Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

Financiering: Ondersteund door: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., en R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), en Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health, of Sigma Xi.

Alle dierprotocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de Universiteit van Houston en Baylor College of Medicine. De richtlijnen die zijn uiteengezet in de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) over het gebruik van dieren in visie en oogheelkundig onderzoek werden gevolgd bij het hanteren en gebruiken van de muizen.
1. Voorbereiding
<ol><li>Bereiding van fluoresceïne-oplossing<ol>
<li>Bereid 1...

Het doel van dit methodedocument was om een protocol te beschrijven voor het maken van een centrale cornea-epitheliale schuurwond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit muizenmodel is gebruikt om hoornvliesontsteking en de bijdrage ervan aan wondgenezing te bestuderen. Dit type model kan worden gebruikt om hoornvlieswondgenezingsmechanismen te bestuderen onder normale fysiologische omstandigheden en bij pathologieën 17,28,29,41,42.</sup...

Het hoornvlies is het transparante voorste een derde van het oog. Het hoornvlies heeft verschillende functies, waaronder het beschermen van de binnenste structuren van het oog en het vormen van een structurele barrière die het oog beschermt tegen infecties1. Wat nog belangrijker is, het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en levert ongeveer tweederde van de brekingskracht van het oog 2,3. Cruciaal voor de rol van het hoornvlies in het zicht is de transparantie ervan. Vanwege de naar buiten gerichte positie wordt het hoornvlies echter dagelijks blootgesteld aan een breed scala aan verwondingen die kunnen leiden tot verstoring van de barrièrefunctie, verlies van transparantie en uiteindelijke blindheid. Verlies van hoornvliestransparantie is wereldwijd een belangrijke oorzaak van slechtziendheid 4,5. Cornea-schaafwonden zijn een veel voorkomende reden voor bezoeken aan de eerste hulp (ER), goed voor de helft van de ooggerelateerde gevallen die op de ER6 worden gepresenteerd. Meer dan 1 miljoen mensen lijden naar schatting jaarlijks aan ooggerelateerd letsel in de Verenigde Staten7. Efficiënte hoornvlieswondgenezing als reactie op deze verwondingen is cruciaal voor het behoud van corneahomeostase en het behoud van de transparantie en refractieve mogelijkheden. In geval van gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing wordt het hoornvlies kwetsbaar voor infecties, ulceraties en littekens 8,9. Ook de toenemende populariteit van refractieve operaties plaatst een unieke traumatische uitdaging op het hoornvlies10. Gezien het fundamentele belang van cornea wondgenezing voor het behoud van corneatransparantie en visie, is een beter begrip van het normale hoornvlieswondgenezingsproces een voorwaarde voor het begrijpen van verminderde hoornvlieswondgenezing geassocieerd met infectie en ziekte.
Daartoe zijn verschillende diermodellen van hoornvlieswondgenezing ontwikkeld 11,12,13,14,15. Murine-modellen van hoornvlieswondgenezing zijn nuttig gebleken bij het bevorderen van ons begrip van de hoornvlieswondgenezingsmechanismen die onder normale fysiologische omstandigheden werken. Verschillende soorten hoornvlieswonden zijn gebruikt bij het bestuderen van hoornvlieswondgenezing, elk geschikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van het wondgenezingsproces. De meest voorkomende soorten wondmodellen die worden gebruikt in hoornvlieswondgenezingsstudies zijn de mechanische en chemische wondmodellen. Chemische hoornvlieswonden, meestal met betrekking tot het creëren van alkalische brandwonden op het hoornvlies, zijn nuttig voor het bestuderen van hoornvlieszweren, opacificatie en neovascularisatie13. Mechanische hoornvlieswonden omvatten debridement (slijtage) wonden en keratectomiewonden 14,15,16. Een intact of gebroken cornea-epitheelkelkelmembraan definieert respectievelijk debridement- en keratectomiewonden. Bij debridementwonden blijft het epitheliale keldermembraan intact, terwijl bij keratectomiewonden het keldermembraan wordt doorbroken met penetratie meestal in het voorste stroma. Debridementwonden zijn het meest nuttig voor het bestuderen van re-epithelisatie, epitheelcelproliferatie, immuunrespons en zenuwregeneratie na hoornvlieswonden. Keratectomie wonden, aan de andere kant, zijn het meest nuttig voor het bestuderen van cornea littekens14,15.
Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit eenvoudige hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en goed gepubliceerd en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing te evalueren in de context van ziekte17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

Het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en is goed voor ongeveer tweederde van de brekingskracht van het oog. Cruciaal voor de rol van het hoornvlies in het zicht is de transparantie ervan. Vanwege de externe positie is het hoornvlies echter zeer gevoelig voor een breed scala aan verwondingen die kunnen leiden tot het verlies van corneatransparantie en uiteindelijke blindheid. Efficiënte hoornvlieswondgenezing als reactie op deze verwondingen is cruciaal voor het behoud van corneahomeostase en het behoud van corneatransparantie en brekingsvermogen. In geval van gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing wordt het hoornvlies kwetsbaar voor infecties, ulceraties en littekens. Gezien het fundamentele belang van cornea wondgenezing voor het behoud van corneatransparantie en visie, is een beter begrip van het normale hoornvlieswondgenezingsproces een voorwaarde voor het begrijpen van verminderde hoornvlieswondgenezing geassocieerd met infectie en ziekte. In de richting van dit doel zijn murinemodellen van hoornvlieswonden nuttig gebleken bij het bevorderen van ons begrip van de genezingsmechanismen van de hoornvlieswond die onder normale fysiologische omstandigheden werken. Hier wordt een protocol beschreven voor het creëren van een centrale cornea-epitheliale slijtage bij muizen met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. In dit model wordt een cirkelvormige trephine met een diameter van 2 mm, gecentreerd over het hoornvlies, gebruikt om het wondgebied af te bakenen. De golfclubspud wordt met zorg gebruikt om het epitheel te debriden en een cirkelvormige wond te creëren zonder het hoornvliesepitheelkelmembraan te beschadigen. De resulterende ontstekingsreactie verloopt als een goed gekarakteriseerde cascade van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die van cruciaal belang zijn voor efficiënte wondgenezing. Dit eenvoudige hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en goed gepubliceerd en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekte te evalueren.

