Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Los autores desean reconocer al Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR; ITR-2020-2882) para el apoyo financiero al Dr. Nirmal J. También nos gustaría agradecer a University Grant of Commission por proporcionar una beca de investigación junior a Manisha Malani y a Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, campus de Hyderabad por proporcionar instalaciones de infraestructura.

Este protocolo sigue todas las pautas de cuidado animal proporcionadas por el Comité Institucional de Ética Animal, BITS-Pilani, campus de Hyderabad.
1. Histología de la retina
<ol><li>Enucleación y fijación del ojo<ol>
<li>Sacrificar a una rata macho Wistar diabética de 2 a 3 meses de edad junto con el control de la misma edad (14 a 15 semanas de edad) utilizando una dosis alta de pentobarbital (150 mg / kg) inyectado a través de la vía intraperitoneal. Ningún lati...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Histología La histología retiniana se realiza para visualizar los cambios morfológicos de las células y capas de la retina. Se deben optimizar varios pasos, incluida la elección de la solución fijadora, la duración de la fijación, la deshidratación y la impregnación de parafina. El tamaño del tejido no debe exceder los 3 mm, ya que la penetración del fijador se vuelve lenta. El paraformaldehído al 4% comúnmente utilizado conduce al desprendimiento de retina incluso en el ojo sano debido ...

La retinopatía diabética (RD) es una de las complicaciones secundarias más complejas de la diabetes mellitus. También es la principal causa de ceguera prevenible en la población en edad de trabajar en todo el mundo. En un metaanálisis reciente de 32,4 millones de personas ciegas, 830.000 (2,6%) personas eran ciegas debido a dr1. La proporción de pérdida de visión atribuida a la diabetes ocupó el séptimo lugar en 2015 con un 1,06% (0,15-2,38) a nivel mundial2,3.
La retinopatía diabética se diagnostica por anomalías vasculares en los tejidos oculares posteriores. Clínicamente, se divide en dos etapas: DR no proliferativa (NPDR) y DR proliferativa (PDR), según la vascularización en la retina. La hiperglucemia es considerada el potente regulador de la RD ya que implica varias vías implicadas en la neurodegeneración4,5, la inflamación6,7 y la microvasculatura8 en la retina. Las múltiples complicaciones metabólicas inducidas debido a la hiperglucemia incluyen la acumulación de productos finales de glicación avanzada (AGE), la vía del poliol, la vía de la hexosamina y la vía de la proteína quinasa-C. Estas vías son responsables de la proliferación celular (células endoteliales), la migración (pericitos) y la apoptosis (células retinianas neurales, pericitos y células endoteliales) basadas en diferentes etapas de la retinopatía diabética. Estas alteraciones metabólicas pueden conducir a cambios fisiológicos como desprendimiento de retina, pérdida de células retinianas, ruptura de la barrera sangre-retina (BRB), aneurismas y angiogénesis9.
La diabetes tipo 1 inducida por estreptozotocina (STZ) es una práctica bien establecida y bien aceptada en ratas para evaluar la patogénesis de la diabetes y sus complicaciones. Los efectos diabetogénicos de la STZ se deben a la destrucción selectiva de las células β de los islotes pancreáticos10. Como resultado, los animales sufrirán deficiencia de insulina, hiperglucemia, polidipsia y poliuria, todas las cuales son características de la diabetes mellitus tipo 1 humana11. Para la inducción de diabetes grave, STZ se administra a 40-65 mg / kg de peso corporal por vía intravenosa o intraperitoneal durante la edad adulta. Después de aproximadamente 72 h, estos animales presentan niveles de glucosa en sangre superiores a 250 mg/dL10,12.
Para comprender las alteraciones fisiológicas de la retina debidas a la neurodegeneración, la inflamación y la angiogénesis, se deben optimizar diferentes técnicas en modelos animales experimentales. Los cambios estructurales y funcionales en las células de la retina y los vasos retinianos se pueden estudiar mediante diversas técnicas, como la histología, el ensayo de descomposición de BRB y la angiografía por fluorescencia.
La histología implica el estudio de la anatomía de las células, tejidos y órganos a nivel microscópico. Establece una correlación entre la estructura y la función de las células/tejidos. Se realizan varios pasos para visualizar e identificar las alteraciones microscópicas en la estructura tisular, comparando así contrapartes sanas y enfermas13. Por lo tanto, es esencial estandarizar cada paso de la histología meticulosamente. Varios pasos involucrados en la histología retiniana son la fijación de la muestra, el recorte de la muestra, la deshidratación, el aclaramiento, la impregnación con parafina, la incrustación de parafina, la seccionamiento y la tinción (tinción de hematoxilina y eosina)13,14.
En una retina sana, el transporte de moléculas a través de la retina está controlado por BRB, compuesto por células endoteliales y pericitos en el lado interno, y células epiteliales pigmentarias de la retina en el lado externo. Sin embargo, las células endoteliales internas del BRB y los pericitos comienzan a degenerar durante la enfermedad, y el BRB también se ve comprometido15. Debido a esta descomposición del BRB, muchas moléculas de bajo peso molecular se filtran en el tejido vítreo y retiniano16. A medida que la enfermedad progresa, muchas otras moléculas de proteínas (bajo y alto peso molecular) también se filtran en el tejido vítreo y retiniano debido a la alteración de la homeostasis17. Conduce a varias otras complicaciones y, en última instancia, edema macular y ceguera. Por lo tanto, cuantificar los niveles de proteínas en el vítreo y comparar los estados saludables y diabéticos compromete las medidas de BRB.
La angiografía por fluorescencia es una técnica utilizada para estudiar la circulación sanguínea de la retina y la coroides utilizando tinte fluorescente. Se utiliza para visualizar la vasculatura de la retina y la coroides mediante la inyección de colorante de fluoresceína por vía intravenosa o inyección cardíaca18. Una vez que se inyecta el tinte, primero llega a las arterias de la retina, seguido de las venas de la retina. Esta circulación de tinte generalmente se completa dentro de los 5 a 10 minutos posteriores a la inyección de tinte19. Es una técnica importante para diagnosticar diversas enfermedades oculares del segmento posterior, incluyendo la retinopatía diabética y la neovascularización coroidea20. Ayuda a detectar cambios en la vasculatura mayor y menor en condiciones normales y enfermas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

