Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить Индийский совет медицинских исследований (ICMR; ITR-2020-2882) для финансирования поддержки д-ра Нирмала Дж. Мы также хотели бы поблагодарить Университетский грант Комиссии за предоставление младшей исследовательской стипендии Манише Малани и Центральному аналитическому лабораторному центру, BITS-Pilani, кампус Хайдарабада для предоставления инфраструктурного объекта.

Этот протокол следует всем руководящим принципам ухода за животными, предоставленным Институциональным комитетом по этике животных, BITS-Pilani, кампус Хайдарабада.
1. Гистология сетчатки
<ol><li>Энуклеация и фиксация глаза<ol>
<li>Усыплите самца крысы Wistar в возрасте от 2 ...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathophysiology+and+treatments.">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats.">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li><li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Гистология Гистология сетчатки проводится для визуализации морфологических изменений клеток и слоев сетчатки. Необходимо оптимизировать различные этапы, включая выбор фиксирующего раствора, продолжительность фиксации, обезвоживание и пропитку парафином. Размер ткани не ...

Диабетическая ретинопатия (ДР) является одним из самых сложных вторичных осложнений сахарного диабета. Это также является основной причиной предотвратимой слепоты среди населения трудоспособного возраста во всем мире. В недавнем мета-анализе 32,4 миллиона слепых людей 830 000 (2,6%) человек были слепыми из-за DR1. Доля потери зрения, связанной с диабетом, заняла седьмое место в 2015 году с 1,06% (0,15-2,38) во всем мире2,3.
Диабетическая ретинопатия диагностируется сосудистыми аномалиями в задних глазных тканях. Клинически он делится на две стадии – непролиферативный ДР (NPDR) и пролиферативный DR (PDR), основанный на васкуляризации в сетчатке. Гипергликемия считается мощным регулятором ДР, поскольку она включает в себя несколько путей, участвующих в нейродегенерации4,5, воспалении6,7 и микроциркуляторном русле8 в сетчатке. Множественные метаболические осложнения, вызванные гипергликемией, включают накопление конечных продуктов гликирования (AGE), полиольного пути, гексозаминового пути и пути протеинкиназы-С. Эти пути отвечают за пролиферацию клеток (эндотелиальные клетки), миграцию (перициты) и апоптоз (нервные клетки сетчатки, перициты и эндотелиальные клетки) на основе различных стадий диабетической ретинопатии. Эти метаболические изменения могут привести к физиологическим изменениям, таким как отслоение сетчатки, потеря клеток сетчатки, разрушение гематоэнцефалического барьера (BRB), аневризмы и ангиогенез9.
Стрептозотоцин (СТЗ), индуцированный диабетом 1 типа, является хорошо зарекомендовавшей себя и общепринятой практикой у крыс для оценки патогенеза диабета и его осложнений. Диабетогенные эффекты СТЗ обусловлены селективным разрушением островков поджелудочной железы β-клеток10. В результате животные будут подвергаться дефициту инсулина, гипергликемии, полидипсии и полиурии, все из которых характерны для сахарного диабета 1 типа 11. При тяжелой индукции диабета СТЗ вводят при 40-65 мг/кг массы тела внутривенно или внутрибрюшинно во взрослом возрасте. Примерно через 72 ч у этих животных уровень глюкозы в крови превышает 250 мг/дл10,12.
Чтобы понять физиологические изменения сетчатки из-за нейродегенерации, воспаления и ангиогенеза, различные методы должны быть оптимизированы на экспериментальных моделях животных. Структурные и функциональные изменения в клетках сетчатки и сосудах сетчатки могут быть изучены различными методами, такими как гистология, анализ распада BRB и флуоресцентная ангиография.
Гистология предполагает изучение анатомии клеток, тканей и органов на микроскопическом уровне. Устанавливает корреляцию между структурой и функцией клеток/тканей. Выполняется несколько этапов для визуализации и идентификации микроскопических изменений в структуре тканей, тем самым сравнивая здоровых и больных аналогов13. Следовательно, важно тщательно стандартизировать каждый шаг гистологии. Различные этапы, связанные с гистологией сетчатки, включают фиксацию образца, обрезку образца, обезвоживание, очистку, пропитку парафином, встраивание парафина, сечение и окрашивание (окрашивание гематоксилином и эозином)13,14.
В здоровой сетчатке транспорт молекул через сетчатку контролируется BRB, состоящим из эндотелиальных клеток и перицитов на внутренней стороне и пигментных эпителиальных клеток сетчатки на внешней стороне. Тем не менее, внутренние эндотелиальные клетки BRB и перициты начинают дегенерировать во время болезненного состояния, и BRB также скомпрометирован15. Из-за этого распада BRB многие низкомолекулярные молекулы просачиваются в стекловидное тело и ткань сетчатки16. По мере прогрессирования заболевания многие другие белковые молекулы (с низкой и высокой молекулярной массой) также просачиваются в стекловидное тело и ткань сетчатки из-за нарушения гомеостаза17. Это приводит к различным другим осложнениям и, в конечном счете, к макулярному отеку и слепоте. Следовательно, количественная оценка уровня белка в стекловидном теле и сравнение здоровых и диабетических состояний измеряет скомпрометированный BRB.
Флуоресцентная ангиография – это методика, используемая для изучения кровообращения сетчатки и сосудистой оболочки с использованием флуоресцентного красителя. Он используется для визуализации сосудистой системы сетчатки и сосудистой оболочки путем введения флуоресцеинового красителя внутривенным путем или сердечной инъекцией18. Как только краситель вводится, он сначала достигает артерий сетчатки, а затем вен сетчатки. Эта циркуляция красителя обычно завершается в течение 5-10 мин после инъекции красителя19. Это важный метод диагностики различных заболеваний заднего сегмента глаз, включая диабетическую ретинопатию и хориоидальную неоваскуляризацию20. Он помогает обнаружить большие и незначительные изменения сосудистой системы в нормальных и больных условиях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