Figuur 3 toont een transmissie-elektronenmicrograaf van een hoornvlieswond gemaakt met de stompe golfclubspud, waaruit blijkt dat het epitheliale keldermembraan inderdaad intact is na letsel.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figuur 3: Epitheliaal keldermembraan blijft intact na cornea-abrasie. Transmissie-elektronenmicrograaf van een...

Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekten te evalueren.

Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Dit protocol is belangrijk omdat het een uitstekend model is voor het bestuderen van hoornvliesontsteking en de bijdrage ervan aan wondgenezing onder normale en pathologische omstandigheden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nauwkeurige en reproduceerbare epitheliale wond creëert zonder het keldermembraan te doorbreken. Dit model van hoornvlieswonden is eenvoudig en snel uit te voeren.De procedure wordt gedemonstreerd door Prins Akowuah, een promovendus uit mijn laboratorium. Bereid om te beginnen een 1% fluoresceïneoplossing door 10 milligram natriumfluoresceïnezout op te lossen in één milliliter steriele zoutoplossing of PBS. Bereid vervolgens voor anesthesie 10 milliliter van een ketamine-xylazinecocktail door twee milliliter ketamine, één milliliter xylazine en zeven milliliter steriele PBS te mengen.Na het verdoven van een 8 tot 12 weken oude C57 zwarte 6 wild-type muis, evalueert u de diepte van de anesthesie door de pedaalreflex na teenknijpen te beoordelen. Om de epitheliale hoornvlieswond te maken, plaatst u de verdoofde muis onder een dissectiemicroscoop. Wond alleen het rechter- of linkeroog en behoud de consistentie met het oog dat gewond raakt bij het verplaatsen van muis naar muis.Houd het oog wijd open door de oogleden met duim en wijsvinger vast te houden. Vervolgens, met behulp van een steriele trephine met een diameter van twee millimeter, bakent u het midden van het hoornvlies af en draait u voorzichtig de trephine om indruk te maken op het cornea-epitheel. Oefen geen overmatige druk uit, omdat dit kan leiden tot perforatie van het hoornvlies.Houd vervolgens de steriele stompe golfclubspud in een hoek van ongeveer 45 graden ten opzichte van het oppervlak van het hoornvlies en debrideer het epitheel door zorgvuldig en continu te schrapen binnen het afgebakende gebied met behulp van de spud. Oefen geen overmatige kracht uit en handhaaf de hydratatie indien nodig met behulp van steriel PBS. Voor het bewaken van wondsluiting en herepitheel, pipetteer 1 tot 1,5 microliter 1% fluoresceïne-oplossing op het gewonde oppervlak en stel het hoornvlies in beeld met behulp van een digitale microscoop met een blauwe lichtbron.Stel je het gewonde hoornvlies voor op specifieke tijdstippen na de verwonding. Maak foto's binnen de eerste minuut van toevoeging van fluoresceïneoplossing om verspreiding van de oplossing naar het omliggende epitheel te voorkomen, wat kan leiden tot een overschatting van de wondgrootte. Traceer vervolgens met behulp van een beeldanalysesoftware het wondgebied en druk het wondgebied op elk tijdstip uit als een percentage van het oorspronkelijke wondgebied op nul uur.Een transmissie-elektronenmicrograaf van de hoornvlieswond toont aan dat het epitheelkeldermembraan intact blijft, zelfs na de verwonding. Bij 8 tot 12 weken oude wildtype muizen is de wondsluiting 24 uur na verwonding voltooid. Ontstekingsreactie op verwonding wordt gekenmerkt door celbeeldvorming bij de limbus.Hier afgebeeld is de limbale vasculatuur van een niet-afgewikkeld hoornvlies met extra-vasculaire neutrofielen en die van een gewond hoornvlies met extravasculaire bloedplaatjes en neutrofielen 30 uur na slijtage. Om dit protocol met succes te reproduceren, moet dezelfde spanning in elk bereik van de muis worden gebruikt en moet de wondgrootte en -diepte worden gecreëerd zoals beschreven.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

Een vereenvoudigde methode voor het produceren van een ischemische Wound Model

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Murine Model of Wound Healing

Muizenmodel van wondgenezing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Een alkali-brandwonden Model van Cornea Neovascularisatie in de muis

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Multimodaal Quantitative Fase Imaging met de Digitale Holografische Microscopie Beoordeelt Nauwkeurig darmontsteking en epitheliale wondheling

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creatie en transplantatie van een blad van de stamcel adipeus afkomstige (ASC) in een diabetische wondgenezing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Ontwikkeling van een Direct-Pulp aftopping model voor de evaluatie van pulpal wondgenezing en Reparative Dentin Formation in Muizen

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Gericht op grijze Rami Communicantes in selectieve chemische Lumbale Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...