Name: retinal pathophysiological evaluation in a rat model
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Författare vill erkänna Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) för finansieringsstöd till Dr. Nirmal J. Vi vill också tacka University Grant of Commission för att ge Junior Research Fellowship till Manisha Malani och Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus för att tillhandahålla infrastrukturell anläggning.

Detta protokoll följer alla riktlinjer för djurvård som tillhandahålls av Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad campus.
1. Retinal histologi
<ol><li>Enukleation och fixering av ögat<ol>
<li>Avliva en 2 till 3 månader gammal diabetisk Wistar-hanråtta tillsammans med den åldersmatchade kontrollen (14 till 15 veckor gammal) med en hög dos pentobarbital (150 mg/kg) injicerad via intraperitoneal väg. Inga detekterbara hjärtslag bekräftar dödsf...

<ol>
	<li>Jonas, J. B., Sabanayagam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+risk+factors+for+diabetic+retinopathy.">Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy.</a> Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).</li><li>Pandova, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Visual Impairment and Blindness. , (2019).</li><li>Mokdad, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+national,+and+subnational+big+data+to+inform+health+equity+research:+perspectives+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Ethnicity &amp; Disease. 29, 159-172 (2019).</li><li>Barber, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+apoptosis+in+the+retina+during+experimental+and+human+diabetes.+Early+onset+and+effect+of+insulin.">Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin.</a> The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).</li><li>El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+apoptosis+markers+in+the+retinas+of+human+subjects+with+diabetes.">Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).</li><li>Schr&#246;der, S., Palinski, W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+monocytes+and+granulocytes,+capillary+nonperfusion,+and+neovascularization+in+diabetic+retinopathy.">Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy.</a> The American Journal of Pathology. 139 (1), 81 (1991).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukostasis+and+vascular+leakage+in+streptozotocin-induced+diabetic+retinopathy+via+intercellular+adhesion+molecule-1+inhibition.">Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).</li><li>Bhanushali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+retinal+microvasculature+features+with+severity+of+diabetic+retinopathy+using+optical+coherence+tomography+angiography.">Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).</li><li>Wang, W., Lo, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+retinopathy:+pathophysiology+and+treatments.">Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816 (2018).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diabetes+by+streptozotocin+in+rats.">Induction of diabetes by streptozotocin in rats.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).</li><li>Weiss, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptozocin:+a+review+of+its+pharmacology,+efficacy,+and+toxicity.">Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity.</a> Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).</li><li>Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+fate+and+elimination+of+streptozotocin.">The metabolic fate and elimination of streptozotocin.</a> Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , (1968).</li><li>Okunlola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+studies+on+the+retina+and+cerebellum+of+Wistar+rats+treated+with+Arteether.">Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether.</a> Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).</li><li>Wallow, I., Engerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+patency+of+retinal+blood+vessels+in+experimental+diabetes.">Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).</li><li>do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proen&#231;a, R., Cunha-Vaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+the+inner+and+outer+blood+retinal+barrier+in+streptozotocin-induced+diabetes.">Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes.</a> Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).</li><li>Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+levels+in+the+vitreous+of+rats+with+streptozotocin-induced+diabetes+mellitus.">Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus.</a> Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).</li><li>D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Gupta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+angiography+refresher+course:+Here's+how+to+interpret+the+findings+of+this+useful+diagnostic+tool.">Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool.</a> Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).</li><li>Edelman, J. L., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+image+analysis+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+rat.">Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat.</a> Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).</li><li>Szab&#243;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+evaluation+of+diabetic+neurodegeneration+in+the+retina+of+Zucker+diabetic+fatty+(ZDF)+rats.">Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Tokuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixative+solution+for+retinal+morphology:+a+comparison+with+Davidson's+fixative+and+other+fixation+solutions.">Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).</li><li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , (1968).</li><li>Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evisceration+of+mouse+vitreous+and+retina+for+proteomic+analyses.">Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2795 (2011).</li><li>D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse.">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).</li><li>Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+size+of+retinal+vascular+leakage+determined+by+FITC-dextran+angiography+in+patients+with+posterior+uveitis.">Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis.</a> Eye (Lond). 5, 440-446 (1991).</li></ol>

Histologi Retinal histologi utförs för att visualisera de morfologiska förändringarna av retinala celler och lager. Olika steg, inklusive val av fixeringslösning, fixeringstid, uttorkning och paraffinimpregnering, måste optimeras. Vävnadsstorleken bör inte överstiga 3 mm, eftersom den fixerande penetrationen blir långsam. Den vanliga 4% paraformaldehyd leder till retinalavskiljning även i det friska ögat på grund av lösningens relativt höga osmolaritet jämfört med vattenhaltig humor o...

