Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Os autores gostariam de reconhecer o Conselho Indiano de Pesquisa Médica (ICMR; ITR-2020-2882) para apoio de financiamento ao Dr. Nirmal J. Gostaríamos também de agradecer à University Grant of Commission por fornecer bolsa de pesquisa júnior a Manisha Malani e ao Centro de Laboratórios Analíticos Centrais, BITS-Pilani, campus hyderabad por fornecer instalações de infraestrutura.

Este protocolo segue todas as diretrizes de cuidados com animais fornecidas pelo Comitê de Ética Animal Institucional, BITS-Pilani, campus Hyderabad.
1. Histologia da retina
<ol><li>Enucleação e fixação do olho<ol>
<li>Eutanize um rato macho Wistar diabético de 2 a 3 meses de idade, juntamente com o controle de idade (14 a 15 semanas de idade) usando uma alta dose de pentobarbital (150 mg/kg) injetado através da rota intraperitoneal. Nenhum batimento cardíaco detect...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Histologia A histologia retinária é realizada para visualizar as alterações morfológicas das células e camadas da retina. Várias etapas, incluindo escolha de solução fixativa, duração de fixação, desidratação e impregnação de parafina, precisam ser otimizadas. O tamanho do tecido não deve exceder 3 mm, pois a penetração fixa torna-se lenta. O paraformaldeído de 4% comumente utilizado leva ao descolamento da retina mesmo no olho saudável devido à osmolaridade relativamente alta d...

A retinopatia diabética (DR) é uma das complicações secundárias mais complexas do diabetes mellitus. É também a principal causa de cegueira evitável na população em idade de trabalhar em todo o mundo. Em uma meta-análise recente de 32,4 milhões de pessoas cegas, 830.000 (2,6%) pessoas ficaram cegas devido ao DR1. A proporção de perda de visão atribuída ao diabetes ficou em sétimo lugar em 2015, com 1,06% (0,15-2,38) globalmente 2,3.
A retinopatia diabética é diagnosticada por anormalidades vasculares nos tecidos oculares posteriores. Clinicamente, é dividido em duas etapas - DR não proliferativa (NPDR) e DR Proliferativa (PDR), com base na vascularização na retina. A hiperglicemia é considerada o potente regulador da DR, pois implica várias vias envolvidas na neurodegeneração4,5, inflamação6,7 e microvasculatura8 na retina. Múltiplas complicações metabólicas induzidas devido à hiperglicemia incluem o acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs), via poliol, via hexosamina e via proteína quinase-C. Essas vias são responsáveis pela proliferação celular (células endoteliais), migração (pericítos) e apoptose (células neurais da retina, pericítes e células endoteliais) com base em diferentes estágios de retinopatia diabética. Essas alterações metabólicas podem levar a alterações fisiológicas como descolamento da retina, perda de células da retina, quebra da barreira sanguínea-retina (BRB), aneurismas e angiogênese9.
A estreptozotocina (STZ) induzida pelo diabetes tipo 1 é uma prática bem estabelecida e bem aceita em ratos para avaliar a patogênese do diabetes e suas complicações. Os efeitos diabetogênicos da STZ são devido à destruição seletiva da ilhota pancreática β células10. Como resultado, os animais sofrerão deficiência de insulina, hiperglicemia, polidipsia e poliuria, todas características do diabetes mellitus11 humano. Para indução grave de diabetes, a STZ é administrada a 40-65 mg/kg de peso corporal por via intravenosa ou intraperitoneal durante a idade adulta. Após aproximadamente 72 h, esses animais apresentam níveis de glicemia superiores a 250 mg/dL10,12.
Para entender as alterações fisiológicas da retina devido à neurodegeneração, inflamação e angiogênese, diferentes técnicas devem ser otimizadas em modelos animais experimentais. Alterações estruturais e funcionais nas células da retina e vasos da retina podem ser estudadas por várias técnicas como histologia, ensaio de quebra de BRB e angiografia de fluorescência.
A histologia envolve o estudo da anatomia de células, tecidos e órgãos a um nível microscópico. Estabelece uma correlação entre a estrutura e a função das células/tecidos. Várias etapas são realizadas para visualizar e identificar as alterações microscópicas na estrutura tecidual, comparando assim contrapartidas saudáveis e doentes13. Por isso, é essencial padronizar meticulosamente cada passo da histologia. Várias etapas envolvidas na histologia da retina são a fixação do espécime, aparação do espécime, desidratação, clareamento, impregnação com parafina, incorporação, secção e coloração (hemaoxílina e eosina coloração)13,14.
Em uma retina saudável, o transporte de moléculas através da retina é controlado pelo BRB, composto por células endoteliais e pericílitos no lado interno, e células epiteliais de pigmento da retina no lado externo. No entanto, as células endoteliais internas do BRB e os pericítos começam a se degenerar durante a condição doente, e o BRB também está comprometido15. Devido a este colapso do BRB, muitas moléculas de baixo peso molecular vazam em tecido vítreo e retiniano16. À medida que a doença progride, muitas outras moléculas de proteínas (baixo e alto peso molecular) também vazam em tecido vítreo e retiniano devido à perturbação da homeostase17. Leva a várias outras complicações e, em última instância, edema macular e cegueira. Assim, quantificar os níveis de proteína nos estados vítreos e comparar os estados saudáveis e diabéticos comprometeu o BRB.
A angiografia da fluorescência é uma técnica usada para estudar a circulação sanguínea da retina e coroide usando corante fluorescente. É usado para visualizar vasculatura da retina e coroide injetando corante de fluoresceína via rota intravenosa ou injeção cardíaca18. Uma vez que o corante é injetado, ele atinge primeiro as artérias da retina, seguido por veias da retina. Esta circulação de corante é geralmente concluída dentro de 5 a 10 minutos a partir da injeção de corante19. É uma técnica importante para diagnosticar várias doenças oculares posteriores, incluindo retinopatia diabética e neovascularização choroidal20. Ajuda a detectar grandes e pequenas mudanças de vasculatura em condições normais e doentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

