Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Gli autori vorrebbero riconoscere l'Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) per il sostegno finanziario al Dr. Nirmal J. Vorremmo anche ringraziare la university grant of Commission per aver fornito una junior research fellowship a Manisha Malani e central analytical laboratory facility, BITS-Pilani, hyderabad campus per aver fornito strutture infrastrutturali.

Questo protocollo segue tutte le linee guida per la cura degli animali fornite dal Comitato etico istituzionale degli animali, BITS-Pilani, campus di Hyderabad.
1. Istologia retinica
<ol><li>Enucleazione e fissazione dell'occhio<ol>
<li>Eutanasia di un ratto maschio Wistar diabetico di 2-3 mesi insieme al controllo di pari età (da 14 a 15 settimane) utilizzando un'alta dose di pentobarbital (150 mg / kg) iniettato attraverso la via intraperitoneale. Nessun battito cardiaco ...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Istologia L'istologia retinica viene eseguita per visualizzare i cambiamenti morfologici delle cellule e degli strati retinici. Vari passaggi, tra cui la scelta della soluzione fissativa, la durata della fissazione, la disidratazione e l'impregnazione di paraffina, devono essere ottimizzati. La dimensione del tessuto non deve superare i 3 mm, poiché la penetrazione fissativa diventa lenta. La paraformaldeide al 4% comunemente usata porta al distacco della retina anche nell'occhio sano a causa dell'os...

La retinopatia diabetica (DR) è una delle complicanze secondarie più complesse del diabete mellito. È anche la principale causa di cecità prevenibile nella popolazione in età lavorativa in tutto il mondo. In una recente meta-analisi di 32,4 milioni di persone non vedenti, 830.000 (2,6%) persone erano cieche a causa di DR1. La percentuale di perdita della vista attribuita al diabete si è classificata settima nel 2015 all'1,06% (0,15-2,38) a livello globale2,3.
La retinopatia diabetica è diagnosticata da anomalie vascolari nei tessuti oculari posteriori. Clinicamente, è diviso in due fasi: DR non proliferativo (NPDR) e DR proliferativo (PDR), basato sulla vascolarizzazione nella retina. L'iperglicemia è considerata il potente regolatore della DR in quanto coinvolge diversi percorsi coinvolti nella neurodegenerazione4,5, nell'infiammazione6,7 e nella microvascolarizzazione8 nella retina. Molteplici complicanze metaboliche indotte a causa dell'iperglicemia includono l'accumulo di prodotti finali avanzati di glicazione (AGE), la via poliolica, la via esosamina e la via proteina chinasi-C. Queste vie sono responsabili della proliferazione cellulare (cellule endoteliali), della migrazione (periciti) e dell'apoptosi (cellule retiniche neurali, periciti e cellule endoteliali) basate su diversi stadi della retinopatia diabetica. Queste alterazioni metaboliche possono portare a cambiamenti fisiologici come il distacco della retina, la perdita di cellule retiniche, la rottura della barriera emato-retinica (BRB), gli aneurismi e l'angiogenesi9.
Il diabete di tipo 1 indotto da streptozotocina (STZ) è una pratica ben consolidata e ben accettata nei ratti per valutare la patogenesi del diabete e le sue complicanze. Gli effetti diabetogeni della STZ sono dovuti alla distruzione selettiva delle cellule β delle isole pancreatiche10. Di conseguenza, gli animali subiranno carenza di insulina, iperglicemia, polidipsia e poliuria, che sono tutti caratteristici del diabete mellito di tipo 1 umano11. Per l'induzione del diabete grave, STZ viene somministrato a 40-65 mg / kg di peso corporeo per via endovenosa o intraperitoneale durante l'età adulta. Dopo circa 72 ore, questi animali presentano livelli di glucosio nel sangue superiori a 250 mg/dL10,12.
Per comprendere le alterazioni fisiologiche della retina dovute alla neurodegenerazione, all'infiammazione e all'angiogenesi, diverse tecniche dovrebbero essere ottimizzate in modelli animali sperimentali. I cambiamenti strutturali e funzionali nelle cellule retiniche e nei vasi retinici possono essere studiati con varie tecniche come l'istologia, il saggio di degradazione BRB e l'angiografia a fluorescenza.
L'istologia comporta lo studio dell'anatomia di cellule, tessuti e organi a livello microscopico. Stabilisce una correlazione tra la struttura e la funzione delle cellule/tessuti. Vengono eseguiti diversi passaggi per visualizzare e identificare le alterazioni microscopiche nella struttura dei tessuti, confrontando così le controparti sane e malate13. Quindi, è essenziale standardizzare meticolosamente ogni fase dell'istologia. Vari passaggi coinvolti nell'istologia retinica sono la fissazione del campione, il taglio del campione, la disidratazione, la pulizia, l'impregnazione con paraffina, l'incorporamento di paraffina, il sezionamento e la colorazione (colorazione di ematossilina ed eosina)13,14.
In una retina sana, il trasporto di molecole attraverso la retina è controllato da BRB, composto da cellule endoteliali e periciti sul lato interno e cellule epiteliali pigmentate retiniche sul lato esterno. Tuttavia, le cellule endoteliali BRB interne e i periciti iniziano a degenerare durante la condizione di malattia e anche la BRB è compromessa15. A causa di questa rottura del BRB, molte molecole a basso peso molecolare fuoriescono nel tessuto vitreo e retinico16. Con il progredire della malattia, molte altre molecole proteiche (a basso e alto peso molecolare) fuoriescono anche nel tessuto vitreo e retinico a causa di disturbi dell'omeostasi17. Porta a varie altre complicazioni e, infine, edema maculare e cecità. Quindi, quantificare i livelli di proteine nel vitreo e confrontare le misure degli stati sani e diabetici ha compromesso il BRB.
L'angiografia a fluorescenza è una tecnica utilizzata per studiare la circolazione sanguigna della retina e della coroide utilizzando colorante fluorescente. Viene utilizzato per visualizzare la vascolarizzazione della retina e della coroide iniettando colorante alla fluoresceina per via endovenosa o iniezione cardiaca18. Una volta iniettato, il colorante raggiunge prima le arterie retiniche, seguite dalle vene retiniche. Questa circolazione del colorante viene solitamente completata entro 5-10 minuti dall'iniezione del colorante19. È una tecnica importante per diagnosticare varie malattie oculari del segmento posteriore, tra cui la retinopatia diabetica e la neovascolarizzazione coroidale20. Aiuta a rilevare i cambiamenti vascolari maggiori e minori in condizioni normali e malate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

