Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Forfattere ønsker å anerkjenne Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) for støtte til Dr. Nirmal J. Vi vil også takke University Grant of Commission for å gi Junior Research Fellowship til Manisha Malani og Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus for å tilby infrastrukturelt anlegg.

Denne protokollen følger alle retningslinjene for dyrepleie fra Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad campus.
1. Retinal histologi
<ol><li>Enukleasjon og fiksering av øyet<ol>
<li>Euthanize en 2 til 3 måneder gammel diabetiker Wistar mannlig rotte sammen med alderstilpasset kontroll (14 til 15 uker gammel) ved hjelp av en høy dose pentobarbital (150 mg / kg) injisert gjennom intraperitoneal ruten. Ingen påviselig hjerterytme bekrefter dødsfallet...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathophysiology+and+treatments.">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats.">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li><li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Histologi Retinal histologi utføres for å visualisere de morfologiske endringene i retinalceller og lag. Ulike trinn, inkludert valg av fixative løsning, fikseringsvarighet, dehydrering og parafinimpregnering, må optimaliseres. Vevsstørrelsen bør ikke overstige 3 mm, da den fixative penetrasjonen blir langsom. Den ofte brukte 4% paraformaldehyden fører til netthinneavløsning selv i det sunne øyet på grunn av den relativt høye osmolariteten til løsningen sammenlignet med vandig humor og gla...

Diabetisk retinopati (DR) er en av de mest komplekse sekundære komplikasjoner av diabetes mellitus. Det er også den ledende årsaken til forebyggbar blindhet i befolkningen i arbeidsfør alder over hele verden. I en nylig metaanalyse av 32,4 millioner blinde mennesker var 830 000 (2,6 %) blinde på grunn av DR1. Andelen synstap tilskrevet diabetes rangert som nummer sju i 2015 på 1,06% (0,15-2,38) globalt2,3.
Diabetisk retinopati diagnostiseres av vaskulære abnormiteter i det bakre okulære vevet. Klinisk er det delt inn i to stadier - Ikke-proliferativ DR (NPDR) og Proliferative DR (PDR), basert på vaskularisering i netthinnen. Hyperglykemi regnes som den potente regulatoren av DR, da det impliserer flere veier involvert i nevrodegenerasjon4,5, betennelse6,7 og mikrovaskulær8 i netthinnen. Flere metabolske komplikasjoner indusert på grunn av hyperglykemi inkluderer akkumulering av avanserte glykasjonssluttprodukter (AGE), polyolbane, hexosaminvei og proteinkinase-C-bane. Disse veiene er ansvarlige for celleproliferasjon (endotelceller), migrasjon (pericytter) og apoptose (nevrale retinalceller, pericytter og endotelceller) basert på ulike stadier av diabetisk retinopati. Disse metabolske endringene kan føre til fysiologiske endringer som netthinneavløsning, tap av netthinneceller, nedbrytning av blodretinalbarrieren (BRB), aneurisme og angiogenese9.
Streptozotocin (STZ) indusert type-1 diabetes er en veletablert og godt akseptert praksis hos rotter for evaluering av diabetespatogenese og dens komplikasjoner. Diabetogene effekter av STZ skyldes selektiv ødeleggelse av bukspyttkjertel holme β-celler10. Som et resultat vil dyrene gjennomgå insulinmangel, hyperglykemi, polydipsi og polyuri, som alle er karakteristiske for menneskelig type-1 diabetes mellitus11. Ved alvorlig diabetesinduksjon administreres STZ ved 40-65 mg/kg kroppsvekt intravenøst eller intraperitonealt i voksen alder. Etter ca. 72 timer presenterer disse dyrene blodsukkernivåer større enn 250 mg/dl10,12.
For å forstå de fysiologiske endringene i netthinnen på grunn av nevrodegenerasjon, betennelse og angiogenese, bør forskjellige teknikker optimaliseres i eksperimentelle dyremodeller. Strukturelle og funksjonelle endringer i retinalceller og netthinnefartøy kan studeres ved hjelp av ulike teknikker som histologi, BRB-analyse og fluorescensangiografi.
Histologi innebærer studiet av anatomien til celler, vev og organer på mikroskopisk nivå. Det etablerer en sammenheng mellom strukturen og funksjonen til celler / vev. Flere trinn utføres for å visualisere og identifisere de mikroskopiske endringene i vevsstruktur, og dermed sammenligne sunne og syke kolleger13. Derfor er det viktig å standardisere hvert trinn i histologi omhyggelig. Ulike trinn involvert i retinal histologi er fiksering av prøven, trimming av prøven, dehydrering, rydding, impregnering med paraffin, parafininnstøtning, seksjonering og farging (Hematoxylin og Eosin farging)13,14.
I en sunn netthinne styres transporten av molekyler over netthinnen av BRB, sammensatt av endotelceller og pericytter på innsiden, og retinal pigment epitelceller på ytre side. Imidlertid begynner indre BRB endotelceller og pericytter å degenerere under den syke tilstanden, og BRB er også kompromittert15. På grunn av denne BRB-sammenbruddet lekker mange molekyler med lav molekylvekt inn i glasslegemet og netthinnevev16. Etter hvert som sykdommen utvikler seg, lekker mange andre proteinmolekyler (lav og høy molekylvekt) også til glasslegemet og netthinnevev på grunn av homeostaseforstyrrelser17. Det fører til ulike andre komplikasjoner og til slutt makulaødem og blindhet. Derfor, kvantifisere proteinnivået i glasslegemet og sammenligne sunne og diabetikere tiltak kompromittert BRB.
Fluorescens angiografi er en teknikk som brukes til å studere blodsirkulasjonen av netthinnen og choroid ved hjelp av fluorescerende fargestoff. Den brukes til å visualisere vaskulatur av netthinnen og choroid ved å injisere fluorescein fargestoff via intravenøs rute eller hjerteinjeksjon18. Når fargestoffet er injisert, når det først retinal arteriene, etterfulgt av retinal årer. Denne sirkulasjonen av fargestoff er vanligvis fullført innen 5 til 10 min fra injeksjon av fargestoff19. Det er en viktig teknikk for å diagnostisere ulike bakre segment okulære sykdommer, inkludert diabetisk retinopati og choroidal neovascularization20. Det bidrar til å oppdage store og mindre vaskulaturendringer i normale og syke forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

