Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

Finanziamento: Supportato da: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. e R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) e Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o di Sigma Xi.

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Houston e il Baylor College of Medicine. Le linee guida delineate nella dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) sull'uso degli animali nella visione e nella ricerca oftalmica sono state seguite nella gestione e nell'uso dei topi.
1. Preparazione
<ol><li>Preparazione della soluzione di fluoresceina<o...

Lo scopo di questo documento di metodi era quello di descrivere un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello murino è stato utilizzato per studiare l'infiammazione corneale e il suo contributo alla guarigione delle ferite. Questo tipo di modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi di guarigione delle ferite corneali in condizioni fisiologiche normali e in patologie<...

La cornea è il trasparente anteriore un terzo dell'occhio. La cornea svolge diverse funzioni tra cui la protezione delle strutture interne dell'occhio e la formazione di una barriera strutturale che protegge l'occhio dalle infezioni1. Ancora più importante, la cornea è fondamentale per la visione, fornendo circa i due terzi del potere di rifrazione dell'occhio 2,3. Cruciale per il ruolo della cornea nella visione è la sua trasparenza. Tuttavia, a causa della sua posizione verso l'esterno, la cornea è esposta a un'ampia varietà di lesioni su base giornaliera che possono portare all'interruzione della sua funzione di barriera, perdita di trasparenza ed eventuale cecità. La perdita di trasparenza corneale è una delle principali cause di disabilità visiva in tutto il mondo 4,5. Le abrasioni corneali sono un motivo comune per le visite al pronto soccorso (ER), rappresentando la metà dei casi correlati agli occhi presentati al ER6. Si stima che oltre 1 milione di persone soffrano di lesioni oculari ogni anno negli Stati Uniti7. Un'efficiente guarigione delle ferite corneali in risposta a queste lesioni è fondamentale per mantenere l'omeostasi corneale e preservare la sua trasparenza e le sue capacità di rifrazione. In caso di compromissione della guarigione delle ferite corneali, la cornea diventa vulnerabile a infezioni, ulcerazioni e cicatrici 8,9. Inoltre, la crescente popolarità degli interventi chirurgici refrattivi pone una sfida traumatica unica sulla cornea10. Data l'importanza fondamentale della guarigione delle ferite corneali per la conservazione della trasparenza e della visione corneale, una migliore comprensione del normale processo di guarigione delle ferite corneali è un prerequisito per comprendere la compromissione della guarigione delle ferite corneali associata a infezioni e malattie.
A tal fine, sono stati sviluppati diversi modelli animali di guarigione delle ferite corneali 11,12,13,14,15. I modelli murini di guarigione delle ferite corneali si sono dimostrati utili per promuovere la nostra comprensione dei meccanismi di guarigione delle ferite corneali che operano in normali condizioni fisiologiche. Diversi tipi di ferite corneali sono stati impiegati nello studio della guarigione delle ferite corneali, ognuno adatto per indagare diversi aspetti del processo di guarigione delle ferite. I tipi più comuni di modelli di ferite utilizzati negli studi di guarigione delle ferite corneali sono i modelli di ferite meccaniche e chimiche. Le ferite corneali chimiche, che coinvolgono principalmente la creazione di ustioni alcaline sulla cornea, sono utili per studiare le ulcere corneali, l'opacizzazione e la neovascolarizzazione13. Le ferite corneali meccaniche comportano ferite da debridement (abrasione) e ferite da cheratectomia 14,15,16. Una membrana basale epiteliale corneale intatta o violata definisce rispettivamente le ferite da debridement e cheratectomia. Nelle ferite da debridement, la membrana basale epiteliale rimane intatta, mentre nelle ferite da cheratectomia, la membrana basale viene violata con la penetrazione principalmente nello stroma anteriore. Le ferite da debridement sono più utili per studiare la riepitelizzazione, la proliferazione delle cellule epiteliali, la risposta immunitaria e la rigenerazione nervosa dopo la ferita corneale. Le ferite da cheratectomia, d'altra parte, sono più utili per studiare le cicatrici corneali14,15.
Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo semplice modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e ben pubblicato e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto della malattia17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