Una enfermedad ocular del segmento posterior como la retinopatía diabética altera la fisiología de la retina. La retinopatía diabética se caracteriza por un desprendimiento de retina, ruptura de la barrera sangre-retina (BRB) y angiogénesis retiniana. Un modelo de rata in vivo es una valiosa herramienta experimental para examinar los cambios en la estructura y función de la retina. Proponemos tres técnicas experimentales diferentes en el modelo de rata para identificar cambios morfológicos de las células de la retina, la vasculatura retiniana y el BRB comprometido. La histología retiniana se utiliza para estudiar la morfología de varias células de la retina. Además, la medición cuantitativa se realiza mediante el recuento de células de la retina y la medición del grosor de diferentes capas de la retina. Un ensayo de descomposición de BRB se utiliza para determinar la fuga de proteínas extraoculares del plasma al tejido vítreo debido a la descomposición de BRB. La angiografía por fluorescencia se utiliza para estudiar la angiogénesis y la fuga de vasos sanguíneos mediante la visualización de la vasculatura retiniana con el tinte FITC-dextrano.

Histología retiniana En la retina diabética, las células de la retina sufren degeneración. Además, el grosor de las capas retinianas aumenta debido al edema22. Las imágenes obtenidas después de la tinción de hematoxilina y eosina se pueden utilizar para el recuento celular y la medición del grosor de diferentes capas, como se muestra en la Figura 2 utilizando ImageJ.
Ensayo de ruptura de la barrera sangr...

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Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

La retinopatía diabética es una de las principales causas de ceguera. La histología, el ensayo de ruptura de la barrera hematoencefaliana y la angiografía por fluorescencia son técnicas valiosas para comprender la fisiopatología de la retina, lo que podría mejorar aún más la detección eficaz de medicamentos contra la retinopatía diabética.