Uma doença ocular do segmento posterior como a retinopatia diabética altera a fisiologia da retina. A retinopatia diabética é caracterizada por um descolamento da retina, quebra da barreira hemistê-retinária (BRB) e angiogênese da retina. Um modelo de rato in vivo é uma ferramenta experimental valiosa para examinar as mudanças na estrutura e função da retina. Propomos três técnicas experimentais diferentes no modelo de ratos para identificar alterações morfológicas das células da retina, vasculatura da retina e BRB comprometido. A histologia da retina é usada para estudar a morfologia de várias células da retina. Além disso, a medição quantitativa é realizada pela contagem de células da retina e medição da espessura de diferentes camadas de retina. Um ensaio de avaria brb é usado para determinar o vazamento de proteínas extraoculares do plasma para tecido vítreo devido à quebra do BRB. A angiografia da fluorescência é usada para estudar angiogênese e vazamento de vasos sanguíneos visualizando vasculatura de retina usando corante FITC-dextran.

Histologia da retina Na retina diabética, as células da retina sofrem degeneração. Além disso, a espessura das camadas de retina aumenta devido ao edema22. As imagens obtidas após a coloração de Hematoxilina e Eosina podem ser usadas para contagem de células e medição da espessura de diferentes camadas, como mostrado na Figura 2 usando ImageJ.
Ensaio de quebra da barreira de retina sanguínea<...

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Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. Histologia, ensaio de quebra da barreira hemorrânica e angiografia de fluorescência são técnicas valiosas para entender a fisiopatologia da retina, o que poderia aumentar ainda mais o rastreamento eficiente de drogas contra a retinopatia diabética.

