Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

Finanzierung: Gefördert durch: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. und R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) und Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health oder Sigma Xi dar.

Alle Tierprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees an der University of Houston und dem Baylor College of Medicine genehmigt. Die in der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) zur Verwendung von Tieren in der Seh- und Augenforschung dargelegten Richtlinien wurden bei der Handhabung und Verwendung der Mäuse befolgt.
1. Vorbereitung
<ol><li>Herstellung von Fluoresceinlösung<ol>
<li>Bereiten Sie 1% ige Fluoresce...

Der Zweck dieses Methodenpapiers war es, ein Protokoll zur Herstellung einer zentralen Hornhautepithelabriebwunde in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud zu beschreiben. Dieses murine Modell wurde verwendet, um Hornhautentzündungen und ihren Beitrag zur Wundheilung zu untersuchen. Diese Art von Modell kann verwendet werden, um Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen und bei Pathologien 17,28,29,41,42 zu untersuchen.<sup cla...

Die Hornhaut ist das transparente vordere Drittel des Auges. Die Hornhaut erfüllt mehrere Funktionen, einschließlich des Schutzes der inneren Strukturen des Auges und der Bildung einer strukturellen Barriere, die das Auge vor Infektionen schützt1. Noch wichtiger ist, dass die Hornhaut für das Sehen entscheidend ist und etwa zwei Drittel der Brechkraft des Auges liefert 2,3. Entscheidend für die Rolle der Hornhaut im Sehvermögen ist ihre Transparenz. Aufgrund ihrer äußeren Position ist die Hornhaut jedoch täglich einer Vielzahl von Verletzungen ausgesetzt, die zu einer Störung ihrer Barrierefunktion, einem Verlust der Transparenz und schließlich zur Erblindung führen können. Der Verlust der Transparenz der Hornhaut ist weltweit eine der Hauptursachen für Sehstörungen 4,5. Hornhautabschürfungen sind ein häufiger Grund für Besuche in der Notaufnahme (ER) und machen die Hälfte der augenbezogenen Fälle aus, die in der Notaufnahme6 vorgestellt wurden. Es wird geschätzt, dass in den Vereinigten Staaten jährlich über 1 Million Menschen an Augenverletzungen leiden7. Eine effiziente Hornhautwundheilung als Reaktion auf diese Verletzungen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hornhauthomöostase und die Erhaltung ihrer Transparenz und Brechungsfähigkeiten. Bei kompromittierter Hornhautwundheilung wird die Hornhaut anfällig für Infektionen, Ulzerationen und Narbenbildung 8,9. Auch die zunehmende Beliebtheit von refraktiven Operationen stellt eine einzigartige traumatische Herausforderung an die Hornhaut10 dar. Angesichts der grundlegenden Bedeutung der Hornhautwundheilung für die Erhaltung der Transparenz und des Sehvermögens der Hornhaut ist ein besseres Verständnis des normalen Hornhautwundheilungsprozesses eine Voraussetzung für das Verständnis der mit Infektionen und Krankheiten verbundenen beeinträchtigten Hornhautwundheilung.
Zu diesem Zweck wurden mehrere Tiermodelle der Hornhautwundheilung entwickelt 11,12,13,14,15. Murine Modelle der Hornhautwundheilung haben sich als nützlich erwiesen, um unser Verständnis der Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen zu verbessern. Verschiedene Arten von Hornhautwunden wurden bei der Untersuchung der Hornhautwundheilung eingesetzt, die jeweils für die Untersuchung verschiedener Aspekte des Wundheilungsprozesses geeignet sind. Die häufigsten Arten von Wundmodellen, die in Hornhautwundheilungsstudien verwendet werden, sind die mechanischen und chemischen Wundmodelle. Chemische Hornhautwunden, die meist die Entstehung von alkalischen Verbrennungen an der Hornhaut beinhalten, sind nützlich für die Untersuchung von Hornhautgeschwüren, Trübung und Neovaskularisation13. Mechanische Hornhautwunden betreffen Debridement (Abrieb) Wunden und Keratektomiewunden14,15,16. Eine intakte oder gebrochene Hornhautepithel-Basalmembran definiert Debridement- bzw. Keratektomie-Wunden. Bei Debridementwunden bleibt die epitheliale Basalmembran intakt, während bei Keratektomiewunden die Basalmembran mit Penetration meist in das vordere Stroma durchbrochen wird. Debridement-Wunden sind am nützlichsten für die Untersuchung der Re-Epithelisierung, der Epithelzellproliferation, der Immunantwort und der Nervenregeneration nach Hornhautwunden. Keratektomie-Wunden hingegen sind am nützlichsten für die Untersuchung der Hornhautnarben14,15.
Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses einfache Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und gut publiziert und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheit17 zu bewerten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