Заболевание заднего сегмента глаз, такое как диабетическая ретинопатия, изменяет физиологию сетчатки. Диабетическая ретинопатия характеризуется отслоением сетчатки, нарушением гемато-ретинального барьера (BRB) и ангиогенезом сетчатки. Модель крысы in vivo является ценным экспериментальным инструментом для изучения изменений в структуре и функции сетчатки. Мы предлагаем три различных экспериментальных метода в модели крыс для выявления морфологических изменений клеток сетчатки, сосудистой системы сетчатки и скомпрометированного BRB. Гистология сетчатки используется для изучения морфологии различных клеток сетчатки. Кроме того, количественное измерение выполняется путем подсчета клеток сетчатки и измерения толщины различных слоев сетчатки. Анализ распада BRB используется для определения утечки экстраокулярных белков из плазмы в стекловидное тело из-за распада BRB. Флуоресцентная ангиография используется для изучения ангиогенеза и утечки кровеносных сосудов путем визуализации сосудистой системы сетчатки с использованием красителя FITC-декстран.

Гистология сетчатки В диабетической сетчатке клетки сетчатки подвергаются дегенерации. Кроме того, толщина слоев сетчатки увеличивается из-за отеков22. Изображения, полученные после окрашивания гематоксилином и эозином, могут быть использованы для подсчета кл?...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Диабетическая ретинопатия является одной из ведущих причин слепоты. Гистология, анализ разрушения барьера сетчатки крови и флуоресцентная ангиография являются ценными методами для понимания патофизиологии сетчатки, что может еще больше повысить эффективность скрининга лекарств против диабетической ретинопатии.