Diabetisk retinopati (DR) är en av de mest komplexa sekundära komplikationerna av diabetes mellitus. Det är också den främsta orsaken till blindhet som kan förebyggas i befolkningen i arbetsför ålder över hela världen. I en nyligen genomförd metaanalys av 32,4 miljoner blinda människor var 830 000 (2,6%) personer blinda på grund av DR1. Andelen synförlust som tillskrivs diabetes rankades som sjunde år 2015 på 1,06% (0,15-2,38) globalt2,3.
Diabetisk retinopati diagnostiseras av vaskulära abnormiteter i de bakre okulära vävnaderna. Kliniskt är det uppdelat i två steg - Non-Proliferative DR (NPDR) och Proliferative DR (PDR), baserat på vaskulariseringen i näthinnan. Hyperglykemi anses vara den potenta regulatorn för DR eftersom det implicerar flera vägar som är involverade i neurodegeneration4,5, inflammation6,7 och mikrovaskulatur8 i näthinnan. Flera metaboliska komplikationer inducerade på grund av hyperglykemi inkluderar ackumulering av avancerade glykationsslutprodukter (AGEs), polyolväg, hexosaminväg och proteinkinas-C-väg. Dessa vägar är ansvariga för cellproliferation (endotelceller), migration (pericyter) och apoptos (neurala retinala celler, pericyter och endotelceller) baserat på olika stadier av diabetisk retinopati. Dessa metaboliska förändringar kan leda till fysiologiska förändringar såsom näthinneavlossning, förlust av retinala celler, nedbrytning av blod-retinalbarriären (BRB), aneurysmer och angiogenes9.
Streptozotocin (STZ) inducerad typ 1-diabetes är en väletablerad och väl accepterad praxis hos råttor för utvärdering av diabetespatogenes och dess komplikationer. Diabetogena effekter av STZ beror på selektiv förstörelse av bukspottkörtelns öar β-celler10. Som ett resultat kommer djuren att genomgå insulinbrist, hyperglykemi, polydipsi och polyuri, som alla är karakteristiska för human typ 1-diabetes mellitus11. För svår diabetesinduktion administreras STZ med 40-65 mg/kg kroppsvikt intravenöst eller intraperitonealt under vuxen ålder. Efter cirka 72 timmar uppvisar dessa djur blodsockernivåer högre än 250 mg/dl10,12.
För att förstå de fysiologiska förändringarna i näthinnan på grund av neurodegeneration, inflammation och angiogenes bör olika tekniker optimeras i experimentella djurmodeller. Strukturella och funktionella förändringar i retinala celler och retinala kärl kan studeras med olika tekniker såsom histologi, BRB-nedbrytningsanalys och fluorescensangiografi.
Histologi innebär studier av anatomin hos celler, vävnader och organ på mikroskopisk nivå. Det etablerar en korrelation mellan strukturen och funktionen hos celler / vävnad. Flera steg utförs för att visualisera och identifiera de mikroskopiska förändringarna i vävnadsstrukturen och därigenom jämföra friska och sjuka motsvarigheter13. Därför är det viktigt att standardisera varje steg i histologin noggrant. Olika steg som är involverade i retinal histologi är fixering av provet, trimning av provet, uttorkning, rensning, impregnering med paraffin, paraffininbäddning, sektionering och färgning (Hematoxylin och Eosinfärgning)13,14.
I en frisk näthinna styrs transporten av molekyler över näthinnan av BRB, bestående av endotelceller och pericyter på insidan och retinala pigmentepitelceller på utsidan. Inre BRB-endotelceller och pericyter börjar emellertid degenerera under det sjuka tillståndet, och BRB äventyras också15. På grund av denna BRB-nedbrytning läcker många molekyler med låg molekylvikt in i glas- och näthinnevävnad16. När sjukdomen fortskrider läcker också många andra proteinmolekyler (låg och hög molekylvikt) in i glas- och näthinnevävnad på grund av homeostasstörning17. Det leder till olika andra komplikationer och i slutändan makulärt ödem och blindhet. Därför komprometterade KVANTIFIERING av proteinnivåerna i glaskroppen och jämförelse av friska och diabetiska tillståndsåtgärder BRB.
Fluorescensangiografi är en teknik som används för att studera blodcirkulationen i näthinnan och koroid med fluorescerande färgämne. Det används för att visualisera vaskulaturen i näthinnan och koroiden genom att injicera fluoresceinfärgämne via intravenös väg eller hjärtinjektion18. När färgämnet injiceras når det först retinala artärer, följt av retinala vener. Denna cirkulation av färgämne slutförs vanligtvis inom 5 till 10 minuter från injektionen av färgämne19. Det är en viktig teknik för att diagnostisera olika bakre segment okulära sjukdomar, inklusive diabetisk retinopati och koroidal neovaskularisering20. Det hjälper till att upptäcka större och mindre vaskulaturförändringar i normala och sjuka tillstånd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride</td>
			<td>Troikaa Pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Indian Immunologicals Limited</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Zora Pharma</td>
			<td></td>
			<td>Euthanesia agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde</td>
			<td>HiMedia, Avra</td>
			<td>MB059, ASG2529</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Hayman</td>
			<td>F204325</td>
			<td>Dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>MB-180</td>
			<td>Clearing of ethanol or paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM10702</td>
			<td>used for embedding tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC503</td>
			<td>To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.</td>
			<td>65955</td>
			<td>For preparation of 1 % acid alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AS119</td>
			<td>For preparation of eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scotts water</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802900</td>
			<td>Bluing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papanicolaou&#39;s solution 1b Hematoxylin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.09254.0500</td>
			<td>Staining of nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>GRM115</td>
			<td>Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX Mountant media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6522</td>
			<td>Visualization and protection of retinal sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassettes</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>PW1292</td>
			<td>To hold tissue during histology processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GT Sonic</td>
			<td>GT Sonic-D9</td>
			<td>Temperature maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin embedding station</td>
			<td>Myr</td>
			<td>EC 350</td>
			<td>Preparation of paraffin blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.</td>
			<td>YD-335A</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica 818</td>
			<td>Sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Holding paraffin-tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Retinal Barrier breakdown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA coated tubes</td>
			<td>J.K Diagnostics</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Separate plasma from whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization tubes</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115076200-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenization caps</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 115063002-CF</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU: 116914801</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td>Homogenization of vitreous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate - Transparent</td>
			<td>Grenier</td>
			<td>GN655101</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>SpectrMax M4</td>
			<td>Absorbance measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI</td>
			<td>CPR240 Plus</td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Angiography</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO</td>
			<td>FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia</td>
			<td>FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185</td>
			<td>Prepared in-house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshied</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6182</td>
			<td>Anti-fading mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1200</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forcep</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S5-1135</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved micro scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1311</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1387</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissor</td>
			<td>Stephens Instruments</td>
			<td>S7-1015</td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG005</td>
			<td>Flatmount preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>BG014C</td>
			<td>To cover tissue after adding mounting media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td>Visualization of flatmount</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal pathophysiological evaluation in a rat model