Evaluación fisiopatológica de la retina en un modelo de rata

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

El objetivo general de estas técnicas es evaluar la fisiopatología retiniana en el modelo de rata con retinopatía diabética inducida por estreptozotocina. La retinopatía diabética es una de las principales causas de ceguera. La búsqueda continua continúa para descubrir agentes farmacológicos con mejor eficacia y mayor acción para tratar la retinopatía diabética.El proceso de descubrimiento de agentes farmacológicos en modelos animales preclínicos juega un papel vital. Estos modelos animales ayudan a comprender las alteraciones estructurales y funcionales de los tejidos del segmento posterior del ojo. Por lo tanto, demostraremos tres técnicas diferentes para estudiar estas alteraciones en los problemas del segmento posterior.Estamos demostrando histología para estudiar los cambios morfológicos de las células de la retina en capas, ensayo de descomposición de BRB para estudiar BRB comprometido mediante la cuantificación de proteínas filtradas en el vítreo del plasma, y también angiografía fluorescencia para visualizar la vasculatura retiniana utilizando tinte FITC-dextrano. Sacrificar rata usando altas dosis de pentobarbital y confirmar su muerte sin latidos cardíacos detectables. Enucle el ojo haciendo incisiones usando una cuchilla de bisturí en las regiones nasal y temporal del ojo.Luego corte a lo largo de sus bordes para quitar el ojo de la cavidad orbitaria. Retire el exceso de grasa que rodea el ojo y colóquelo en 5 ml de solución fijadora. Incubar el ojo en solución fijadora durante 24 a 48 horas.Después de la fijación, retire el ojo de la solución fijadora y transfiéralo a una placa de Petri llena de 10 ml de PBS. Usando micro pinzas, sostenga el ojo con el nervio óptico y haga un corte en pars plana con la ayuda de micro tijeras. Corte a través de todo el margen de la córnea para separar la copa anterior y la copa posterior del ojo.Retire la lente y corte el nervio óptico. Corte la copa posterior en dos mitades, pasando a través del nervio óptico. Transfiera cada mitad a los casetes separados.Deshidratar el tejido aumentando gradualmente la concentración de etanol del 50% al 100% de etanol. Y finalmente, limpie el etanol con xileno. Impregnar el tejido con parafina precalentada a 60 grados centígrados para reemplazar el xileno en el tejido.Prepare los bloques de parafina usando un molde de acero para sostener el tejido y el cassette como base. Al preparar el bloque, la parte del disco óptico del ojo debe estar orientada hacia la parte inferior del molde de acero. Llene el cassette con parafina y transfiéralo a una superficie fría.Monte la cuchilla y el cassette en los respectivos soportes en el microtomo. Usando un microtomo, recorte el exceso de cera de parafina y corte una cinta de cinco a seis secciones con un grosor de 5 micrómetros. Transfiera la cinta a la superficie del baño de agua precalentada para desplegar la cinta.Recoge las secciones en un portaobjetos de vidrio recubierto con albúmina. Deje que los toboganes se sequen durante la noche a 37 grados centígrados. Para realizar la tinción de hematoxilina y eosina, precaliente los portaobjetos a 60 grados centígrados durante 1 hora para derretir la parafina.Siga el procedimiento de tinción como se indica en el manuscrito. Comience con la rehidratación del tejido y luego se tiñe con hematoxilina seguida de eosina. Ahora, deshidrate el tejido y agregue medio de montaje en las secciones.Coloque el resbalón de la cubierta en las secciones y visualice bajo el microscopio de luz. Para realizar el ensayo de ruptura de la barrera sangre-retina, anestesiar a la rata con ketamina y xilazina y confirmar el estado anestésico mediante pellizco en el dedo del pie. Localice el corazón e inserte una jeringa de 1 ml con aguja calibre 24 para extraer la sangre por punción cardíaca.Una vez que se haya recolectado la sangre suficiente, transfiérala a un tubo recubierto de EDTA. Mézclelo suavemente para prevenir la hemólisis. Enucle el ojo e inmediatamente transfiéralo al hielo seco.En condiciones de congelación, comience la disección del ojo mediante la extirpación de la córnea y el cristalino. Extraiga el vítreo del segmento posterior del ojo usando fórceps sin ninguna contaminación de la retina. Transfiéralo a un tubo homogeneizador con tres o cuatro cuentas.Homogeneizar las muestras utilizando homogeneizador de perlas a velocidad media durante 10 segundos. Transfiera muestras de sangre y humor vítreo a tubos de microcentrífuga