Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

מימון: נתמך על ידי: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., ו- R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), ומענק סיגמא שי בסיוע למחקר (P.K.A.). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות, או סיגמא שי.

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת יוסטון ובמכללת ביילור לרפואה. ההנחיות שפורטו בהצהרת האגודה למחקר בראייה וברפואת עיניים (ARVO) בדבר השימוש בבעלי חיים בראייה ובמחקרי עיניים, בוצעו בטיפול בעכברים ובשימוש בהם.
1. ...

מטרת מאמר השיטות הזה הייתה לתאר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל מורין זה שימש לחקר דלקת הקרנית ותרומתה לריפוי פצעים. סוג זה של מודל יכול לשמש לחקר מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית בתנאים פיזיולוגיים רגילים ובפתולוגיות</sup...

הקרנית היא החלק הקדמי השקוף של שליש מהעין. הקרנית משרתת מספר פונקציות כולל הגנה על המבנים הפנימיים של העין ויצירת מחסום מבני המגן על העין מפני זיהומים1. חשוב מכך, הקרנית חיונית לראייה, ומספקת כשני שלישים מכוח השבירה של העין 2,3. חיוני לתפקיד הקרנית בראייה הוא השקיפות שלה. עם זאת, בשל מיקומה החיצוני, הקרנית חשופה למגוון רחב של פציעות על בסיס יומיומי שעלולות להוביל לשיבוש בתפקוד המחסום שלה, לאובדן שקיפות ולעיוורון בסופו של דבר. אובדן שקיפות הקרנית הוא גורם מוביל ללקוי ראייה ברחבי העולם 4,5. שחיקות קרנית הן סיבה נפוצה לביקורים בחדר המיון (ER), המהווים מחצית מהמקרים הקשורים לעין המוצגים במיון6. על פי הערכות, יותר ממיליון בני אדם סובלים מפציעות הקשורות לעיניים מדי שנה בארצות הברית7. ריפוי יעיל של פצעי הקרנית בתגובה לפציעות אלה הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס של הקרנית ולשימור השקיפות ויכולות השבירה שלו. באירועים של פגיעה בריפוי פצעי הקרנית, הקרנית הופכת פגיעה לזיהומים, כיבים וצלקותשל 8,9. כמו כן, הפופולריות הגוברת של ניתוחי שבירה מציבה אתגר טראומטי ייחודי על הקרנית10. בהתחשב בחשיבות הבסיסית של ריפוי פצעי הקרנית לשמירה על שקיפות וראייה של הקרנית, הבנה טובה יותר של תהליך הריפוי הרגיל של פצע הקרנית היא תנאי מוקדם להבנת ריפוי לקוי של פצעי הקרנית הקשורים לזיהומים ולמחלות.
לשם כך פותחו מספר מודלים של בעלי חיים של ריפוי פצעי הקרנית 11,12,13,14,15. מודלים של מורין של ריפוי פצעי הקרנית הוכיחו את עצמם כיעילים בקידום הבנתנו את מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית הפועלים בתנאים פיזיולוגיים רגילים. סוגים שונים של פצעי הקרנית שימשו בחקר ריפוי פצעי הקרנית, שכל אחד מהם מתאים לחקר היבטים שונים של תהליך ריפוי הפצע. הסוגים הנפוצים ביותר של מודלים של פצעים המשמשים במחקרי ריפוי פצעים בקרנית הם המודלים המכניים והכימיים של פצעים. פצעי קרנית כימיים, הכוללים בעיקר יצירת כוויות אלקליין על הקרנית, שימושיים לחקר כיבים בקרנית, אטימות וניאו-וסקולריזציה13. פצעי קרנית מכניים כוללים פצעי חיטוי (שחיקה) ופצעי כריתת קרטום 14,15,16. קרום מרתף אפיתל שלם או פרוץ של הקרנית מגדיר פצעי כריתה וקרתית דם, בהתאמה. בפצעי חיטוי, קרום מרתף האפיתל נשאר שלם, בעוד שבפצעי כריתת קרטום, קרום המרתף נפרץ עם חדירה בעיקר לתוך הסטרומה הקדמית. פצעי חיטוי הם השימושיים ביותר לחקר אפיתליאליזציה מחדש, התפשטות תאי אפיתל, תגובה חיסונית והתחדשות עצבים בעקבות פציעת הקרנית. פצעי כריתת קרטקומיה, לעומת זאת, שימושיים ביותר לחקר הצטלקות הקרנית14,15.
כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל ריפוי פצעי הקרנית הפשוט הזה ניתן לשחזור רב ופורסם היטב, וכעת הוא משמש להערכת ריפוי פצעי הקרנית שנפגעו בהקשר של מחלה17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