En bakre segment ögonsjukdom som diabetisk retinopati förändrar näthinnans fysiologi. Diabetisk retinopati kännetecknas av en retinalavskiljning, nedbrytning av blod-retinalbarriären (BRB) och retinal angiogenes. En in vivo-råttmodell är ett värdefullt experimentellt verktyg för att undersöka förändringarna i näthinnans struktur och funktion. Vi föreslår tre olika experimentella tekniker i råttmodellen för att identifiera morfologiska förändringar av retinala celler, retinal vaskulatur och komprometterad BRB. Retinal histologi används för att studera morfologin hos olika retinala celler. Kvantitativ mätning utförs också genom retinal cellantal och tjockleksmätning av olika retinala lager. En BRB-nedbrytningsanalys används för att bestämma läckaget av extraokulära proteiner från plasma till glasvävnad på grund av nedbrytningen av BRB. Fluorescensangiografi används för att studera angiogenes och läckage av blodkärl genom att visualisera retinal vaskulatur med fitc-dextranfärgämne.

Retinal histologi I den diabetiska näthinnan genomgår retinala celler degenerering. Dessutom ökar tjockleken på retinala skikt på grund av ödem22. Bilderna som erhålls efter hematoxylin- och Eosinfärgning kan användas för cellantal och mätning av tjockleken på olika lager, som visas i figur 2 med hjälp av ImageJ.
Analys av nedbrytning av blod-retinal barriär Eftersom BRB äventyras hos d...

Watch this Scientific Journal Video about Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model at JoVE.com

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Diabetisk retinopati är en av de främsta orsakerna till blindhet. Histologi, blod-retinal barriärnedbrytningsanalys och fluorescensangiografi är värdefulla tekniker för att förstå näthinnans patofysiologi, vilket ytterligare kan förbättra den effektiva läkemedelsscreeningen mot diabetisk retinopati.

