Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

著者らは、インド医学研究評議会(ICMR;ITR-2020-2882)は、Nirmal J博士への資金援助のため。また、マニシャ・マラニとハイデラバードキャンパスのBITS-ピラニ中央分析研究所施設にジュニア・リサーチ・フェローシップを提供し、インフラ施設を提供してくれた大学助成金にも感謝します。

このプロトコルは、ハイデラバードキャンパスのBITS-ピラニにある機関動物倫理委員会が提供するすべての動物ケアガイドラインに従います。
1. 網膜組織学
<ol><li>眼の核生成と固定<ol>
<li>生後2~3ヶ月の糖尿病性Wistar雄ラットを、腹腔内経路を介して注射した高用量のペントバルビタール(150mg/kg)を用いて、年齢適合対照(14~15週齢)と共に安楽死させる。検出可...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathophysiology+and+treatments.">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats.">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li><li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

組織学 網膜組織学は、網膜細胞および層の形態学的変化を視覚化するために行われる。固定液の選択、固定期間、脱水、パラフィン含浸など、さまざまなステップを最適化する必要があります。固定液の浸透が遅くなるため、組織サイズは3mmを超えてはならない。一般的に使用される4%パラホルムアルデヒドは、房水および硝子体液と比較して溶液の浸透圧が比較的高いため?...

糖尿病性網膜症(DR)は、真性糖尿病の最も複雑な二次合併症の1つです。また、世界中の生産年齢人口における予防可能な失明の主な原因でもあります。3,240万人の盲人を対象とした最近のメタアナリシスでは、83万人(2.6%)がDR1のために失明した。糖尿病に起因する視力喪失の割合は、2015年に1.06%(0.15-2.38)で世界第7位にランクされました2,3。
糖尿病性網膜症は、後眼組織の血管異常によって診断される。臨床的には、網膜における血管新生に基づいて、非増殖性DR(NPDR)および増殖性DR(PDR)の2つの段階に分けられる。高血糖は、網膜の神経変性4,5、炎症6,7、および微小血管系8に関与するいくつかの経路に関与するため、DRの強力な調節因子と考えられています。高血糖のために誘発される複数の代謝合併症には、終末糖化産物(AGE)、ポリオール経路、ヘキソサミン経路、およびプロテインキナーゼ-C経路の蓄積が含まれる。これらの経路は、糖尿病性網膜症の異なる段階に基づく細胞増殖(内皮細胞)、遊走(周皮細胞)、およびアポトーシス(神経網膜細胞、周皮細胞、および内皮細胞)の原因である。これらの代謝変化は、網膜剥離、網膜細胞の喪失、血液網膜関門(BRB)の破壊、動脈瘤、血管新生などの生理学的変化につながる可能性があります9。
ストレプトゾトシン(STZ)誘発性1型糖尿病は、糖尿病の病因およびその合併症を評価するためのラットにおいて十分に確立され、広く受け入れられている慣行である。STZの糖尿病誘発作用は、膵島β細胞の選択的破壊によるものである10。その結果、動物はインスリン欠乏症、高血糖、多飲症、多尿症を受け、これらはすべてヒト1型糖尿病の特徴です11。重度の糖尿病誘発の場合、STZは成人期に静脈内または腹腔内に40〜65mg / kg体重で投与される。約72時間後、これらの動物は250mg / dLを超える血糖値を示す10,12。
神経変性、炎症、および血管新生による網膜の生理学的変化を理解するためには、実験動物モデルにおいて異なる技術を最適化するべきである。網膜細胞および網膜血管の構造的および機能的変化は、組織学、BRBブレークダウンアッセイ、および蛍光血管造影法などの様々な技術によって研究することができる。
組織学は、顕微鏡レベルでの細胞、組織、および器官の解剖学の研究を含む。それは細胞/組織の構造と機能の間の相関関係を確立します。組織構造の微視的な変化を視覚化および同定するためにいくつかのステップが実行され、それによって健康な対応物と罹患した対応物を比較する13。したがって、組織学の各ステップを細心の注意を払って標準化することが不可欠です。網膜組織学に関与する様々なステップは、標本の固定、標本のトリミング、脱水、透明化、パラフィンによる含浸、パラフィン包埋、切片化、および染色(ヘマトキシリンおよびエオジン染色)13,14である。
健康な網膜では、網膜を横切る分子の輸送は、内側の内皮細胞と周皮細胞、外側の網膜色素上皮細胞で構成されるBRBによって制御されます。しかし、内部BRB内皮細胞および周皮細胞は、罹患状態の間に変性を開始し、BRBも損なわれる15。このBRB分解により、多くの低分子量分子が硝子体組織および網膜組織に漏れ出す16。病気が進行するにつれて、他の多くのタンパク質分子(低分子量および高分子量)も恒常性障害のために硝子体および網膜組織に漏れます17。それは様々な他の合併症、そして最終的には黄斑浮腫および失明をもたらす。したがって、硝子体内のタンパク質レベルを定量化し、健常状態と糖尿病状態を比較して、損なわれたBRBを測定する。
蛍光血管造影は、蛍光色素を用いて網膜や脈絡膜の血液循環を研究するために使用される技術である。これは、静脈内経路または心臓注射 を介して フルオレセイン色素を注入することによって、網膜および脈絡膜の血管系を視覚化するために使用される18。色素が注入されると、最初に網膜動脈に到達し、続いて網膜静脈に到達する。この染料の循環は、通常、染料19の注入から5〜10分以内に完了する。糖尿病性網膜症や脈絡膜血管新生を含む様々な後部眼疾患を診断することは重要な技術です20。これは、正常および罹患状態における大小の血管系変化を検出するのに役立ちます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