Патофизиологическая оценка сетчатки в модели крысы

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Общей целью этих методов является оценка патофизиологии сетчатки в модели крыс, вызванной стрептозотоцином. Диабетическая ретинопатия является одной из ведущих причин слепоты. Непрерывный поиск продолжается, чтобы обнаружить фармакологические агенты с лучшей эффективностью и более длительным действием для лечения диабетической ретинопатии.Процесс обнаружения фармакологических агентов на доклинических моделях животных играет жизненно важную роль. Эти животные модели помогают понять структурные и функциональные изменения тканей заднего сегмента глаза. Поэтому мы продемонстрируем три различных метода изучения этих изменений в вопросах заднего сегмента.Мы демонстрируем гистологию для изучения морфологических изменений клеток сетчатки в слоях, анализ распада BRB для изучения скомпрометированного BRB путем количественной оценки просочившегося белка в стекловидном теле из плазмы, а также флуоресцентную ангиографию для визуализации сосудистой системы сетчатки с использованием красителя FITC-декстран. Усыпляют крысу, используя высокие дозы пентобарбитала и подтверждают ее смерть без обнаруживаемого сердцебиения. Энуклеат глаза, делая разрезы с помощью лезвия скальпеля на носовой и височной областях глаза.Затем обрежьте по его краям, чтобы удалить глазок из орбитальной впадины. Удалите лишний жир, окружающий глаз, и поместите его в 5 мл фиксирующего раствора. Инкубируют глаз в фиксаторном растворе в течение 24-48 часов.После фиксации удаляют глаз из фиксирующего раствора и перекладывают на чашку Петри, наполненную 10 мл PBS. Используя микрощипцы, удерживайте глаз зрительным нервом и сделайте кольцу на pars plana с помощью микроножек. Прорежьте весь край роговицы, чтобы отделить переднюю чашечку и заднюю чашку глаза.Снимите хрусталик и перережьте зрительный нерв. Разрезать заднюю чашечку на две половинки, проходя через зрительный нерв. Переложите каждую половинку в отдельные кассеты.Обезвоживают ткани путем постепенного повышения концентрации этанола с 50% до 100% этанола. И, наконец, очистите этанол с ксилолом. Пропитать ткань предварительно нагретым парафином при 60 градусах Цельсия, чтобы заменить ксилол в ткани.Подготовьте парафиновые блоки, используя стальную форму, чтобы удерживать ткань и кассету в качестве основы. Во время подготовки блока часть глаза, посвященная диску зрительного нерва, должна быть обращена к нижней части стальной формы. Наполните кассету парафином и переложите на холодную поверхность.Установите лезвие и кассету на соответствующие держатели на микротоме. Используя микротом, обрежьте лишний парафиновый воск и перережьте ленту из пяти-шести секций толщиной 5 микрометров. Переложите ленту на поверхность предварительно подогретой водяной бани, чтобы развернуть ленту.Соберите секции на стеклянной горке, покрытой альбумином. Дайте горкам высохнуть ночью при температуре 37 градусов по Цельсию. Чтобы выполнить окрашивание гематоксилином и эозином, разогрейте слайды при 60 градусах Цельсия в течение 1 часа, чтобы расплавить парафин.Следуйте процедуре окрашивания, приведенной в рукописи. Начинают с регидратации тканей, а затем окрашивают гематоксилином с последующим Эозином. Теперь обезвоживаем ткань и добавляем монтажную среду на срезы.Поместите крышку на секции и визуализируйте под световым микроскопом. Чтобы выполнить анализ разрушения барьера сетчатки крови, обезболить крысу с помощью кетамина и ксилазина и подтвердить анестезирующее состояние путем ущемления пальца ноги. Найдите сердце и вставьте шприц 1 мл с иглой 24-го калибра, чтобы взять кровь путем прокола сердца.Как только будет собрано достаточное количество крови, перенесите ее в трубку, покрытую ЭДТА. Осторожно перемешайте его, чтобы предотвратить гемолиз. Энуклеазируйте глаз и сразу же перенесите его на сухой лед.В замороженных условиях начинают рассечение глаза с удаления роговицы и хрусталика. Вытяните стекловидное тело из заднего сегмента глаза с помощью щипцов без какого-либо загрязнения от сетчатки. Переложите его в гомогенизирующую трубку с тремя-четырьмя шариками.Гомогенизируйте образцы с помощью гомогенизатора шариков на средней скорости в течение 10 секунд. Перенесите образцы крови и стекловидного тела в микроцентрифужные трубки для дальнейшей обработки. Центрифугируйте оба образца по 5, 200 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.Используя многоканальную пипетку, добавьте в скважины 250 микролитров реагента Брэдфорда. Разбавьте образцы стекловидного тела 10 раз и образцы плазмы 20 раз с помощью PBS. Добавьте 5 микролитров разбавленных образцов в реагент Брэдфорда и хорошо перемешайте.Инкубируйте образцы в течение 20-30 минут, а затем измеряйте поглощение на 590 нанометрах с помощью 96-луночного пластинчатого считывателя. Интенсивность пробы прямо пропорциональна концентрации белка. Для выполнения флуоресцентной ангиографии обезболивают крысу с помощью 3% изофлурана и подтверждают анестетиковое состояние ударом пальца ноги.