Die Hornhaut ist entscheidend für das Sehen und macht etwa zwei Drittel der Brechkraft des Auges aus. Entscheidend für die Rolle der Hornhaut im Sehvermögen ist ihre Transparenz. Aufgrund ihrer äußeren Position ist die Hornhaut jedoch sehr anfällig für eine Vielzahl von Verletzungen, die zum Verlust der Hornhauttransparenz und schließlich zur Erblindung führen können. Eine effiziente Hornhautwundheilung als Reaktion auf diese Verletzungen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hornhauthomöostase und die Erhaltung der Hornhauttransparenz und der Brechungsfähigkeiten. Bei kompromittierter Hornhautwundheilung wird die Hornhaut anfällig für Infektionen, Ulzerationen und Narbenbildung. Angesichts der grundlegenden Bedeutung der Hornhautwundheilung für die Erhaltung der Transparenz und des Sehvermögens der Hornhaut ist ein besseres Verständnis des normalen Hornhautwundheilungsprozesses eine Voraussetzung für das Verständnis der mit Infektionen und Krankheiten verbundenen beeinträchtigten Hornhautwundheilung. Um dieses Ziel zu erreichen, haben sich murine Modelle der Hornhautwunde als nützlich erwiesen, um unser Verständnis der Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen zu verbessern. Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung eines zentralen Hornhautepithelabriebs bei der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. In diesem Modell wird ein kreisförmiges Trephin mit einem Durchmesser von 2 mm, zentriert über der Hornhaut, verwendet, um den Wundbereich abzugrenzen. Der Golfschläger-Spud wird mit Vorsicht verwendet, um das Epithel zu debriden und eine kreisförmige Wunde zu erzeugen, ohne die Hornhautepithel-Basalmembran zu beschädigen. Die resultierende Entzündungsreaktion verläuft als eine gut charakterisierte Kaskade von zellulären und molekularen Ereignissen, die für eine effiziente Wundheilung entscheidend sind. Dieses einfache Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und gut veröffentlicht und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Abbildung 3 zeigt eine Transmissionselektronenmikroskopaufnahme einer Hornhautwunde, die mit dem stumpfen Golfschläger-Spud erzeugt wurde und zeigt, dass die epitheliale Basalmembran nach einer Verletzung tatsächlich intakt ist.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Abbildung 3: Die epitheliale Basalmembran bleibt nach dem Hornhautabrieb intakt. ...

