Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

저자는 인도 의학 연구위원회 (ICMR; ITR-2020-2882) 박사 Nirmal J.에 대한 자금 지원 우리는 또한 인프라 시설을 제공 한 Manisha Malani 및 Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad 캠퍼스에 주니어 연구 펠로우십을 제공 한 University Grant of Commission에 감사드립니다.

이 프로토콜은 기관 동물 윤리위원회, BITS-Pilani, 하이데라바드 캠퍼스에서 제공하는 모든 동물 보호 지침을 따릅니다.
1. 망막 조직학
<ol><li>눈의 핵형성 및 고정<ol>
<li>복강내 경로를 통해 주사된 고용량의 펜토바르비탈(150mg/kg)을 사용하여 연령 일치 대조군(14~15주령)과 함께 2~3개월 된 당뇨병성 위스타 수컷 쥐를 안락사시킨다. 감지 가능한 심장 박동은 2-5 분 이...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

조직학 망막 조직학은 망막 세포 및 층의 형태학적 변화를 시각화하기 위해 수행된다. 고정 용액 선택, 고정 기간, 탈수 및 파라핀 함침을 포함한 다양한 단계를 최적화해야합니다. 조직 크기는 고정 침투가 느려지기 때문에 3mm를 초과해서는 안됩니다. 일반적으로 사용되는 4 % 파라 포름 알데히드는 수성 유머 및 유리체 유머에 비해 용액의 상대적으로 높은 삼투압으로 인해 건강한...