הקרנית קריטית לראייה, ומהווה כשני שלישים מכוח השבירה של העין. חיוני לתפקיד הקרנית בראייה הוא השקיפות שלה. עם זאת, בשל מיקומה החיצוני, הקרנית רגישה מאוד למגוון רחב של פציעות שעלולות להוביל לאובדן שקיפות הקרנית ועיוורון בסופו של דבר. ריפוי יעיל של פצעי הקרנית בתגובה לפציעות אלה הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס של הקרנית ולשימור שקיפות הקרנית ויכולות השבירה. באירועים של פגיעה בריפוי פצעי הקרנית, הקרנית הופכת פגיעה לזיהומים, כיבים והצטלקות. בהתחשב בחשיבות הבסיסית של ריפוי פצעי הקרנית לשמירה על שקיפות וראייה של הקרנית, הבנה טובה יותר של תהליך הריפוי הרגיל של פצע הקרנית היא תנאי מוקדם להבנת ריפוי לקוי של פצעי הקרנית הקשורים לזיהומים ולמחלות. לקראת מטרה זו, מודלים של מורין של פציעת קרנית הוכיחו את עצמם כיעילים לקידום הבנתנו את מנגנוני ריפוי פצעי הקרנית הפועלים בתנאים פיזיולוגיים רגילים. כאן מתואר פרוטוקול ליצירת שחיקה מרכזית של אפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד מועדון גולף קהה. במודל זה, טרפין עגול בקוטר 2 מ"מ, שמרכזו מעל הקרנית, משמש לתיחום אזור הפצע. מועדון הגולף spud משמש בזהירות כדי debride את האפיתל וליצור פצע עגול מבלי לפגוע בקרום מרתף אפיתל הקרנית. התגובה הדלקתית המתקבלת מתרחשת כמפל מאופיין היטב של אירועים תאיים ומולקולריים שהם קריטיים לריפוי פצעים יעיל. מודל פשוט זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ופורסם היטב, וכעת הוא משמש להערכת ריפוי פצעי קרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

איור 3 מראה מיקרוגרף אלקטרוני תמסורת של פצע בקרנית שנוצר עם ספוד מועדון הגולף הקהה, ומדגים כי קרום המרתף האפיתליאלי אכן שלם לאחר פציעה.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> איור 3: קרום מרתף אפיתל נשאר שלם לאחר ?...

Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ומשמש כיום להערכת ריפוי פצעי בקרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מודל מצוין לחקר דלקת הקרנית ותרומתה לריפוי פצעים בתנאים נורמליים ופתולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת פצע אפיתל מדויק וניתן לשחזור מבלי לפרוץ את קרום המרתף. מודל זה של פציעת הקרנית הוא פשוט ומהיר לביצוע.מי שידגים את ההליך יהיה הנסיך אקווה, דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין תמיסת 1% פלואורסציין על ידי המסת 10 מיליגרם של מלח נתרן פלואורסציין במיליליטר אחד של מלח סטרילי או PBS. לאחר מכן, להרדמה, להכין 10 מיליליטרים של קוקטייל קטמין-קסילאזין על ידי ערבוב שני מיליליטרים של קטמין, מיליליטר אחד של קסילאזין, ושבעה מיליליטרים של PBS סטרילי.לאחר הרדמה של עכבר מסוג C57 שחור מסוג 6 פראי בן 8 עד 12 שבועות, הערך את עומק ההרדמה על ידי הערכת רפלקס הדוושה לאחר צביטה בבוהן. כדי ליצור את פצע הקרנית האפיתליאלי, מניחים את העכבר המרומם תחת מיקרוסקופ דיסקציה. פצעו את עין ימין או שמאל בלבד ושמרו על עקביות כשהעין נפצעת בעת מעבר מעכבר לעכבר.שמור על העין פתוחה לרווחה על ידי החזקת העפעפיים עם האגודל והאצבע המורה. לאחר מכן, באמצעות טרפין סטרילי בקוטר שני מילימטרים, תוחמים את מרכז הקרנית ומסובבים בעדינות את הטרפין כדי ליצור רושם על אפיתל הקרנית. אין להפעיל לחץ מוגזם, שכן זה יכול לגרום לניקוב הקרנית.לאחר מכן, כשהוא אוחז במועדון הגולף הסטרילי הבוטה בזווית של כ-45 מעלות מפני השטח של הקרנית, מפרק את האפיתל על ידי גירוד זהיר ומתמשך בתוך האזור המסומן באמצעות ה-spud. אין להפעיל כוח מופרז ולשמור על הידרציה באמצעות PBS סטרילי במידת הצורך. לניטור סגירת הפצע ואפיתליזציה מחדש, פיפטה 1 עד 1.5 מיקרוליטרים של תמיסת פלואורסציין של 1% על פני השטח הפצועים ומצלמת את הקרנית באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי עם מקור אור כחול.דמיינו את הקרנית הפצועה בזמנים מסוימים לאחר הפציעה. צלם תמונות בדקה הראשונה של תוספת תמיסת פלואורסצין כדי למנוע התפשטות של התמיסה לאפיתל שמסביב, מה שעלול להוביל להערכת יתר של גודל הפצע. לאחר מכן, באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, עקבו אחר אזור הפצע וביטאו את אזור הפצע בכל נקודת זמן כאחוז מאזור הפצע המקורי בשעות האפס.מיקרוגרף אלקטרונים של תמסורת של פצע הקרנית מדגים כי קרום מרתף האפיתל נשאר שלם גם לאחר הפציעה. בעכברים מסוג בר בני 8 עד 12 שבועות, סגירת הפצע הושלמה 24 שעות לאחר הפציעה. תגובה דלקתית לפציעה מאופיינת בהדמיית תאים בלימבוס.מוצג כאן כלי הדם הלימביים של קרנית לא מעוותת עם נויטרופילים חוץ-וסקולריים, ושל קרנית פצועה עם טסיות דם ראוותניות וניוטרופילים 30 שעות לאחר שחיקה. כדי לשחזר בהצלחה פרוטוקול זה, יש להשתמש באותו זן בכל טווח של עכבר, וליצור את גודל ועומק הפצע כמתואר.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

טכניקה פשוטה לייצור דגם פצע איסכמי

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Murine Model of Wound Healing

מודל עכברי של ריפוי פצע

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

פגיעה דגם אלקלי לשרוף של הקרנית neovascularization בעכבר

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

בשלב הדמיה כמוני מולטימודליות עם דיגיטלי הולוגרפי מיקרוסקופי מדויקת מעריך דלקת מעיים ו אפיתל ריפוי פצעים

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

יצירת והשתלות של גיליון נגזר שומן בתאי גזע (ASC) במודל של ריפוי פצע סוכרתי

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

פיתוח מודל ישיר מכסת-זול עבור הערכת pulpal ריפוי פצע גיבוש מתקנת הדנטין של עכברים

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

פילוח רמי אפור Communicantes ב Sympathectomy סלקטיבית המותני כימי

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...