En bakre segment øyesykdom som diabetisk retinopati endrer fysiologien til netthinnen. Diabetisk retinopati er preget av en netthinneavløsning, nedbrytning av blodretinalbarrieren (BRB) og retinal angiogenese. En in vivo rotte modell er et verdifullt eksperimentelt verktøy for å undersøke endringene i strukturen og funksjonen til netthinnen. Vi foreslår tre forskjellige eksperimentelle teknikker i rottemodellen for å identifisere morfologiske endringer i retinalceller, retinal vaskulatur og kompromittert BRB. Retinal histologi brukes til å studere morfologien til ulike retinalceller. Kvantitativ måling utføres også ved retinal celleantall og tykkelsesmåling av forskjellige netthinnelag. En BRB-sammenbruddsanalyse brukes til å bestemme lekkasjen av ekstraokulære proteiner fra plasma til glassvev på grunn av nedbrytning av BRB. Fluorescens angiografi brukes til å studere angiogenese og lekkasje av blodkar ved å visualisere retinal vaskulatur ved hjelp av FITC-dextran fargestoff.

Retinal histologi I diabetisk netthinne gjennomgår netthinneceller degenerasjon. I tillegg øker tykkelsen på netthinnelagene på grunn av ødem22. Bildene som er oppnådd etter Hematoxylin- og Eosin-farging, kan brukes til celletelling og måling av tykkelsen på forskjellige lag, som vist i figur 2 ved hjelp av ImageJ.
Blod-retinal barriere sammenbrudd analyse Ettersom BRB er kompromittert hos dia...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Diabetisk retinopati er en av de ledende årsakene til blindhet. Histologi, blod-retinal barriere sammenbrudd analyse, og fluorescens angiografi er verdifulle teknikker for å forstå patofysiologien til netthinnen, noe som ytterligere kan forbedre effektiv legemiddelscreening mot diabetisk retinopati.