당뇨병성 망막병증(DR)은 진성 당뇨병의 가장 복잡한 이차적 합병증 중 하나이다. 또한 전 세계 노동 연령 인구에서 예방 가능한 실명의 주요 원인이기도합니다. 32.4 만 명의 시각 장애인에 대한 최근의 메타 분석에서 830,000 (2.6 %)의 사람들이 DR1로 인해 시각 장애인이었습니다. 당뇨병으로 인한 시력 손실의 비율은 2015 년 전 세계적으로 1.06 % (0.15-2.38)로 7 위를 차지했습니다 2,3.
당뇨병성 망막병증은 후부 안구 조직의 혈관 이상에 의해 진단된다. 임상적으로, 망막에서의 혈관화에 기초한 비증식성 DR (NPDR) 및 증식성 DR (PDR)의 두 단계로 나뉘어진다. 고 혈당증은 망막의 신경 변성4,5, 염증6,7 및 미세 혈관 구조8에 관련된 여러 경로를 암시하기 때문에 DR의 강력한 조절제로 간주됩니다. 고혈당증으로 인해 유도되는 다중 대사 합병증에는 고급 당화 최종 생성물 (AGEs), 폴리올 경로, 헥소사민 경로 및 단백질 키나아제-C 경로의 축적이 포함된다. 이러한 경로는 당뇨병성 망막병증의 여러 단계에 기초한 세포 증식(내피 세포), 이동(혈관주위세포) 및 아폽토시스(신경 망막 세포, 혈관주위세포 및 내피 세포)를 담당한다. 이러한 대사 변화는 망막 박리, 망막 세포의 손실, 혈액 망막 장벽 (BRB)의 붕괴, 동맥류 및 혈관신생9과 같은 생리적 변화를 일으킬 수 있습니다.
스트렙토조토신 (STZ) 유도 제1형 당뇨병은 당뇨병 발병기전과 그 합병증을 평가하기 위한 쥐에서 잘 정립되고 잘 받아들여지는 관행이다. STZ의 당뇨병 유발 효과는 췌장섬 β 세포의 선택적 파괴에 기인한다10. 결과적으로, 동물들은 인슐린 결핍, 고혈당증, 폴리 딥시아 및 다뇨증을 겪을 것이며, 이들 모두는 인간 유형 1 당뇨병의 특징입니다 11. 심한 당뇨병 유발의 경우, STZ는 성인기에 정맥 내 또는 복강 내 40-65 mg / kg 체중으로 투여됩니다. 약 72 시간 후,이 동물들은 250 mg / dL10,12 이상의 혈당 수치를 나타냅니다.
신경 퇴행, 염증 및 혈관신생으로 인한 망막의 생리적 변화를 이해하려면 실험 동물 모델에서 다양한 기술을 최적화해야합니다. 망막 세포 및 망막 혈관의 구조적 및 기능적 변화는 조직학, BRB 분해 분석 및 형광 혈관조영술과 같은 다양한 기술에 의해 연구될 수 있다.
조직학은 현미경 수준에서 세포, 조직 및 기관의 해부학 연구를 포함합니다. 그것은 세포 / 조직의 구조와 기능 사이의 상관 관계를 수립합니다. 조직 구조의 미세한 변화를 시각화하고 식별하기 위해 몇 가지 단계가 수행되어 건강한 상대와 병든 상대물을 비교합니다13. 따라서 조직학의 각 단계를 세심하게 표준화하는 것이 필수적입니다. 망막 조직학에 관여하는 다양한 단계는 시편의 고정, 표본 트리밍, 탈수, 클리어링, 파라핀 함침, 파라핀 임베딩, 절편화 및 염색 (Hematoxylin and Eosin staining)13,14입니다.
건강한 망막에서, 망막을 가로지르는 분자의 수송은 BRB에 의해 조절되며, 내피 세포와 내측의 혈관주위세포, 그리고 바깥쪽의 망막 색소 상피 세포로 구성됩니다. 그러나, 내부 BRB 내피 세포 및 혈관주위세포는 병든 상태 동안 퇴화하기 시작하고, BRB도 또한 손상된다15. 이러한 BRB 분해로 인해 많은 저분자량 분자가 유리체 및 망막 조직으로 누출됩니다16. 질병이 진행됨에 따라 많은 다른 단백질 분자 (저분자량 및 고분자량)도 항상성 장애로 인해 유리체 및 망막 조직으로 누출됩니다17. 그것은 다양한 다른 합병증과 궁극적으로 황반 부종과 실명으로 이어집니다. 따라서 유리체의 단백질 수준을 정량화하고 건강한 상태와 당뇨병 상태를 비교하면 BRB가 손상되었습니다.
형광 혈관 조영술은 형광 염료를 사용하여 망막과 맥락막의 혈액 순환을 연구하는 데 사용되는 기술입니다. 정맥 내 경로 또는 심장 주사를 통해 플루오레세인 염료를 주입하여 망막과 맥락막의 혈관 구조를 시각화하는 데 사용됩니다18. 염료가 주입되면 먼저 망막 동맥에 도달하고 망막 정맥에 도달합니다. 염료의 이러한 순환은 일반적으로 염료19의 주입으로부터 5 내지 10분 이내에 완료된다. 당뇨병성 망막증과 맥락막 신생혈관화를 포함한 다양한 후부 절편 안구 질환을 진단하는 것은 중요한 기술이다20. 그것은 정상 및 병든 상태에서 크고 사소한 혈관 구조 변화를 감지하는 데 도움이됩니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

당뇨병성 망막병증과 같은 후부 절편 안구 질환은 망막의 생리학을 변화시킵니다. 당뇨병성 망막병증은 망막 박리, 혈액-망막 장벽(BRB)의 붕괴, 및 망막 혈관신생을 특징으로 한다. 생체 내 쥐 모델은 망막의 구조와 기능의 변화를 조사하는 데 유용한 실험 도구입니다. 우리는 망막 세포, 망막 혈관 구조 및 손상된 BRB의 형태 학적 변화를 확인하기 위해 쥐 모델에서 세 가지 실험 기술을 제안합니다. 망막 조직학은 다양한 망막 세포의 형태를 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 정량적 측정은 망막 세포 수 및 상이한 망막층의 두께 측정에 의해 수행된다. BRB 분해 분석은 BRB의 분해로 인한 혈장에서 유리체 조직으로의 안구 외 단백질의 누출을 결정하는 데 사용됩니다. 형광 혈관 조영술은 FITC-덱스트란 염료를 사용하여 망막 혈관 구조를 시각화하여 혈관 신생 및 혈관 누출을 연구하는 데 사용됩니다.