Una malattia dell'occhio del segmento posteriore come la retinopatia diabetica altera la fisiologia della retina. La retinopatia diabetica è caratterizzata da un distacco di retina, dalla rottura della barriera emato-retinica (BRB) e dall'angiogenesi retinica. Un modello di ratto in vivo è un prezioso strumento sperimentale per esaminare i cambiamenti nella struttura e nella funzione della retina. Proponiamo tre diverse tecniche sperimentali nel modello di ratto per identificare i cambiamenti morfologici delle cellule retiniche, della vascolarizzazione retinica e della BRB compromessa. L'istologia retinica viene utilizzata per studiare la morfologia di varie cellule retiniche. Inoltre, la misurazione quantitativa viene eseguita mediante conteggio delle cellule retiniche e misurazione dello spessore di diversi strati retinici. Un test di degradazione BRB viene utilizzato per determinare la perdita di proteine extraoculari dal plasma al tessuto vitreo a causa della rottura di BRB. L'angiografia a fluorescenza viene utilizzata per studiare l'angiogenesi e la perdita dei vasi sanguigni visualizzando la vascolarizzazione retinica utilizzando il colorante FITC-destrano.

Istologia retinica Nella retina diabetica, le cellule retiniche subiscono una degenerazione. Inoltre, lo spessore degli strati retinici aumenta a causa dell'edema22. Le immagini ottenute dopo la colorazione di ematossilina ed eosina possono essere utilizzate per il conteggio delle cellule e la misurazione dello spessore di diversi strati, come mostrato nella Figura 2 utilizzando ImageJ.
Analisi di degradazione de...

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Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

La retinopatia diabetica è una delle principali cause di cecità. L'istologia, il test di rottura della barriera emato-retinica e l'angiografia a fluorescenza sono tecniche preziose per comprendere la fisiopatologia della retina, che potrebbe migliorare ulteriormente l'efficiente screening farmacologico contro la retinopatia diabetica.