Retinal patofysiologisk evaluering i en rottemodell

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Det overordnede målet med disse teknikkene er å evaluere retinal patofysiologi i streptozotocinindusert diabetisk retinopati rotte modell. Diabetisk retinopati er en av de ledende årsakene til blindhet. Det kontinuerlige søket pågår for å oppdage farmakologiske midler med bedre effekt og lengre tiltak for å behandle diabetisk retinopati.Prosessen med å oppdage farmakologiske midler i prekliniske dyremodeller spiller en viktig rolle. Disse dyremodellene bidrar til å forstå de strukturelle og funksjonelle endringene i øyets bakre segmentvev. Derfor vil vi demonstrere tre forskjellige teknikker for å studere disse endringene i bakre segmentproblemer.Vi demonstrerer histologi for å studere morfologiske endringer av retinalceller i lag, BRB nedbrytningsanalyse for å studere kompromittert BRB ved å kvantifisere lekket protein i glasslegemet fra plasma, og også fluoresce angiografi for å visualisere retinal vaskulatur ved hjelp av FITC-dextran fargestoff. Euthanize rotte ved hjelp av høy dose pentobarbital og bekrefte sin død uten påviselig hjerteslag. Forfør øyet ved å lage snitt ved hjelp av et skalpellblad på øyets nese- og temporale områder.Klipp deretter langs kantene for å fjerne øyet fra orbitalkontakten. Fjern overflødig fett rundt øyet og legg det i 5 ml fixativ løsning. Inkuber øyet i fixativ løsning i 24 til 48 timer.Etter fiksering, fjern øyet fra fikseringsløsningen og overfør til Petri-tallerken fylt med 10 ml PBS. Bruk mikro tang, hold øyet med optisk nerve og lag en nick på pars plana ved hjelp av mikrosaks. Skjær gjennom hele marginen av hornhinnen for å skille den fremre koppen og bakre kopp øye.Fjern linsen og kutt synsnerven. Klipp den bakre koppen i to halvdeler, passerer gjennom synsnerven. Overfør hver halvdel til de separate kassettene.Dehydrer vevet ved gradvis å øke konsentrasjonen av etanol fra 50% til 100% etanol. Og til slutt, fjern etanol med xylen. Impregner vevet med foroppvarmet parafin ved 60 grader Celsius for å erstatte xylen i vevet.Forbered parafinblokkene ved hjelp av en stålform for å holde vevet og kassetten som base. Mens du forbereder blokken, bør den optiske platedelen av øyet vende mot bunnen av stålformen. Fyll kassetten med parafin og overfør den til en kjølig overflate.Monter bladet og kassetten på de respektive holderne på mikrotom. Bruk en mikrotom, trim overflødig parafinvoks og kutt et bånd på fem til seks seksjoner med en tykkelse på 5 mikrometer. Overfør båndet på overflaten av forvarmet vannbad for å utfolde båndet.Samle seksjonene på en glasssklie belagt med albumin. La skredene tørke over natten ved 37 grader Celsius. For å utføre Hematoxylin og Eosin farging, forvarm lysbildene ved 60 grader Celsius i 1 time for å smelte parafinen.Følg fargingsprosedyren som angitt i manuskriptet. Begynn med rehydrering av vev, og flekk deretter med Hematoksylin etterfulgt av Eosin. Dehydrer nå vevet og legg til monteringsmedium på seksjonene.Plasser dekselsklien på seksjoner og visualiser under lysmikroskop. For å utføre blod-retinal barriere sammenbrudd analyse, bedøve rotten ved hjelp av ketamin og xylazin og bekrefte bedøvelse tilstand ved tå klype. Finn hjertet og sett inn 1 ml sprøyte med 24-gauge nål for å trekke blodet ved hjerte punktering.Når tilstrekkelig blod er samlet inn, overfør det til EDTA-belagt rør. Bland det forsiktig for å forhindre hemolyse. Forføre øyet og umiddelbart overføre det til tørris.Under frosne forhold, begynn disseksjon av øyet ved fjerning av hornhinnen og linsen. Trekk glasslegemet fra bakre øyesegment ved hjelp av tang uten forurensning fra netthinnen. Overfør det til homogeniserende rør med tre til fire perler.Homogeniser prøvene ved hjelp av perle homogenisator ved middels hastighet i 10 sekunder. Overfør blod og glasslegemet humorprøver til mikrosenterrør for å behandle videre. Sentrifuger begge prøvene ved 5200 g i 10 minutter ved 4 grader Celsius.Bruk en flerkanals pipette, tilsett 250 mikroliter Bradford-reagens i brønner. Fortynn glasslegemeprøver 10 ganger og plasmaprøver 20 ganger ved bruk av PBS. Tilsett 5 mikroliter fortynnede prøver til Bradford reagens og bland godt.Inkuber prøvene i 20 til 30 minutter, og mål deretter absorbansen ved 590 nanometer ved hjelp av en 96-brønns plateleser. Intensiteten av prøven er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av protein. For å utføre fluorescensangiografi, bedøv rotten ved hjelp av 3% isofluran og bekreft bedøvelsestilstanden