망막 조직학 당뇨병성 망막에서 망막 세포는 변성을 겪습니다. 또한, 부종으로 인해 망막층의 두께가 증가합니다.22. Hematoxylin 및 Eosin 염색 후에 얻어진 이미지는 ImageJ를 사용하여 도 2 에 도시된 바와 같이 세포 수 및 상이한 층의 두께의 측정에 사용될 수 있다.
혈액-망막 장벽 파괴 분석 BRB가 당뇨병 쥐에?...

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Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

당뇨병성 망막증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 조직학, 혈액-망막 장벽 파괴 분석, 및 형광 혈관조영술은 망막의 병태생리학을 이해하는 데 유용한 기술이며, 이는 당뇨병성 망막병증에 대한 효율적인 약물 스크리닝을 더욱 향상시킬 수 있다.

쥐 모델에서의 망막 병리생리학적 평가

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

이들 기술의 전반적인 목표는 스트렙토조토신-유도된 당뇨병성 망막병증 래트 모델에서 망막 병태생리학을 평가하는 것이다. 당뇨병성 망막병증은 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 당뇨병성 망막병증을 치료하기 위해 더 나은 효능과 더 긴 작용을 가진 약리학적 제제를 발견하기 위해 지속적인 검색이 진행되고 있다.전임상 동물 모델에서 약리학 적 제제를 발견하는 과정은 중요한 역할을합니다. 이 동물 모델은 눈의 후부 세그먼트 조직의 구조적 및 기능적 변화를 이해하는 데 도움이됩니다. 따라서 우리는 사후 세그먼트 문제에서 이러한 변화를 연구하기 위해 세 가지 기술을 시연 할 것입니다.우리는 층에서 망막 세포의 형태 학적 변화를 연구하기위한 조직학, 혈장에서 유리체에서 누출 된 단백질을 정량화하여 손상된 BRB를 연구하는 BRB 분해 분석, FITC-덱스트란 염료를 사용하여 망막 혈관 구조를 시각화하는 형광 혈관 조영술을 시연하고 있습니다. 고용량의 펜토바르비탈을 사용하여 쥐를 안락사시키고 검출 가능한 심장 박동없이 죽음을 확인하십시오. 눈의 비강 및 측두엽 부위에 메스 블레이드를 사용하여 절개를하여 눈을 에핵화하십시오.그런 다음 가장자리를 따라 잘라 궤도 소켓에서 눈을 제거하십시오. 눈 주위의 과도한 지방을 제거하고 5 mL의 고정 용액에 넣으십시오. 24 내지 48 시간 동안 고정 용액에서 눈을 인큐베이션한다.고정 후, 고정 용액으로부터 눈을 제거하고 PBS 10 mL로 채워진 페트리 디쉬로 옮긴다. 마이크로 포셉을 사용하여 시신경으로 눈을 잡고 마이크로 가위의 도움으로 파 플라나에서 닉을 만드십시오. 각막의 전체 여백을 잘라 눈의 앞쪽 컵과 뒷쪽 컵을 분리하십시오.렌즈를 제거하고 시신경을 자릅니다. 후부 컵을 두 개의 반으로 자르고 시신경을 통과시킵니다. 각 절반을 별도의 카세트로 옮깁니다.에탄올의 농도를 50%에서 100%에탄올로 점진적으로 증가시켜 조직을 탈수시킨다. 그리고 마지막으로, 자일렌으로 에탄올을 맑게하십시오. 조직을 섭씨 60도에서 예열 된 파라핀으로 함침시켜 조직의 자일렌을 대체하십시오.강철 몰드를 사용하여 티슈와 카세트를 베이스로 고정하는 파라핀 블록을 준비하십시오. 블록을 준비하는 동안, 눈의 광학 디스크 부분은 강철 몰드의 바닥을 향해야합니다. 카세트를 파라핀으로 채우고 시원한 표면으로 옮깁니다.블레이드와 카세트를 마이크로톰의 각 홀더에 장착하십시오. 마이크로톰을 사용하여 과량의 파라핀 왁스를 트리밍하고 두께 5 마이크로미터의 5 내지 여섯 개의 절편의 리본을 절단한다. 