Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
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Financement : Soutenu par : NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. et R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) et Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les points de vue officiels des National Institutes of Health ou de Sigma Xi.

Tous les protocoles pour animaux ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Houston et du Baylor College of Medicine. Les lignes directrices décrites dans la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sur l’utilisation des animaux dans la recherche sur la vision et l’ophtalmologie ont été suivies dans la manipulation et l’utilisation des souris.
1. Préparation<...

Le but de cet article sur les méthodes était de décrire un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé. Ce modèle murin a été utilisé pour étudier l’inflammation de la cornée et sa contribution à la cicatrisation des plaies. Ce type de modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes de cicatrisation des plaies cornéennes dans des conditions physiologiques normales et dans des pat...

La cornée est le tiers antérieur transparent de l’œil. La cornée remplit plusieurs fonctions, notamment la protection des structures internes de l’œil et la formation d’une barrière structurelle qui protège l’œil contre les infections1. Plus important encore, la cornée est essentielle à la vision, fournissant environ les deux tiers du pouvoir réfractif de l’œil 2,3. Sa transparence est cruciale pour le rôle de la cornée dans la vision. Cependant, en raison de sa position vers l’extérieur, la cornée est exposée à une grande variété de blessures au quotidien qui peuvent entraîner une perturbation de sa fonction de barrière, une perte de transparence et éventuellement la cécité. La perte de transparence cornéenne est l’une des principales causes de déficience visuelle dans le monde 4,5. Les abrasions cornéennes sont une raison courante des visites à la salle d’urgence , représentant la moitié des cas oculaires présentés à l’urgence6. On estime que plus de 1 million de personnes souffrent de blessures oculaires chaque année aux États-Unis7. Une cicatrisation efficace des plaies cornéennes en réponse à ces blessures est essentielle au maintien de l’homéostasie cornéenne et à la préservation de sa transparence et de ses capacités de réfraction. En cas de cicatrisation compromise de la plaie cornéenne, la cornée devient vulnérable aux infections, aux ulcérations et aux cicatrices 8,9. En outre, la popularité croissante des chirurgies réfractives place un défi traumatique unique sur la cornée10. Compte tenu de l’importance fondamentale de la cicatrisation des plaies cornéennes pour la préservation de la transparence et de la vision cornéennes, une meilleure compréhension du processus normal de cicatrisation des plaies cornéennes est une condition préalable à la compréhension de la cicatrisation altérée des plaies cornéennes associées à une infection et à une maladie.
À cette fin, plusieurs modèles animaux de cicatrisation des plaies cornéennes ont été développés 11,12,13,14,15. Les modèles murins de cicatrisation des plaies cornéennes se sont révélés utiles pour approfondir notre compréhension des mécanismes de cicatrisation des plaies cornéennes opérant dans des conditions physiologiques normales. Différents types de plaies cornéennes ont été utilisés dans l’étude de la cicatrisation des plaies cornéennes, chacune convenant à l’étude de différents aspects du processus de cicatrisation des plaies. Les types de modèles de plaies les plus courants utilisés dans les études sur la cicatrisation des plaies cornéennes sont les modèles de plaies mécaniques et chimiques. Les plaies cornéennes chimiques, impliquant principalement la création de brûlures alcalines sur la cornée, sont utiles pour étudier les ulcères cornéens, l’opacification et la néovascularisation13. Les plaies cornéennes mécaniques impliquent des plaies de débridement (abrasion) et des plaies de kératectomie 14,15,16. Une membrane basale épithéliale cornéenne intacte ou percée définit respectivement le débridement et les plaies de kératectomie. Dans les plaies de débridement, la membrane basale épithéliale reste intacte, tandis que dans les plaies de kératectomie, la membrane basale est percée avec pénétration principalement dans le stroma antérieur. Les plaies de débridement sont les plus utiles pour étudier la réépithélialisation, la prolifération des cellules épithéliales, la réponse immunitaire et la régénération nerveuse après une blessure cornéenne. Les plaies de kératectomie, d’autre part, sont les plus utiles pour étudier les cicatrices cornéennes14,15.
Ici, un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Ce modèle simple de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et bien publié et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies cornéennes compromises dans le contexte de la maladie17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