Valutazione fisiopatologica retinica in un modello di ratto

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

L'obiettivo generale di queste tecniche è quello di valutare la fisiopatologia retinica nel modello di ratto di retinopatia diabetica indotta da streptozotocina. La retinopatia diabetica è una delle principali cause di cecità. La continua ricerca è in corso per scoprire agenti farmacologici con migliore efficacia e azione più lunga per il trattamento della retinopatia diabetica.Il processo di scoperta di agenti farmacologici in modelli animali pre-clinici svolge un ruolo vitale. Questi modelli animali aiutano a comprendere le alterazioni strutturali e funzionali dei tessuti del segmento posteriore dell'occhio. Pertanto, dimostreremo tre diverse tecniche per studiare queste alterazioni nei problemi del segmento posteriore.Stiamo dimostrando l'istologia per studiare i cambiamenti morfologici delle cellule retiniche negli strati, il saggio di degradazione BRB per studiare il BRB compromesso quantificando la proteina fuoriuscita nel vitreo dal plasma e anche l'angiografia fluorescente per visualizzare la vascolarizzazione retinica utilizzando il colorante FITC-destrano. Eutanasia ratto con alte dosi di pentobarbital e confermare la sua morte senza battito cardiaco rilevabile. Enucleare l'occhio facendo incisioni usando una lama di bisturi sulle regioni nasali e temporali dell'occhio.Quindi tagliare lungo i bordi per rimuovere l'occhio dalla cavità orbitale. Rimuovere il grasso in eccesso che circonda l'occhio e metterlo in 5 ml di soluzione fissativa. Incubare l'occhio in soluzione fissativa per 24-48 ore.Dopo la fissazione, rimuovere l'occhio dalla soluzione fissativa e trasferire nella capsula di Petri riempita con 10 ml di PBS. Usando micro pinze, tieni l'occhio con il nervo ottico e fai un nick a pars plana con l'aiuto di micro forbici. Tagliare l'intero margine della cornea per separare la coppa anteriore e la coppa posteriore dell'occhio.Rimuovere la lente e tagliare il nervo ottico. Tagliare la coppa posteriore in due metà, passando attraverso il nervo ottico. Trasferire ogni metà nelle cassette separate.Disidratare il tessuto aumentando gradualmente la concentrazione di etanolo dal 50% al 100% di etanolo. E infine, eliminare l'etanolo con xilene. Impregnare il tessuto con paraffina preriscaldata a 60 gradi Celsius per sostituire lo xilene nel tessuto.Preparare i blocchi di paraffina usando uno stampo in acciaio per tenere il tessuto e la cassetta come base. Durante la preparazione del blocco, la porzione del disco ottico dell'occhio dovrebbe essere rivolta verso il fondo dello stampo in acciaio. Riempire la cassetta con paraffina e trasferirla su una superficie fredda.Montare la lama e la cassetta sui rispettivi supporti su microtomo. Usando un microtomo, tagliare la cera di paraffina in eccesso e tagliare un nastro da cinque a sei sezioni con uno spessore di 5 micrometri. Trasferire il nastro sulla superficie del bagno d'acqua preriscaldato per aprire il nastro.Raccogli le sezioni su una diapositiva di vetro rivestita di albumina. Lasciare asciugare le diapositive durante la notte a 37 gradi Celsius. Per eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina, preriscaldare i vetrini a 60 gradi Celsius per 1 ora per sciogliere la paraffina.Seguire la procedura di colorazione come indicato nel manoscritto. Inizia con la reidratazione del tessuto e poi colora con ematossilina seguita da Eosina. Ora, disidratare il tessuto e aggiungere il mezzo di montaggio sulle sezioni.Posizionare il coperchio sulle sezioni e visualizzare al microscopio ottico. Per eseguire il test di rottura della barriera emato-retinica, anestetizzare il ratto usando ketamina e xilazina e confermare lo stato anestetico con il pizzico della punta. Individuare il cuore e inserire 1 mL di siringa con ago calibro 24 per prelevare il sangue mediante puntura cardiaca.Una volta raccolto il sangue sufficiente, trasferirlo nel tubo rivestito con EDTA. Mescolare delicatamente per prevenire l'emolisi. Enucleare l'occhio e trasferirlo immediatamente sul ghiaccio secco.In condizioni congelate, iniziare la dissezione dell'occhio mediante rimozione della cornea e della lente. Tirare il vitreo dal segmento posteriore dell'occhio usando una pinza senza alcuna contaminazione dalla retina. Trasferirlo in tubo di omogeneizzazione con tre o quattro perline.Omogeneizzare i campioni utilizzando l'omogeneizzatore di perline a velocità media per 10 secondi. Trasferire campioni di sangue e umore vitreo in tubi di microcentrifuga per elaborare ulteriormente. Centrifugare entrambi i campioni a 5.200 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius.Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 250 microlitri di reagente Bradford nei pozzetti. Diluire i campioni vitrei 10 volte e i campioni di plasma 20 volte utilizzando PBS. Aggiungere 5 microlitri di campioni diluiti al reagente Bradford e mescolare bene.Incubare i campioni per 20-30 minuti, quindi misurare l'assorbanza a 590 nanometri utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. L'intensità del campione è direttamente proporzionale alla concentrazione di proteine. Per eseguire l'angiografia a fluorescenza, anestetizzare il ratto usando il 3% di isoflurano e confermare lo stato anestetico con il punzone della punta.Immergere la coda in acqua tiepida prima di iniettare il colorante. Iniettare 1 mL di 50 mg per mL di soluzione di FITC-destrano nella vena laterale della coda. Lasciare circolare il colorante per 5-10 minuti.Eutanasia del ratto usando pentobarbital e confermare la sua morte senza battito cardiaco rilevabile. Enucleare l'occhio e procedere per la preparazione del montaggio piatto. Per preparare la montatura piatta retinica, posizionare l'occhio su un Kimwipe privo di fibre e tagliare la parte anteriore dell'occhio.Tirare lentamente la lente, insieme all'umore vitreo, dal segmento posteriore dell'occhio. Trasferire il segmento posteriore nella capsula di Petri riempita con PBS e tagliare il nervo ottico. Ora, posiziona la punta del forcipite appuntito tra la sclera e la retina.Spostalo delicatamente lungo tutto il bordo della tazza per assicurarti che la retina non sia attaccata alla sclera in nessun punto. Tagliare vicino al disco ottico, in modo tale che la retina si stacchi completamente dalla sclera. Una volta confermato che la retina non è attaccata alla sclera su nessun lato, spingerla lentamente nella soluzione PBS.Con l'aiuto di un forcep, trasferire la retina su un vetrino pulito senza causare alcun danno ad esso. Usando la micro forbice o la lama del bisturi, fai quattro tagli sulla retina, come mostrato, per dividerla in quattro quadranti. Rimuovere l'eccesso di PBS dall'ambiente retinico e aggiungere un mezzo di montaggio anti-sbiadimento sul supporto piatto retinico.Coprilo con un coverslip e visualizza il supporto piatto al microscopio confocale. È importante notare qui che l'intero processo di angiografia a fluorescenza viene eseguito sotto la minima luce per evitare la tempra della fluorescenza dal colorante FITC-destrano. Nel ratto diabetico, le cellule retiniche subiscono una degenerazione, che porta a ulteriori complicazioni.Queste alterazioni strutturali possono essere visualizzate con la tecnica istologica per determinare il numero di cellule e lo spessore della retina. In caso di ratti diabetici, lo spessore degli strati retinici aumenta a causa dell'edema. Quindi, questa tecnica aiuta a selezionare vari potenziali agenti farmacologici per il trattamento della retinopatia diabetica.I cambiamenti metabolici nella retina dovuti al diabete causano la perdita di periciti e la rottura della barriera emato-retinica. Poiché vi è una fuoriuscita di proteine e altre biomolecole nella retina e nel vitreo, i livelli di proteine totali aumentano nel vitreo dei ratti diabetici. Prevenire la rottura della barriera emato-retinica potrebbe ostacolare significativamente il progresso della retinopatia diabetica.Nella retinopatia diabetica, l'espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare aumenta che porta alla formazione di nuovi vasi. Questi vasi disturbano la normale struttura retinica, e quindi la sua innervazione è di primaria importanza per il trattamento della retinopatia diabetica. La tecnica di angiografia a fluorescenza viene utilizzata per visualizzare nuovi vasi sanguigni e anche perdite di vasi sanguigni, come evidenziato qui.Tuttavia, l'angiogenesi è prominente solo dopo sei-12 mesi di induzione del diabete. Questa tecnica ci aiuta a quantificare l'effetto del trattamento farmacologico sull'innervazione dell'angiogenesi e della perdita vascolare. Il futuro trattamento della retinopatia diabetica ha bisogno di agenti farmacologici più efficienti, ma i trattamenti futuri possono essere raggiunti solo attraverso una migliore comprensione della patogenesi della malattia.Padroneggiare queste tecniche potrebbe aiutare i ricercatori ad avere una migliore comprensione della patogenesi della retinopatia diabetica, che potrebbe portare alla scoperta di migliori interventi farmacologici.

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