Avaliação fisiofisiológica da retina em um modelo de rato

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

O objetivo geral dessas técnicas é avaliar a fisiopatologia da retina no modelo de rato de retinopatia diabética induzida pela estreptozoocina. A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. A busca contínua está acontecendo para descobrir agentes farmacológicos com melhor eficácia e ação mais longa para tratar a retinopatia diabética.O processo de descoberta de agentes farmacológicos em modelos animais pré-clínicos desempenha um papel vital. Esses modelos animais ajudam a entender as alterações estruturais e funcionais dos tecidos posteriores do segmento do olho. Por isso, vamos demonstrar três técnicas diferentes para estudar essas alterações nas questões posteriores do segmento.Estamos demonstrando histologia para estudar alterações morfológicas de células da retina em camadas, ensaio de quebra de BRB para estudar BRB comprometido quantificando proteína vazada no vítreo do plasma, e também angiografia fluoresce para visualizar vasculatura retina usando corante FITC-dextran. Eutanize rato usando alta dose de pentobarbital e confirme sua morte sem batimentos cardíacos detectáveis. Enuclear o olho fazendo incisões usando uma lâmina de bisturi nas regiões nasais e temporais do olho.Em seguida, corte ao longo de suas bordas para remover o olho da tomada orbital. Remova o excesso de gordura ao redor do olho e coloque-o em 5 mL de solução fixa. Incubar o olho em solução fixa por 24 a 48 horas.Após a fixação, retire o olho da solução fixativa e transfira para a placa de Petri cheia de PBS de 10 mL. Usando micro fórceps, segure o olho com nervo óptico e faça um corte no pars plana com a ajuda de micro tesouras. Corte toda a margem da córnea para separar a xícara anterior e a xícara posterior do olho.Remova a lente e corte o nervo óptico. Corte o copo posterior em duas metades, passando pelo nervo óptico. Transfira cada metade para as fitas separadas.Desidratar o tecido aumentando gradualmente a concentração de etanol de 50% para 100% de etanol. E, finalmente, limpe o etanol com xileno. Impregnar o tecido com parafina pré-aquecida a 60 graus Celsius para substituir o xileno no tecido.Prepare os blocos de parafina usando um molde de aço para manter o tecido e a fita como base. Durante a preparação do bloco, a parte do disco óptico do olho deve enfrentar a parte inferior do molde de aço. Encha a fita com parafina e transfira para uma superfície fria.Monte a lâmina e o nos respectivos suportes em microtome. Usando um microtome, corte o excesso de cera de parafina e corte uma fita de cinco a seis seções com uma espessura de 5 micrômetros. Transfira a fita para a superfície do banho de água pré-aquecido para desdobrar a fita.Colete as seções em um slide de vidro revestido com albumina. Deixe os slides secarem durante a noite a 37 graus Celsius. Para realizar a coloração de Hematoxilina e Eosin, pré-aqueça os slides a 60 graus Celsius por 1 hora para derreter a parafina.Siga o procedimento de coloração conforme dado no manuscrito. Comece com a reidratação do tecido, e depois manche com Hematoxilina seguida de Eosin. Agora, desidrate o tecido e adicione meio de montagem nas seções.Coloque o deslizamento da tampa nas seções e visualize sob microscópio leve. Para realizar o ensaio de quebra da barreira sanguínea-retina, anestesiar o rato usando cetamina e xilazina e confirmar o estado anestésico por beliscão do dedo do dedo do sol. Localize o coração e insira uma seringa de 1 mL com agulha de calibre 24 para extrair o sangue por punção cardíaca.Uma vez coletado o sangue suficiente, transfira-o para o tubo revestido de EDTA. Misture-o suavemente para evitar hemólise. Enuclear o olho e transferi-lo imediatamente para gelo seco.Em condições congeladas, inicie a dissecção do olho pela remoção da córnea e das lentes. Puxe o vítreo do segmento posterior do olho usando fórceps sem qualquer contaminação da retina. Transfira para tubo homogeneizador com três a quatro contas.Homogeneize as amostras usando homogeneizador de contas em velocidade média por 10 segundos. Transfira amostras de sangue e humor vítreo em tubos de microcentrifuuge para processar ainda mais. Centrifugar ambas as amostras a 5,200 g por 10 minutos a 4 graus Celsius.Usando uma pipeta multicanal, adicione 250 microliters de reagente bradford em poços. Diluir