para procesar aún más. Centrifuga ambas muestras a 5, 200 g durante 10 minutos a 4 grados centígrados.Usando una pipeta multicanal, agregue 250 microlitros de reactivo Bradford en los pozos. Diluya las muestras vítreas 10 veces y las muestras de plasma 20 veces usando PBS. Agregue 5 microlitros de muestras diluidas al reactivo Bradford y mezcle bien.Incubar las muestras durante 20 a 30 minutos, y luego medir la absorbancia a 590 nanómetros utilizando un lector de placas de 96 pocillos. La intensidad de la muestra es directamente proporcional a la concentración de proteína. Para realizar la angiografía por fluorescencia, anestesiar a la rata con 3% de isoflurano y confirmar el estado anestésico mediante punción en el dedo del pie.Sumerja la cola en agua tibia antes de inyectar el tinte. Inyecte 1 ml de 50 mg por ml de solución de FITC-dextrano en la vena lateral de la cola. Deje que el tinte circule durante 5 a 10 minutos.Sacrificar a la rata usando pentobarbital y confirmar su muerte por latidos cardíacos no detectables. Enucle el ojo y proceda a la preparación de montaje plano. Para preparar la montura plana de la retina, coloque el ojo sobre un Kimwipe sin fibra y corte la parte anterior del ojo.Tire lentamente de la lente, junto con el humor vítreo, del segmento posterior del ojo. Transfiera el segmento posterior a una placa de Petri llena de PBS y corte el nervio óptico. Ahora, coloque la punta del forceps puntiagudo entre la esclerótica y la retina.Muévalo suavemente a lo largo del borde de la copa para asegurarse de que la retina no esté unida a la esclerótica en ningún momento. Corte cerca del disco óptico, de modo que la retina se desprenda completamente de la esclerótica. Una vez que se confirme que la retina no está unida a la esclerótica en ningún lado, empuje lentamente hacia la solución de PBS.Con la ayuda de un forcep, transfiera la retina a un portaobjetos de vidrio limpio sin causarle ningún daño. Usando micro tijera o hoja de bisturí, haga cuatro cortes en la retina, como se muestra, para dividirla en cuatro cuadrantes. Elimine el exceso de PBS del entorno retiniano y agregue un medio de montaje antidesvanecimiento en el soporte plano retinal.Cúbralo con un coverslip y visualice el montaje plano bajo microscopio confocal. Es importante tener en cuenta aquí que todo el proceso de angiografía por fluorescencia se realiza bajo una luz mínima para evitar el enfriamiento de la fluorescencia del tinte FITC-dextrano. En la rata diabética, las células de la retina sufren degeneración, lo que conduce a complicaciones adicionales.Estas alteraciones estructurales pueden visualizarse mediante técnica histología para determinar el número celular y el grosor de la retina. En el caso de las ratas diabéticas, el grosor de las capas de la retina aumenta debido al edema. Por lo tanto, esta técnica ayuda a detectar varios agentes farmacológicos potenciales para tratar la retinopatía diabética.Los cambios metabólicos en la retina debido a la diabetes causan pérdida de pericitos y ruptura de la barrera sangre-retina. A medida que hay fuga de proteínas y otras biomoléculas en la retina y el vítreo, los niveles de proteína total aumentan en el vítreo de las ratas diabéticas. La prevención de la ruptura de la barrera sangre-retina podría obstaculizar significativamente el progreso de la retinopatía diabética.En la retinopatía diabética, la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular aumenta que conduce a la formación de nuevos vasos. Estos vasos alteran la estructura normal de la retina y, por lo tanto, su inervación es de interés primordial para tratar la retinopatía diabética. La técnica de angiografía por fluorescencia se utiliza para visualizar nuevos vasos sanguíneos y también fugas de vasos sanguíneos, como se destaca aquí.Sin embargo, la angiogénesis es prominente solo después de seis a 12 meses de inducción de la diabetes. Esta técnica nos ayuda a cuantificar el efecto del tratamiento farmacológico sobre la inervación de la angiogénesis y la fuga vascular. El tratamiento futuro de la retinopatía diabética necesita agentes farmacológicos más eficientes, pero los tratamientos futuros solo se pueden lograr a través de una mejor comprensión de la patogénesis de la enfermedad.Dominar estas técnicas podría ayudar a los investigadores a tener una mejor comprensión sobre la patogénesis de la retinopatía diabética, lo que podría conducir a un descubrimiento de mejores intervenciones farmacológicas.

Research

JoVE Journal

Medicine

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