리본을 미리 데운 수조의 표면으로 옮겨 리본을 펼치십시오.알부민으로 코팅 된 유리 슬라이드에서 섹션을 수집하십시오. 슬라이드를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 말리십시오. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하기 위해, 슬라이드를 섭씨 60도에서 1시간 동안 예열하여 파라핀을 녹인다.원고에 주어진 염색 절차를 따르십시오. 조직의 재수화로 시작한 다음 Hematoxylin으로 염색 한 다음 Eosin으로 염색하십시오. 이제 조직을 탈수시키고 절편에 장착 매체를 추가하십시오.커버 슬립을 부분에 놓고 광학 현미경으로 시각화하십시오. 혈액-망막 장벽 파괴 분석을 수행하기 위해, 케타민과 자일라진을 사용하여 쥐를 마취시키고 발가락 핀치로 마취 상태를 확인한다. 심장을 찾아 24게이지 바늘이 있는 1mL 주사기를 삽입하여 심장 천자로 혈액을 채취합니다.충분한 혈액이 수집되면 EDTA 코팅 튜브로 옮깁니다. 용혈을 방지하기 위해 부드럽게 섞으십시오. 눈을 핵을 제거하고 즉시 드라이 아이스로 옮깁니다.얼어 붙은 조건에서 각막과 렌즈를 제거하여 눈의 해부를 시작하십시오. 망막의 오염없이 포셉을 사용하여 눈의 후부 부분에서 유리체를 당깁니다. 그것을 세 개에서 네 개의 비드로 균질화 튜브로 옮깁니다.비드 호모게나이저를 사용하여 샘플을 중간 속도로 10초 동안 균질화한다. 혈액과 유리체 유머 샘플을 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 더 많이 처리하십시오. 두 시료 모두를 섭씨 4도에서 10분 동안 5, 200 g에서 원심분리한다.다중 채널 피펫을 사용하여 250 마이크로 리터의 브래드 포드 시약을 우물에 넣으십시오. PBS를 사용하여 유리체 샘플을 10배 희석하고 혈장 샘플을 20배 희석한다. 희석 된 샘플 5 마이크로 리터를 브래드 포드 시약에 넣고 잘 섞으십시오.샘플을 20 내지 30분 동안 인큐베이션한 다음, 96-웰 플레이트 판독기를 사용하여 590 나노미터에서 흡광도를 측정하였다. 샘플의 강도는 단백질의 농도에 직접적으로 비례합니다. 형광 혈관조영술을 수행하기 위해, 3%isoflurane을 사용하여 쥐를 마취시키고 발가락 펀치로 마취 상태를 확인하였다.염료를 주입하기 전에 꼬리를 따뜻한 물에 담그십시오. FITC-덱스트란 용액 mL당 50mg의 1mL를 측방 꼬리 정맥에 주입한다. 염료가 5 ~ 10 분 동안 순환하도록하십시오.펜토바르비탈을 사용하여 쥐를 안락사시키고 검출 가능한 심장 박동으로 죽음을 확인하십시오. 눈을 핵으로 만들고 평평한 마운트 준비를 진행하십시오. 망막 플랫 마운트를 준비하려면 섬유질이없는 킴 와이프에 눈을 놓고 눈의 앞쪽 부분을 자릅니다.눈의 후부 부분에서 유리체 유머와 함께 렌즈를 천천히 당깁니다. 후부 세그먼트를 PBS로 채워진 페트리 접시로 옮기고 시신경을 자릅니다. 이제 공막과 망막 사이에 뾰족한 집게의 끝을 놓습니다.컵의 테두리를 따라 부드럽게 움직여 망막이 어느 시점에서도 공막에 부착되지 않도록하십시오. 망막이 공막에서 완전히 분리되도록 광학 디스크 근처를 자릅니다. 망막이 어느 쪽의 공막에도 부착되지 않은 것이 확인되면 PBS 용액으로 천천히 밀어 넣으십시오.포셉의 도움으로 망막을 손상시키지 않고 깨끗한 유리 슬라이드로 옮깁니다. 마이크로 가위 또는 메스 블레이드를 사용하여 그림과 같이 망막을 네 번 잘라 네 개의 사분면으로 나눕니다. 망막 주변에서 과도한 PBS를 제거하고 망막 플랫 마운트에 변색 방지 장착 매체를 추가하십시오.