amostras vítreas 10 vezes e amostras de plasma 20 vezes usando PBS. Adicione 5 microliters de amostras diluídas ao reagente bradford e misture bem.Incubar as amostras por 20 a 30 minutos e, em seguida, medir a absorvência em 590 nanômetros usando um leitor de placas de 96 poços. A intensidade da amostra é diretamente proporcional à concentração de proteínas. Para realizar a angiografia da fluorescência, anestesia o rato usando 3% de isoflurane e confirme o estado anestésico por soco no dedo do dedo do sol.Mergulhe a cauda em água morna antes de injetar o corante. Injete 1 mL de 50 mg por mL solução FITC-dextran na veia traseira lateral. Deixe o corante circular por 5 a 10 minutos.Eutanize o rato usando pentobarbital e confirme sua morte sem batimentos cardíacos detectáveis. Enuclear o olho e proceder para a preparação da montagem plana. Para preparar o suporte plano de retina, coloque o olho em um Kimwipe livre de fibras e corte a porção anterior do olho.Puxe lentamente a lente, junto com o humor vítreo, do segmento posterior do olho. Transfira o segmento posterior para a placa de Petri cheia de PBS e corte o nervo óptico. Agora, coloque a ponta do forcep pontiagudo entre esclera e retina.Mova-o suavemente ao longo da borda do copo para ter certeza de que a retina não está presa à esclera em nenhum momento. Corte perto do disco óptico, de tal forma que a retina se desprende completamente da esclera. Uma vez confirmado que a retina não está presa à esclera em nenhum lado, empurre-a lentamente para dentro da solução PBS.Com a ajuda de um forcep, transfira a retina para uma lâmina de vidro limpa sem causar nenhum dano a ele. Usando micro tesoura ou lâmina de bisturi, faça quatro cortes na retina, como mostrado, para dividi-la em quatro quadrantes. Remova o excesso de PBS do ambiente da retina e adicione meio de montagem anti-desbotamento no suporte plano da retina.Cubra-o com uma mancha de cobertura e visualize o suporte plano sob microscópio confocal. É importante notar aqui que todo o processo de angiografia fluorescência é realizado sob luz mínima para evitar a saciecia da fluorescência do corante FITC-dextran. Em ratos diabéticos, as células da retina sofrem degeneração, o que leva a complicações adicionais.Essas alterações estruturais podem ser visualizadas pela técnica de histologia para determinar o número celular e a espessura da retina. No caso de ratos diabéticos, a espessura das camadas de retina aumenta devido ao edema. Assim, essa técnica ajuda a testar vários potenciais agentes farmacológicos para tratar a retinopatia diabética.Alterações metabólicas na retina devido ao diabetes causam perda de pericitos e quebra da barreira hemencefálica. Como há vazamento de proteínas e outras biomoléculas na retina e vítreos, os níveis de proteína total aumentam no vítreo de ratos diabéticos. Prevenir a quebra da barreira hemico-retina pode dificultar significativamente o progresso da retinopatia diabética.Na retinopatia diabética, a expressão do fator de crescimento endotelial vascular aumenta que levam à formação de novos vasos. Esses vasos perturbam a estrutura normal da retina e, portanto, sua inervação é de preocupação primária para tratar a retinopatia diabética. A técnica de angiografia da fluorescência é utilizada para visualizar novos vasos sanguíneos e também vazamento de vasos sanguíneos, como destacado aqui.No entanto, a angiogênese só é proeminente após seis a 12 meses de indução de diabetes. Esta técnica nos ajuda a quantificar o efeito do tratamento medicamentoso na inervação da angiogênese e do vazamento vascular. O tratamento futuro da retinopatia diabética precisa de agentes farmacológicos mais eficientes, mas os tratamentos futuros só podem ser alcançados através da melhor compreensão da patogênese da doença.Dominar essas técnicas poderia ajudar os pesquisadores a ter uma melhor compreensão sobre a patogênese da retinopatia diabética, o que poderia levar a uma descoberta de melhores intervenções farmacológicas.

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A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

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Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma de indução de Procedimento em um<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de Rato e Whole mount-Retina Preparação

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