Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

Finansiering: Støttet af: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. og R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) og Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke de officielle synspunkter fra National Institutes of Health eller Sigma Xi.

Alle dyreprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committees ved University of Houston og Baylor College of Medicine. Retningslinjerne skitseret i Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) erklæring om brugen af dyr i syn og oftalmisk forskning blev fulgt ved håndtering og brug af musene.
1. Forberedelse
<ol><li>Fremstilling af fluoresceinopløsning<ol>
<li>Forbered 1% fluoresceinopløsning ved at opløse 10 mg natriumfluorescensalt ...

Formålet med dette metodepapir var at beskrive en protokol til oprettelse af et centralt hornhindeepitelslibesår i musen ved hjælp af en trefin og en stump golfkøllesud. Denne murine model er blevet brugt til at studere hornhindebetændelse og dens bidrag til sårheling. Denne type model kan bruges til at studere hornhindesårhelingsmekanismer under normale fysiologiske forhold og i patologier 17,28,29,41,42.<sup ...

Hornhinden er den gennemsigtige forreste en tredjedel af øjet. Hornhinden tjener flere funktioner, herunder beskyttelse af øjets indre strukturer og dannelse af en strukturel barriere, der beskytter øjet mod infektioner1. Endnu vigtigere er hornhinden kritisk for synet og giver omkring to tredjedele af øjets brydningskraft 2,3. Afgørende for hornhindens rolle i synet er dens gennemsigtighed. På grund af sin ydre position udsættes hornhinden imidlertid for en lang række skader på daglig basis, der kan føre til forstyrrelse af dens barrierefunktion, tab af gennemsigtighed og eventuel blindhed. Tab af hornhindegennemsigtighed er en førende årsag til synshandicap på verdensplan 4,5. Hornhindeafskrabninger er en almindelig årsag til besøg på skadestuen (ER), der tegner sig for halvdelen af de øjenrelaterede tilfælde, der præsenteres på ER6. Over 1 million individer anslås at lide af øjenrelaterede skader årligt i USA7. Effektiv hornhindesårheling som reaktion på disse skader er afgørende for at opretholde hornhindehomeostase og bevare dens gennemsigtighed og brydningsevne. I tilfælde af kompromitteret hornhindesårheling bliver hornhinden sårbar over for infektioner, sårdannelser og ardannelse 8,9. Også den stigende popularitet af brydningsoperationer placerer en unik traumatisk udfordring på hornhinden10. I betragtning af den grundlæggende betydning af hornhindesårheling for bevarelsen af hornhindegennemsigtighed og syn er en bedre forståelse af den normale hornhindesårhelingsproces en forudsætning for at forstå nedsat hornhindesårheling forbundet med infektion og sygdom.
Til det formål er der udviklet flere dyremodeller af hornhindesårheling 11,12,13,14,15. Murine modeller af hornhinde sårheling har vist sig nyttige til at fremme vores forståelse af hornhinde sårheling mekanismer, der opererer under normale fysiologiske forhold. Forskellige typer hornhindesår er blevet anvendt til at studere hornhindesårheling, hver egnet til at undersøge forskellige aspekter af sårhelingsprocessen. De mest almindelige typer sårmodeller, der anvendes i hornhindesårhelingsundersøgelser, er de mekaniske og kemiske sårmodeller. Kemiske hornhindesår, der for det meste involverer skabelsen af alkaliske forbrændinger på hornhinden, er nyttige til at studere hornhindesår, opacificering og neovaskularisering13. Mekaniske hornhindesår involverer debridering (slid) sår og keratektomi sår 14,15,16. En intakt eller brudt hornhindeepitelkældermembran definerer henholdsvis debridering og keratektomi sår. I debrideringssår forbliver epitelkældermembranen intakt, mens i keratektomisår brydes kældermembranen med penetration hovedsagelig ind i den forreste stroma. Debrideringssår er mest nyttige til at studere re-epithelialisering, epitelcelleproliferation, immunrespons og nerveregenerering efter hornhindesår. Keratektomi sår, på den anden side, er mest nyttige til at studere hornhinde ardannelse14,15.
Her beskrives en protokol til oprettelse af et centralt hornhindeepitelslibesår i musen ved hjælp af en trephin og en stump golfkøllesud. Denne enkle hornhindesårhelingsmodel er meget reproducerbar og velpubliceret og bruges nu til at evaluere kompromitteret hornhindesårheling i forbindelse med sygdom17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

Hornhinden er kritisk for synet og tegner sig for omkring to tredjedele af øjets brydningskraft. Afgørende for hornhindens rolle i synet er dens gennemsigtighed. På grund af sin ydre position er hornhinden imidlertid meget modtagelig for en lang række skader, der kan føre til tab af hornhindegennemsigtighed og eventuel blindhed. Effektiv hornhindesårheling som reaktion på disse skader er afgørende for at opretholde hornhindehomeostase og bevarelse af hornhindegennemsigtighed og brydningskapacitet. I tilfælde af kompromitteret hornhindesårheling bliver hornhinden sårbar over for infektioner, sårdannelser og ardannelse. I betragtning af den grundlæggende betydning af hornhindesårheling for bevarelsen af hornhindegennemsigtighed og syn er en bedre forståelse af den normale hornhindesårhelingsproces en forudsætning for at forstå nedsat hornhindesårheling forbundet med infektion og sygdom. Mod dette mål har murine modeller af hornhinde sår vist sig nyttige til at fremme vores forståelse af hornhinden sårheling mekanismer, der opererer under normale fysiologiske forhold. Her beskrives en protokol til oprettelse af en central hornhindeepitelslibning i musen ved hjælp af en trefin og en stump golfkøllesud. I denne model bruges en cirkulær trefin med en diameter på 2 mm, centreret over hornhinden, til at afgrænse sårområdet. Golfkølletud bruges med omhu til at debridere epitelet og skabe et cirkulært sår uden at beskadige hornhindeepitelkældermembranen. Det resulterende inflammatoriske respons fortsætter som en velkaraktericeret kaskade af cellulære og molekylære hændelser, der er kritiske for effektiv sårheling. Denne enkle hornhindesårhelingsmodel er meget reproducerbar og velpubliceret og bruges nu til at evaluere kompromitteret hornhindesårheling i forbindelse med sygdom.