糖尿病性網膜症のような後部眼疾患は、網膜の生理機能を変化させる。糖尿病性網膜症は、網膜剥離、血液網膜関門(BRB)の破壊、および網膜血管新生を特徴とする。in vivoラットモデルは、網膜の構造と機能の変化を調べるための貴重な実験ツールです。我々は、網膜細胞、網膜血管系、および損なわれたBRBの形態学的変化を同定するために、ラットモデルにおいて3つの異なる実験技術を提案する。網膜組織学は、様々な網膜細胞の形態を研究するために使用される。また、定量的測定は、異なる網膜層の網膜細胞数および厚さ測定によって行われる。BRBブレークダウンアッセイは、BRBの分解による血漿から硝子体組織への眼外タンパク質の漏れを決定するために使用される。蛍光血管造影は、FITCデキストラン色素を用いて網膜血管系を可視化することにより、血管新生および血管の漏出を研究するために使用される。

網膜組織学 糖尿病性網膜では、網膜細胞は変性を受ける。さらに、浮腫22のために網膜層の厚さが増加する。ヘマトキシリンおよびエオジン染色後に得られた画像は、ImageJを用いて 図2 に示すように、細胞数および異なる層の厚さの測定に使用することができる。
血液網膜関門破壊アッセイ 糖尿病ラ...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

糖尿病性網膜症は、失明の主な原因の1つです。組織学、血液網膜関門破壊アッセイ、および蛍光血管造影は、網膜の病態生理学を理解するための貴重な技術であり、糖尿病性網膜症に対する効率的な薬物スクリーニングをさらに強化することができる。