커버 슬립으로 덮고 공초점 현미경으로 플랫 마운트를 시각화하십시오. 형광 혈관 조영술의 전체 과정은 FITC-덱스트란 염료로부터의 형광의 담금질을 피하기 위해 최소 광 하에서 수행된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 당뇨병 쥐에서 망막 세포는 변성을 겪으며 이로 인해 합병증이 발생합니다.이러한 구조적 변화는 망막의 세포 수와 두께를 결정하기 위해 조직학 기술에 의해 시각화 될 수 있습니다. 당뇨병 쥐의 경우, 부종으로 인해 망막층의 두께가 증가합니다. 따라서이 기술은 당뇨병 성 망막 병증을 치료하기 위해 다양한 잠재적 인 약리학 적 제제를 스크리닝하는 데 도움이됩니다.당뇨병으로 인한 망막의 대사 변화는 혈관주위세포의 손실과 혈액-망막 장벽의 붕괴를 야기한다. 망막과 유리체로 단백질 및 기타 생체 분자가 누출됨에 따라 당뇨병 쥐의 유리체에서 총 단백질 수준이 증가합니다. 혈액 망막 장벽의 붕괴를 예방하면 당뇨병 성 망막 병증의 진행을 크게 방해 할 수 있습니다.당뇨병성 망막증에서, 혈관 내피 성장 인자의 발현은 새로운 혈관의 형성으로 이어지는 증가한다. 이 혈관은 정상적인 망막 구조를 방해하므로 당뇨병 성 망막 병증을 치료하는 데 주된 관심사입니다. 형광 혈관 조영술 기술은 여기에서 강조 표시된 바와 같이 새로운 혈관과 혈관의 누출을 시각화하는 데 사용됩니다.그러나 혈관신생은 당뇨병 유발 후 6 ~ 12 개월 후에 만 두드러집니다. 이 기술은 혈관 신생 및 혈관 누출의 신경 과민에 대한 약물 치료의 효과를 정량화하는 데 도움이됩니다. 당뇨병성 망막병증의 미래 치료는 보다 효율적인 약리학적 제제를 필요로 하지만, 미래의 치료는 질병 병인에 대한 더 나은 이해를 통해서만 달성될 수 있다.이러한 기술을 습득하면 연구자가 당뇨병 성 망막 병증의 병인에 대해 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 더 나은 약리학 적 개입의 발견으로 이어질 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

쥐의 만성 영양 주입의 모델

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

연구

의학

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

망막 질환의 평가에 대한 정량적 안저 자기 형광

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

녹내장 유도 절차<em&gt; 생체</em&gt; 쥐 모델 및 전체 마운트 망막 준비

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

레이저 도플러 흐름 측정을 사용하여 쥐에 대뇌 혈액 흐름 자동 조절의 평가

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

외과 마우스 모형에 있는 골관절염의 표준화한 조직 형측정 평가

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

설치류에 있는 허혈성 망막 질병을 위한 산소 유도한 망막병증 모형

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

천식의 쥐 모형에 있는 침술

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

다낭성 난소 증후군 마우스 모형에 있는 간 포도당 생산의 평가

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...