Figur 3 viser en transmissionselektronmikrograf af et hornhindesår skabt med den stumpe golfkøllespeud, hvilket viser, at epitelkældermembranen faktisk er intakt efter skade.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figur 3: Epitelkældermembranen forbliver intakt efter hornhindeslibning. Transmissionselektronmikrograf af et hornhindesår...

Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Her beskrives en protokol til oprettelse af et centralt hornhindeepitelslibesår i musen ved hjælp af en trephin og en stump golfkøllesud. Denne hornhindesårhelingsmodel er meget reproducerbar og bruges nu til at evaluere kompromitteret hornhindesårheling i forbindelse med sygdomme.

En epitelslibningsmodel til undersøgelse af hornhindesårheling

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Denne protokol er vigtig, fordi den er en fremragende model til at studere hornhindebetændelse og dens bidrag til sårheling under normale og patologiske forhold. Den største fordel ved denne teknik er, at den skaber et præcist og reproducerbart epitelsår uden at bryde kældermembranen. Denne model af hornhindesår er ligetil og hurtig at udføre.Prins Akowuah, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Til at begynde med fremstilles en 1% fluoresceinopløsning ved at opløse 10 mg natriumfluorescensalt i en milliliter sterilt saltvand eller PBS. Derefter fremstilles 10 ml ketamin-xylazincocktail til anæstesi ved at blande to milliliter ketamin, en milliliter xylazin og syv milliliter steril PBS.Efter bedøvelse af en 8 til 12 uger gammel C57 sort 6 vildtype mus, vurder dybden af anæstesi ved at vurdere pedalrefleksen efter tåklemme. For at skabe epitelhornhindesåret skal du placere den anæstetiserede mus under et dissektionsmikroskop. Sår kun højre eller venstre øje og oprethold konsistensen med øjet, der bliver såret, når du bevæger dig fra mus til mus.Hold øjet vidt åbent ved at holde øjenlågene med tommelfingeren og pegefingeren. Derefter afgrænses midten af hornhinden ved hjælp af en steril trephin med en diameter på to millimeter og drejer forsigtigt trephinen for at gøre indtryk på hornhinepitelet. Anvend ikke for stort tryk, da dette kan resultere i hornhindeperforering.Dernæst holder den sterile stumpe golfkøllesud i en ca. 45 graders vinkel fra hornhindens overflade, debrideres epitelet ved omhyggelig og kontinuerlig skrabning inden for det afgrænsede område ved hjælp af spud. Anvend ikke overdreven kraft og oprethold hydrering ved hjælp af steril PBS, hvis det er nødvendigt. Til overvågning af sårlukning og reepitelisering pipette 1 til 1,5 mikroliter 1% fluoresceinopløsning på den sårede overflade og billede hornhinden ved hjælp af et digitalt mikroskop med en blå lyskilde.Forestil dig den sårede hornhinde på bestemte tidspunkter efter såring. Tag billeder inden for det første minut af fluoresceinopløsning ud over at undgå spredning af opløsningen til det omgivende epitel, hvilket kan føre til en overvurdering af sårstørrelsen. Dernæst skal du ved hjælp af en billedanalysesoftware spore sårområdet og udtrykke sårområdet på hvert tidspunkt som en procentdel af det oprindelige sårområde ved nul time.En transmissionselektronmikrograf af hornhindesåret viser, at epitelkældermembranen forbliver intakt, selv efter skaden. Hos 8 til 12 uger gamle vildtypemus er sårlukningen fuldstændig 24 timer efter såring. Inflammatorisk reaktion på sår er kendetegnet ved cellebilleddannelse ved limbus.Vist her er den limbale vaskulatur af en usåret hornhinde med ekstravaskulære neutrofiler og den af en såret hornhinde med ekstravaskulære blodplader og neutrofiler 30 timer efter slid. For at kunne reproducere denne protokol skal den samme stamme i hvert museområde anvendes, og sårstørrelsen og dybden skal oprettes som beskrevet.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

En forenklet teknik til at producere et iskæmisk sår model

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Murine Model of Wound Healing

Musemodel af Sårheling

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-burn Injury Model hornhindeneovaskularisering i mus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Multimodal Kvantitativ Phase Imaging med Digital Holografisk Microscopy Præcist Vurderer tarmbetændelse og Epithelial Sårheling

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Oprettelse og Transplantation af et fedtholdigt-afledte stamceller (ASC) ark i en diabetisk sårheling Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Udvikling af en Direct Pulp-capping Model for Vurdering af pulpa Sårheling og Reparative Dentin Formation i mus

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Mikroskopi baseret metoder til vurdering af epitelcelle Migration under In Vitro sårheling

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hornhindens epitel slid med okulær Burr som en Model for hornhinden sårheling

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårheling hornhinde orgel kultur Model for undersøgelser

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Målretning grå Rami Communicantes i selektiv kemiske lumbal Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...