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An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Hornhautentzündungen und ihrem Beitrag zur Wundheilung unter normalen und pathologischen Bedingungen ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine präzise und reproduzierbare Epithelwunde erzeugt, ohne die Basalmembran zu durchbrechen. Dieses Modell der Hornhautverwundung ist unkompliziert und schnell durchzuführen.Das Verfahren wird Prinz Akowuah, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Bereiten Sie zunächst eine 1% -Fluoresceinlösung vor, indem Sie 10 Milligramm Natriumfluoresceinsalz in einem Milliliter steriler Kochsalzlösung oder PBS auflösen. Als nächstes bereiten Sie für die Anästhesie 10 Milliliter eines Ketamin-Xylazin-Cocktails vor, indem Sie zwei Milliliter Ketamin, einen Milliliter Xylazin und sieben Milliliter steriles PBS mischen.Nachdem Sie eine 8 bis 12 Wochen alte C57 Black 6 Wildtyp-Maus betäubt haben, bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex nach dem Einklemmen der Zehen beurteilen. Um die Epithelhornhautwunde zu erzeugen, legen Sie die betäubte Maus unter ein Dissektionsmikroskop. Wunden Sie nur das rechte oder linke Auge und halten Sie die Konsistenz mit dem Auge aufrecht, das verwundet wird, wenn Sie sich von Maus zu Maus bewegen.Halten Sie das Auge weit offen, indem Sie die Augenlider mit Daumen und Zeigefinger halten. Markieren Sie dann mit einem sterilen Trephin mit einem Durchmesser von zwei Millimetern das Zentrum der Hornhaut und drehen Sie das Trephin vorsichtig, um einen Eindruck auf das Hornhautepithel zu machen. Üben Sie keinen übermäßigen Druck aus, da dies zu einer Perforation der Hornhaut führen kann.Als nächstes halten Sie den sterilen stumpfen Golfschläger-Spud in einem Winkel von etwa 45 Grad von der Hornhautoberfläche und debriden Sie das Epithel durch sorgfältiges und kontinuierliches Kratzen innerhalb des abgegrenzten Bereichs mit dem Spud. Wenden Sie keine übermäßige Kraft an und halten Sie die Hydratation bei Bedarf mit sterilem PBS aufrecht. Zur Überwachung des Wundverschlusses und der Re-Epithelisierung pipettieren Sie 1 bis 1,5 Mikroliter 1%fluorescein-Lösung auf die verletzte Oberfläche und bilden die Hornhaut mit einem Digitalmikroskop mit einer blauen Lichtquelle ab.Stellen Sie sich die verwundete Hornhaut zu bestimmten Zeiten nach der Verwundung vor. Machen Sie Bilder innerhalb der ersten Minute nach der Zugabe von Fluoresceinlösung, um eine Ausbreitung der Lösung auf das umgebende Epithel zu vermeiden, was zu einer Überschätzung der Wundgröße führen kann. Als nächstes verfolgen Sie mit einer Bildanalysesoftware den Wundbereich und drücken den Wundbereich zu jedem Zeitpunkt als Prozentsatz der ursprünglichen Wundfläche zur Nullstunde aus.Eine transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme der Hornhautwunde zeigt, dass die Epithel-Basalmembran auch nach der Verletzung intakt bleibt. Bei 8 bis 12 Wochen alten Wildtyp-Mäusen ist der Wundverschluss 24 Stunden nach der Verwundung abgeschlossen. Die Entzündungsreaktion auf Wunden ist durch Zellbildgebung am Limbus gekennzeichnet.Hier ist das limbale Gefäßsystem einer unverwundeten Hornhaut mit extravaskulären Neutrophilen und das einer verwundeten Hornhaut mit extravaskulären Blutplättchen und Neutrophilen 30 Stunden nach dem Abrieb gezeigt. Um dieses Protokoll erfolgreich zu reproduzieren, muss in jedem Mausbereich die gleiche Dehnung verwendet werden, und die Wundgröße und -tiefe muss wie beschrieben erzeugt werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

Eine vereinfachte Methode zur Herstellung eines ischämischen Wundmodell

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Forschung

Medizin

Murine Model of Wound Healing

Mausmodell der Wundheilung

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Multimodale Quantitative Phase Imaging mit digitalen holografischen Mikroskopie Beurteilt Exakt Darmentzündung und Epithelial Wundheilung

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Entwicklung eines Direkt Pulp-Kappungsmodell für die Beurteilung von Pulpal Wundheilung und Reparative Dentinbildung bei Mäusen

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Ausrichtung auf graue Rami Communicantes im selektiven chemischen lumbale Sympathektomie

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...