Retinal patofysiologisk utvärdering i en råttmodell

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Det övergripande målet med dessa tekniker är att utvärdera retinal patofysiologi i streptozotocininducerad diabetisk retinopati råttmodell. Den diabetiska retinopati är en av de främsta orsakerna till blindhet. Den kontinuerliga sökningen pågår för att upptäcka farmakologiska medel med bättre effekt och längre verkan för att behandla diabetisk retinopati.Processen att upptäcka farmakologiska medel i prekliniska djurmodeller spelar en viktig roll. Dessa djurmodeller hjälper till att förstå de strukturella och funktionella förändringarna i ögats bakre segmentvävnader. Därför kommer vi att demonstrera tre olika tekniker för att studera dessa förändringar i de bakre segmentfrågorna.Vi demonstrerar histologi för att studera morfologiska förändringar av retinala celler i lager, BRB-nedbrytningsanalys för att studera komprometterad BRB genom att kvantifiera läckt protein i glaskroppen från plasma och även fluorescera angiografi för att visualisera retinal vaskulatur med FITC-dextranfärgämne. Avliva råtta med hög dos pentobarbital och bekräfta dess död utan detekterbar hjärtslag. Enukleera ögat genom att göra snitt med ett skalpellblad på ögats nasala och temporala regioner.Skär sedan längs kanterna för att ta bort ögat från orbitaluttaget. Ta bort överflödigt fett som omger ögat och placera det i 5 ml fixativ lösning. Inkubera ögat i fixativ lösning i 24 till 48 timmar.Efter fixering, ta bort ögat från fixeringslösningen och överför till petriskål fylld med 10 ml PBS. Använd mikrotång, håll ögat med optisk nerv och gör ett nick på pars plana med hjälp av mikrosax. Skär genom hela hornhinnans marginal för att separera den främre koppen och den bakre koppen av ögat.Ta bort linsen och skär synnerven. Skär den bakre koppen i två halvor och passera genom synnerven. Överför varje halva till de separata kassetterna.Dehydrera vävnaden genom att gradvis öka koncentrationen av etanol från 50% till 100% etanol. Och slutligen, rensa etanolen med xylen. Impregnera vävnaden med förvärmt paraffin vid 60 grader Celsius för att ersätta xylen i vävnaden.Förbered paraffinblocken med en stålform för att hålla vävnaden och kassetten som bas. Under beredningen av blocket bör den optiska skivdelen av ögat vända mot botten av stålformen. Fyll kassetten med paraffin och överför den till en sval yta.Montera bladet och kassetten på respektive hållare på mikrotom. Använd en mikrotom, trimma överskottet av paraffinvax och skär ett band med fem till sex sektioner med en tjocklek av 5 mikrometer. Överför bandet på ytan av förvärmt vattenbad för att fälla ut bandet.Samla sektionerna på en glasskiva belagd med albumin. Låt rutschkanorna torka över natten vid 37 grader Celsius. För att utföra Hematoxylin och Eosinfärgning, förvärm bilderna vid 60 grader Celsius i 1 timme för att smälta paraffinet.Följ färgningsproceduren enligt manuskriptet. Börja med rehydrering av vävnad och fläck sedan med Hematoxylin följt av Eosin. Torka nu ut vävnaden och lägg till monteringsmedium på sektionerna.Placera täckslipen på sektioner och visualisera under ljusmikroskop. För att utföra blod-retinal barriärnedbrytningsanalys, bedöva råttan med ketamin och xylazin och bekräfta anestesitillståndet med tåklämma. Leta reda på hjärtat och sätt in 1 ml spruta med 24-gauge nål för att dra blodet genom hjärtpunktering.När tillräckligt med blod har samlats in, överför det till EDTA-belagt rör. Blanda det försiktigt för att förhindra hemolys. Enukleera ögat och överför det omedelbart till torris.Under frusna förhållanden, börja dissektionen av ögat genom att ta bort hornhinnan och linsen. Dra glaskroppen från det bakre segmentet av ögat med pincett utan kontaminering från näthinnan. Överför det till homogeniseringsröret med tre till fyra pärlor.Homogenisera proverna med pärlhomogenisator med medelhastighet i 10 sekunder. Överför blod- och glasögonhumorprover till mikrocentrifugrör för att bearbeta vidare. Centrifugera båda proverna vid 5 200 g i 10 minuter vid 4 grader Celsius.Använd en flerkanalig pipett, tillsätt 250 mikroliter Bradford-reagens i brunnar. Späd glasartsprover 10 gånger och plasmaprover 20 gånger med PBS. Tillsätt 5 mikroliter utspädda prover till Bradford-reagenset och blanda väl.Inkubera proverna i 20 till 30 minuter och mät sedan absorbansen vid 590 nanometer med en 96-brunns plattläsare. Provets intensitet är direkt proportionell mot koncentrationen av protein. För att utföra fluorescensangiografi, bedöva råttan med 3% isofluran och bekräfta anestesitillståndet med tåstans.Doppa svansen i varmt vatten innan du injicerar färgämnet. Injicera 1 ml 50 mg per ml FITC-dextran-lösning