La cornée est essentielle à la vision, représentant environ les deux tiers du pouvoir réfractif de l’œil. Sa transparence est cruciale pour le rôle de la cornée dans la vision. Cependant, en raison de sa position externe, la cornée est très sensible à une grande variété de blessures pouvant entraîner une perte de transparence cornéenne et éventuellement la cécité. Une cicatrisation efficace des plaies cornéennes en réponse à ces blessures est essentielle au maintien de l’homéostasie cornéenne et à la préservation de la transparence cornéenne et des capacités de réfraction. En cas de cicatrisation compromise des plaies cornéennes, la cornée devient vulnérable aux infections, aux ulcérations et aux cicatrices. Compte tenu de l’importance fondamentale de la cicatrisation des plaies cornéennes pour la préservation de la transparence et de la vision cornéennes, une meilleure compréhension du processus normal de cicatrisation des plaies cornéennes est une condition préalable à la compréhension de la cicatrisation altérée des plaies cornéennes associées à une infection et à une maladie. Pour atteindre cet objectif, les modèles murins de plaies cornéennes se sont avérés utiles pour approfondir notre compréhension des mécanismes de cicatrisation des plaies cornéennes fonctionnant dans des conditions physiologiques normales. Ici, un protocole pour créer une abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Dans ce modèle, une tréphine circulaire de 2 mm de diamètre, centrée sur la cornée, est utilisée pour délimiter la zone de la plaie. Le spud de club de golf est utilisé avec soin pour débrider l’épithélium et créer une plaie circulaire sans endommager la membrane basale épithéliale cornéenne. La réponse inflammatoire qui en résulte se déroule sous la forme d’une cascade bien caractérisée d’événements cellulaires et moléculaires essentiels à une cicatrisation efficace des plaies. Ce modèle simple de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et bien publié et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation compromise des plaies cornéennes dans le contexte de la maladie.

La figure 3 montre une micrographie électronique à transmission d’une plaie cornéenne créée avec le spud émoussé du club de golf, démontrant que la membrane basale épithéliale est en effet intacte après une blessure.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figure 3 : La membrane basale épithéliale reste intacte après abrasion cornéen...

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An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Ici, un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Ce modèle de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies cornéennes compromises dans le contexte de maladies.

Un modèle d’abrasion épithéliale pour étudier la cicatrisation des plaies cornéennes

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Ce protocole est important car il s’agit d’un excellent modèle pour étudier l’inflammation cornéenne et sa contribution à la cicatrisation des plaies dans des conditions normales et pathologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle crée une plaie épithéliale précise et reproductible sans percer la membrane basale. Ce modèle de blessure cornéenne est simple et rapide à réaliser.La démonstration de la procédure sera faite par le prince Akowuah, un doctorant de mon laboratoire. Pour commencer, préparez une solution de fluorescéine à 1% en dissolvant 10 milligrammes de sel de fluorescéine de sodium dans un millilitre de solution saline stérile ou PBS. Ensuite, pour l’anesthésie, préparez 10 millilitres d’un cocktail kétamine-xylazine en mélangeant deux millilitres de kétamine, un millilitre de xylazine et sept millilitres de PBS stérile.Après avoir anesthésié une souris C57 noire 6 de type sauvage âgée de 8 à 12 semaines, évaluez la profondeur de l’anesthésie en évaluant le réflexe de pédale après le pincement des orteils. Pour créer la plaie cornéenne épithéliale, placez la souris anesthésiée sous un microscope à dissection. Ne blessez que l’œil droit ou gauche et maintenez la cohérence avec l’œil blessé lors du passage de la souris à la souris.Gardez l’œil grand ouvert en tenant les paupières avec le pouce et l’index. Ensuite, à l’aide d’une tréphine stérile de deux millimètres de diamètre, délimitez le centre de la cornée et faites doucement virevolter la tréphine pour faire une impression sur l’épithélium cornéen. N’appliquez pas de pression excessive, car cela pourrait entraîner une perforation de la cornée.Ensuite, en tenant le spud stérile du club de golf émoussé à un angle d’environ 45 degrés par rapport à la surface de la cornée, débrider l’épithélium en grattant soigneusement et continuellement dans la zone délimitée à l’aide du spud. N’appliquez pas de force excessive et maintenez l’hydratation en utilisant du PBS stérile si nécessaire. Pour surveiller la fermeture et la réépithélisation des plaies, pipettez 1 à 1,5 microlitre de solution de fluorescéine à 1 % sur la surface blessée et imagez la cornée à l’aide d’un microscope numérique avec une source de lumière bleue.Imaginez la cornée blessée à des moments précis après la blessure. Prenez des images dans la première minute de l’ajout de la solution de fluorescéine pour éviter la propagation de la solution à l’épithélium environnant, ce qui peut entraîner une surestimation de la taille de la plaie. Ensuite, à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, tracez la zone de la plaie et exprimez la zone de la plaie à chaque point temporel en pourcentage de la zone de la plaie d’origine à zéro heure.Une micrographie électronique à transmission de la plaie cornéenne démontre que la membrane basale de l’épithélium reste intacte même après la blessure. Chez les souris de type sauvage âgées de 8 à 12 semaines, la fermeture de la plaie est complète 24 heures après la blessure. La réponse inflammatoire à la plaie est caractérisée par l’imagerie cellulaire au niveau du limbe.On voit ici le vascularisme limbique d’une cornée non enroulée avec des neutrophiles extra-vasculaires, et celui d’une cornée blessée avec des plaquettes extravasculaires et des neutrophiles 30 heures après l’abrasion. Pour reproduire avec succès ce protocole, la même souche dans chaque gamme de souris doit être utilisée, et la taille et la profondeur de la plaie doivent être créées comme décrit.

Research

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Medicine

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