ved tåstans.Dypp halen i varmt vann før du injiserer fargestoffet. Injiser 1 ml 50 mg per ml FITC-dextranoppløsning i lateral hale vene. La fargestoffet sirkulere i 5 til 10 minutter.Euthanize rotten ved hjelp av pentobarbital og bekrefte sin død uten påviselig hjerteslag. Forfør øyet og fortsett med flat monteringsforberedelse. For å forberede retinal flat montering, plasser øyet på en fiberfri Kimwipe og kutt den fremre delen av øyet.Trekk linsen sakte, sammen med glasslegemet humor, fra det bakre øyesegmentet. Overfør det bakre segmentet til Petri-tallerkenen fylt med PBS og kutt synsnerven. Plasser nå spissen av den spisse tangen mellom sclera og netthinnen.Beveg den forsiktig langs kanten av koppen for å sikre at netthinnen ikke er festet til sclera på noe tidspunkt. Klipp nær den optiske platen, slik at netthinnen helt løsner fra scleraen. Når det er bekreftet at netthinnen ikke er festet til sclera på noen side, skyv den sakte inn i PBS-løsningen.Ved hjelp av en tang, overfør netthinnen på en ren glasssklie uten å forårsake skade på den. Bruk mikro saks eller skalpellblad, gjør fire kutt på netthinnen, som vist, for å dele den i fire kvadranter. Fjern overflødig PBS fra netthinneomgivelser og legg til anti-falming monteringsmedium på retinal flat braketten.Dekk den med en dekslelip og visualiser den flate braketten under konfokalt mikroskop. Det er viktig å merke seg her at hele prosessen med fluorescens angiografi utføres under minimum lys for å unngå slukking av fluorescens fra FITC-dextran fargestoff. I diabetikerrotte gjennomgår retinalcellene degenerasjon, noe som fører til ytterligere komplikasjoner.Disse strukturelle endringene kan visualiseres ved histologiteknikk for å bestemme cellenummeret og tykkelsen på netthinnen. Ved diabetikerrotter øker tykkelsen på retinallag på grunn av ødem. Derfor bidrar denne teknikken til å screene ulike potensielle farmakologiske midler for å behandle diabetisk retinopati.Metabolske endringer i netthinnen på grunn av diabetes forårsaker tap av pericytter og nedbrytning av blod-retinal barriere. Som det er lekkasje av protein og andre biomolekyler i netthinnen og glasslegemet, øker nivåene av total proteinøkning i glasslegemet av diabetikerrotter. Forebygging av nedbrytning av blod-retinal barriere kan betydelig hemme fremdriften av diabetisk retinopati.I diabetisk retinopati øker uttrykk for vaskulær endotel vekstfaktor som fører til dannelse av nye kar. Disse fartøyene forstyrrer den normale netthinnestrukturen, og derfor er dens innervering av primær bekymring for å behandle diabetisk retinopati. Fluorescens angiografi teknikk brukes til å visualisere nye blodårer og også lekkasje av blodårer, som fremhevet her.Angiogenese er imidlertid fremtredende bare etter seks til 12 måneder med diabetesinduksjon. Denne teknikken hjelper oss med å kvantifisere effekten av legemiddelbehandling på innervasjon av angiogenese og vaskulær lekkasje. Den fremtidige behandlingen av diabetisk retinopati trenger mer effektive farmakologiske midler, men fremtidige behandlinger kan bare oppnås gjennom bedre forståelse av sykdomspatogenesen.Mestring av disse teknikkene kan hjelpe forskere til å få en bedre forståelse av patogenese av diabetisk retinopati, noe som kan føre til en oppdagelse av bedre farmakologiske intervensjoner.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

En modell av kronisk næringsstoff Infusion i Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Evaluering av Tumor-infiltrere Leukocytt Delsett i en Subkutan Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus autofluorescence for Evaluering av retinal sykdommer

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom-induserende prosedyre i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Evaluering av cerebral Blood Flow Autoregulation i Rat bruke laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Standardisert histomorfoometrisk evaluering av slitasjegikt i en kirurgisk musemodell

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Oksygenindusert retinopati modell for iskemiske retinale sykdommer hos gnagere

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

Akupunktur i en rottemodell av astma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epiteltransplantasjon i en ikke-menneskelig primatmodell for degenerative netthinnesykdommer

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Evaluering av leverglukoseproduksjon i en musmodell av polycystisk eggstokksyndrom

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...