i lateral svansven. Låt färgämnet cirkulera i 5 till 10 minuter.Avliva råttan med pentobarbital och bekräfta dess död utan detekterbart hjärtslag. Enukleera ögat och fortsätt för platt monteringsberedning. För att förbereda retinal platt fäste, placera ögat på en fiberfri Kimwipe och skär den främre delen av ögat.Dra långsamt linsen, tillsammans med glasögonhumorn, från det bakre segmentet av ögat. Överför det bakre segmentet till petriskål fylld med PBS och skär synnerven. Placera nu spetsen på den spetsiga framcepen mellan sclera och näthinnan.Flytta den försiktigt längs koppens kant för att se till att näthinnan inte är fäst vid sclera när som helst. Klipp nära den optiska skivan, så att näthinnan helt lossnar från sclera. När det har bekräftats att näthinnan inte är fäst vid sclera på någon sida, tryck den långsamt in i PBS-lösningen.Med hjälp av en forcep, överför näthinnan till en ren glasskiva utan att skada den. Använd mikrosax eller skalpellblad, gör fyra snitt på näthinnan, som visas, för att dela den i fyra kvadranter. Ta bort överflödig PBS från retinala omgivningar och lägg till anti-blekande monteringsmedium på retinalens platta fäste.Täck den med en täckglas och visualisera det plana fästet under konfokalmikroskop. Det är viktigt att notera här att hela processen med fluorescensangiografi utförs under minimalt ljus för att undvika släckning av fluorescens från FITC-dextranfärgämne. Hos diabetisk råtta genomgår retinala celler degenerering, vilket leder till ytterligare komplikationer.Dessa strukturella förändringar kan visualiseras med histologiteknik för att bestämma cellnummer och tjocklek på näthinnan. Vid diabetiska råttor ökar tjockleken på retinala skikt på grund av ödem. Därför hjälper denna teknik till att screena olika potentiella farmakologiska medel för att behandla diabetisk retinopati.Metaboliska förändringar i näthinnan på grund av diabetes orsakar förlust av pericyter och nedbrytning av blod-retinal barriär. Eftersom det finns läckage av protein och andra biomolekyler i näthinnan och glaskroppen, ökar nivåerna av totalt protein i glaskroppen hos diabetiska råttor. Att förhindra nedbrytningen av blod-retinal barriär kan avsevärt hämma utvecklingen av diabetisk retinopati.Vid diabetisk retinopati ökar uttrycket av vaskulär endoteltillväxtfaktor som leder till bildandet av nya kärl. Dessa kärl stör den normala retinala strukturen, och därför är dess innervation av största vikt för att behandla diabetisk retinopati. Fluorescensangiografiteknik används för att visualisera nya blodkärl och även läckage av blodkärl, vilket framhävs här.Angiogenes är emellertid framträdande först efter sex till 12 månaders diabetesinduktion. Denna teknik hjälper oss att kvantifiera effekten av läkemedelsbehandling på innervation av angiogenes och vaskulärt läckage. Den framtida behandlingen av diabetisk retinopati behöver effektivare farmakologiska medel, men de framtida behandlingarna kan endast uppnås genom bättre förståelse av sjukdomspatogenesen.Mastering av dessa tekniker kan hjälpa forskare att få en bättre förståelse för patogenes av diabetisk retinopati, vilket kan leda till en upptäckt av bättre farmakologiska ingrepp.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Chronic Nutrient Infusion in the Rat

En modell av kronisk Nutrient Infusion i Rat

Chronic exposure to excessive levels of nutrients is postulated to  affect the function of several organs and tissues and to contribute to the  ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Utvärdering av tumörinfiltrerande Leukocyte Subsets i en subkutan tumör Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus autofluorescens för utvärdering av retinala sjukdomar

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom framkallande ordningen i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Råttmodell och Hela montering Retina Förberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

Utvärdering av cerebral blodflöde Autoregulation hos råtta med Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Standardiserad histomorphometrisk utvärdering av artros i en kirurgisk musmodell

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Syreinducerad retinopatimodell för ischemiska näthinnesjukdomar hos gnagare

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

Akupunktur i en råtta modell av astma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal Pigment Epithelium Transplantation i en icke-mänsklig primatmodell för degenerativa retinala sjukdomar

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Utvärdering av leverglukosproduktion i en polycystisk äggstockssyndrom musmodell

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...