Окуните хвост в теплую воду перед инъекцией красителя. Вводят 1 мл 50 мг на мл раствора FITC-декстрана в боковую хвостовую вену. Дайте красителю циркулировать в течение 5-10 минут.Усыплите крысу с помощью пентобарбитала и подтвердите ее смерть без обнаружения сердцебиения. Энуклеарьте глаз и приступайте к подготовке плоского крепления. Чтобы подготовить плоское крепление сетчатки, поместите глаз на безволокнистый Kimwipe и срежьте переднюю часть глаза.Медленно потяните хрусталик вместе со стекловидным телом из заднего сегмента глаза. Переместите задний сегмент в чашку Петри, заполненную PBS, и перережьте зрительный нерв. Теперь поместите кончик заостренного щипца между склерой и сетчаткой.Осторожно переместите его по всему краю чашки, чтобы убедиться, что сетчатка не прикреплена к склере в любой точке. Разрезают возле диска зрительного нерва, так что сетчатка полностью отделяется от склеры. Как только будет подтверждено, что сетчатка не прикреплена к склере с любой стороны, медленно протолкните ее в раствор PBS.С помощью щипца перенесите сетчатку на чистый стеклянный слайд, не нанося ей никакого ущерба. С помощью микроножек или лезвия скальпеля сделайте четыре надреза на сетчатке, как показано на рисунке, разделите ее на четыре квадранта. Удалите излишки PBS из окружения сетчатки и добавьте антиувядающую монтажную среду на плоское крепление сетчатки.Накройте его чехлом и визуализируйте плоское крепление под конфокальным микроскопом. Здесь важно отметить, что весь процесс флуоресцентной ангиографии выполняется при минимальном освещении, чтобы избежать гашения флуоресценции от красителя FITC-декстран. У крыс с диабетом клетки сетчатки подвергаются дегенерации, что приводит к дальнейшим осложнениям.Эти структурные изменения могут быть визуализированы с помощью гистологической техники для определения количества клеток и толщины сетчатки. У крыс с диабетом толщина слоев сетчатки увеличивается из-за отеков. Следовательно, этот метод помогает скрининг различных потенциальных фармакологических агентов для лечения диабетической ретинопатии.Метаболические изменения сетчатки из-за диабета вызывают потерю перицитов и разрушение гемато-ретинального барьера. Поскольку происходит утечка белка и других биомолекул в сетчатку и стекловидное тело, уровни общего белка увеличиваются в стекловидном теле диабетических крыс. Предотвращение разрушения гемато-ретинального барьера может значительно затруднить прогресс диабетической ретинопатии.При диабетической ретинопатии повышается экспрессия фактора роста эндотелия сосудов, что приводит к образованию новых сосудов. Эти сосуды нарушают нормальную структуру сетчатки, и поэтому ее иннервация имеет первостепенное значение для лечения диабетической ретинопатии. Метод флуоресцентной ангиографии используется для визуализации новых кровеносных сосудов, а также утечки кровеносных сосудов, как подчеркивается здесь.Тем не менее, ангиогенез заметен только после шести-12 месяцев индукции диабета. Этот метод помогает нам количественно оценить влияние медикаментозного лечения на иннервацию ангиогенеза и сосудистую утечку. Будущее лечение диабетической ретинопатии нуждается в более эффективных фармакологических средствах, но будущие методы лечения могут быть достигнуты только путем лучшего понимания патогенеза заболевания.Освоение этих методов может помочь исследователям лучше понять патогенез диабетической ретинопатии, что может привести к открытию лучших фармакологических вмешательств.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

Модели хронического Питательные инфузии у крыс

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Оценка опухоли инфильтрирующие лейкоцитов подмножеств в подкожной опухоли модели

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Количественный Fundus автофлюоресценции для оценки заболеваний сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Глаукома индуцирующего процедуры в<em&gt; В Vivo</em&gt; Крыса модель и всего монтажа Retina Подготовка

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Оценка саморегуляции мозгового кровного потока в Крысе с помощью лазерной доплеровской флоуметрии

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Стандартизированная гистоморфометрическая оценка остеоартрита в модели хирургической мыши

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Кислород-индуцированной ретинопатии Модель ишемической болезни сетчатки у грызунов

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

Иглоукалывание в крысиной модели астмы

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Трансплантация пигментного эпителия сетчатки в модели нечеловеческих приматов для дегенеративных заболеваний сетчатки

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Оценка производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...