ラットモデルにおける網膜病態生理学的評価

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

これらの技術の全体的な目的は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病性網膜症ラットモデルにおける網膜病態生理を評価することである。糖尿病性網膜症は失明の主な原因の1つです。継続的な検索は、糖尿病性網膜症を治療するためのより良い有効性とより長い作用を有する薬理学的薬剤を発見するために進行中である。前臨床動物モデルにおける薬理学的薬剤の発見プロセスは、重要な役割を果たしている。これらの動物モデルは、眼の後部組織の構造的および機能的変化を理解するのに役立つ。したがって、後部セグメントの問題でこれらの変化を研究するための3つの異なるテクニックを紹介します。網膜細胞の層状変化を研究する組織学、血漿から硝子体内に漏れたタンパク質を定量して妥協したBRBを研究するBRBブレークダウンアッセイ、FITCデキストラン色素を用いて網膜血管系を可視化する蛍光血管造影法を実証しています。高用量のペントバルビタールを使用してラットを安楽死させ、検出可能な心拍なしでその死を確認する。メスの刃を使って眼の鼻側頭部および側頭部に切開を行って眼球を有核化する。次に、その縁に沿って切断して、眼窩ソケットから目を取り除きます。目を取り囲む余分な脂肪を取り除き、5mLの固定液に入れます。眼を固定液中で24〜48時間インキュベートする。固定後、固定液から眼球を取り出し、10mL PBSを充填したシャーレに移す。マイクロ鉗子を使用して、視神経で目を保持し、マイクロハサミの助けを借りてパースプラナでニックネームを作ります。角膜の縁全体を切断して、前部カップと後部カップを分離します。レンズを外し、視神経を切断します。後部カップを2つの半分に切り、視神経を通過する。各半分を別々のカセットに移します。エタノール濃度を50%から100%エタノールに徐々に増加させることによって組織を脱水する。そして最後に、キシレンでエタノールをきれいにする。60°Cで予熱したパラフィンを組織に含浸させ、組織内のキシレンを置換する。そのベースとして組織とカセットを保持するためにスチールモールドを使用してパラフィンブロックを準備します。ブロックを準備している間、目の視ディスク部分はスチール金型の底に面する必要があります。カセットをパラフィンで満たし、冷たい表面に移します。ブレードとカセットをミクロトームのそれぞれのホルダーに取り付けます。ミクロトームを使用して、余分なパラフィンワックスをトリミングし、厚さ5マイクロメートルの5〜6枚のリボンを切断する。リボンを予め温めた水浴の表面に移してリボンを広げます。アルブミンでコーティングしたスライドガラス上の切片を集める。スライドを摂氏 37 度で一晩乾燥させます。ヘマトキシリンおよびエオジン染色を行うには、スライドを摂氏60度で1時間予熱し、パラフィンを溶融させる。原稿に記載されている染色手順に従ってください。組織の水分補給から始めて、ヘマトキシリンで染色し、続いてエオジンで染色する。次に、組織を脱水し、切片にマウント媒体を追加します。カバースリップを断面に置き、光学顕微鏡で可視化します。血液網膜関門破壊アッセイを行うには、ケタミンとキシラジンを用いてラットを麻酔し、つま先をつまんで麻酔状態を確認する。心臓の位置を確認し、24ゲージの針で1mLのシリンジを挿入し、心臓穿刺によって血液を引きます。十分な血液が採取されたら、EDTAコーティングされたチューブに移す。溶血を防ぐために優しく混ぜる。眼を核形成し、直ちにドライアイスに移す。凍結条件下で、角膜および水晶体の除去によって眼の解剖を開始する。網膜からの汚染なしに鉗子を使用して眼の後部から硝子体を引っ張る。3〜4個のビーズで均質化チューブに移します。ビーズホモジナイザーを用いて中速で10秒間サンプルを均質化する。血液および硝子体液サンプルを微量遠心チューブに移し、さらに処理します。両方のサンプルを5で遠心分離し、摂氏4度で10分間200g。マルチチャンネルピペットを使用して、250マイクロリットルのブラッドフォード試薬をウェルに加えます。PBSを用いて硝子体試料を10倍、血漿試料を20倍に希釈する。5マイクロリットルの希釈サンプルをブラッドフォード試薬に加え、よく混合する。サンプルを20〜30分間インキュベートし、次いで96ウェルプレートリーダーを用いて590ナノメートルでの吸光度を測定する。試料の強度は、タンパク質の濃度に正比例する。蛍光血管造影を行うには、3%イソフルランを用いてラットを麻酔し、つま先パンチにより麻酔状態を確認する。染料を注入する前に尾を温水に浸してください。1mLあたり50mgのFITC−デキストラン溶液1mLを側尾静脈に注入する。染料を5〜10分間循環させます。