוע את מרווה של פלואורסצנטיות מצבע FITC-dextran. בחולדה סוכרתית, תאי הרשתית עוברים ניוון, מה שמוביל לסיבוכים נוספים.שינויים מבניים אלה ניתן לדמיין על ידי טכניקה היסטולוגית כדי לקבוע את מספר התא ואת עובי הרשתית. במקרה של חולדות סוכרתיות, עובי שכבות הרשתית עולה עקב בצקת. לפיכך, טכניקה זו מסייעת לסנן סוכנים פרמקולוגיים פוטנציאליים שונים לטיפול רטינופתיה סוכרתית.שינויים מטבוליים ברשתית עקב סוכרת גורם לאובדן של pericytes ופירוק של מחסום רשתית הדם. כפי שיש דליפה של חלבון וביומולקולות אחרות לתוך רשתית וזגוגית, רמות החלבון הכולל להגדיל את הזגוגית של חולדות סוכרת. מניעת פירוק של מחסום רשתית הדם עלולה לעכב באופן משמעותי את ההתקדמות של רטינופתיה סוכרתית.ברטינופתיה סוכרתית, ביטוי של גורם גדילה אנדותל כלי דם מגביר שמוביל להיווצרות של כלי חדשים. כלי דם אלה מפריעים למבנה הרשתית הרגיל, ולכן innervation שלה הוא של דאגה עיקרית לטיפול רטינופתיה סוכרתית. טכניקת אנגיוגרפיה פלואורסצנטית משמשת כדי לדמיין כלי דם חדשים וגם דליפה של כלי דם, כפי שמודגש כאן.עם זאת, אנגיוגנזה בולטת רק לאחר שישה עד 12 חודשים של אינדוקציה סוכרת. טכניקה זו מסייעת לנו לכמת את ההשפעה של טיפול תרופתי על innervation של אנגיוגנזה ודליפת כלי דם. הטיפול העתידי של רטינופתיה סוכרתית צריך סוכנים פרמקולוגיים יעילים יותר, אבל הטיפולים העתידיים יכולים להיות מושגים רק באמצעות הבנה טובה יותר של המחלה פתוגנזה.שליטה בטכניקות אלה יכולה לעזור לחוקרים לקבל הבנה טובה יותר על פתוגנזה של רטינופתיה סוכרתית, אשר יכול להוביל לגילוי של התערבויות פרמקולוגיות טובות יותר.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

דגם של עירוי מזין כרוני בחולדה

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

הערכה של תת-יקוציט חדירת גידול בדגם גידול תת עורי

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

הערכה של זרימת דם מוחין Autoregulation בעכברוש באמצעות לייזר דופלר Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

דיקור במודל עכברוש של אסטמה

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...