ペントバルビタールを使用してラットを安楽死させ、検出可能な心拍によってその死を確認する。眼を核形成し、フラットマウントの準備に進みます。網膜フラットマウントを準備するには、繊維を含まないキムワイプの上に目を置き、目の前部を切断します。ガラス質のユーモアとともに、レンズを目の後部からゆっくりと引き抜きます。後部をPBSで満たされたペトリ皿に移し、視神経を切断する。次に、尖った鉗子の先端を強膜と網膜の間に置きます。カップの縁に沿って静かに動かして、網膜がどの時点でも強膜に付着していないことを確認してください。網膜が強膜から完全に剥離するように、視神経椎間板の近くで切断する。どの側も強膜に網膜が付着していないことを確認したら、PBS溶液にゆっくりと押し込みます。鉗子の助けを借りて、それに損傷を与えることなく、きれいなスライドガラスに網膜を移します。マイクロはさみまたはメス刃を使用して、図に示すように網膜に4つの切り込みを入れ、4つの象限に分割します。網膜周囲から余分なPBSを除去し、網膜フラットマウントに退色防止マウント媒体を追加します。カバースリップで覆い、共焦点顕微鏡下でフラットマウントを視覚化します。蛍光血管造影の全プロセスは、FITC−デキストラン色素からの蛍光の消光を避けるために、最小の光の下で行われることにここで注意することが重要です。糖尿病ラットでは、網膜細胞は変性を受け、さらなる合併症を引き起こす。これらの構造変化は、組織学技術によって視覚化され、網膜の細胞数および厚さを決定することができる。糖尿病ラットの場合、浮腫のために網膜層の厚さが増加する。したがって、この技術は、糖尿病性網膜症を治療するための様々な潜在的な薬理学的薬剤をスクリーニングするのに役立つ。糖尿病による網膜の代謝変化は、周皮細胞の喪失および血液網膜関門の破壊を引き起こす。網膜および硝子体へのタンパク質および他の生体分子の漏出があるので、総タンパク質のレベルは糖尿病ラットの硝子体において増加する。血液網膜関門の破壊を防ぐことは、糖尿病性網膜症の進行を著しく妨げる可能性がある。糖尿病性網膜症では、血管内皮増殖因子の発現が増加し、それが新しい血管の形成につながる。これらの血管は正常な網膜構造を乱すので、その神経支配は糖尿病性網膜症を治療するための主な関心事である。蛍光血管造影技術は、ここで強調したように、新しい血管および血管の漏出を視覚化するために利用される。しかしながら、血管新生は、糖尿病誘発の6〜12ヶ月後にのみ顕著である。この技術は、血管新生および血管漏出の神経支配に対する薬物治療の効果を定量化するのに役立ちます。糖尿病性網膜症の将来の治療には、より効率的な薬理学的薬剤が必要であるが、将来の治療は、疾患の病因をよりよく理解することによってのみ達成することができる。これらの技術を習得することは、研究者が糖尿病性網膜症の病因についてよりよく理解するのに役立ち、より良い薬理学的介入の発見につながる可能性があります。

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

ラットにおける慢性栄養注入のモデル

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

皮下腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤白血球サブセットの評価

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

網膜疾患の評価のための定量的眼底自己蛍光

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

緑内障誘導の手順<em&gt;インビボ</em&gt;ラットモデルと全体のマウント網膜準備

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

レーザードップラー流量測定を用いたラットにおける脳血流自動調節の評価

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

外科用マウスモデルにおける変形性関節症の標準化組織形態評価

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

げっ歯類における虚血性網膜症の酸素誘導網膜症モデル

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

喘息ラットモデルにおける鍼治療

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の評価

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...