La cornea è fondamentale per la visione, rappresentando circa i due terzi del potere rifrattivo dell'occhio. Cruciale per il ruolo della cornea nella visione è la sua trasparenza. Tuttavia, a causa della sua posizione esterna, la cornea è altamente suscettibile a un'ampia varietà di lesioni che possono portare alla perdita di trasparenza corneale e all'eventuale cecità. Un'efficiente guarigione delle ferite corneali in risposta a queste lesioni è fondamentale per mantenere l'omeostasi corneale e la conservazione della trasparenza corneale e delle capacità di rifrazione. In caso di compromissione della guarigione delle ferite corneali, la cornea diventa vulnerabile a infezioni, ulcerazioni e cicatrici. Data l'importanza fondamentale della guarigione delle ferite corneali per la conservazione della trasparenza e della visione corneale, una migliore comprensione del normale processo di guarigione delle ferite corneali è un prerequisito per comprendere la compromissione della guarigione delle ferite corneali associata a infezioni e malattie. Verso questo obiettivo, i modelli murini di ferite corneali si sono dimostrati utili per promuovere la nostra comprensione dei meccanismi di guarigione delle ferite corneali che operano in condizioni fisiologiche normali. Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di un'abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. In questo modello, una trefina circolare di 2 mm di diametro, centrata sulla cornea, viene utilizzata per delimitare l'area della ferita. Lo spud della mazza da golf viene utilizzato con cura per sbrigliare l'epitelio e creare una ferita circolare senza danneggiare la membrana basale epiteliale corneale. La risposta infiammatoria risultante procede come una cascata ben caratterizzata di eventi cellulari e molecolari che sono fondamentali per una guarigione efficiente delle ferite. Questo semplice modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e ben pubblicato e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto della malattia.

La Figura 3 mostra una micrografia elettronica a trasmissione di una ferita corneale creata con lo spud smussato della mazza da golf, dimostrando che la membrana basale epiteliale è effettivamente intatta dopo la lesione.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figura 3: La membrana basale epiteliale rimane intatta dopo l'abrasione corneale. </stron...

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An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto delle malattie.

Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Questo protocollo è significativo perché è un ottimo modello per studiare l'infiammazione corneale e il suo contributo alla guarigione delle ferite in condizioni normali e patologiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che crea una ferita epiteliale precisa e riproducibile senza rompere la membrana basale. Questo modello di ferita corneale è semplice e veloce da eseguire.A dimostrare la procedura sarà il principe Akowuah, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, preparare una soluzione di fluoresceina all'1% sciogliendo 10 milligrammi di sale di fluoresceina di sodio in un millilitro di soluzione salina sterile o PBS. Successivamente, per l'anestesia, preparare 10 millilitri di un cocktail ketamina-xilazina mescolando due millilitri di ketamina, un millilitro di xilazina e sette millilitri di PBS sterile.Dopo aver anestetizzato un topo C57 black 6 wild-type di 8-12 settimane, valuta la profondità dell'anestesia valutando il riflesso del pedale dopo il pizzicamento delle dita dei piedi. Per creare la ferita corneale epiteliale, posizionare il topo anestetizzato sotto un microscopio di dissezione. Ferire solo l'occhio destro o sinistro e mantenere la coerenza con l'occhio ferito quando si passa dal mouse al mouse.Tenere l'occhio spalancato tenendo le palpebre con il pollice e l'indice. Quindi, usando una trefina sterile di due millimetri di diametro, delimitare il centro della cornea e far roteare delicatamente la trefina per fare un'impressione sull'epitelio corneale. Non applicare una pressione eccessiva, in quanto ciò può causare perforazione corneale.Successivamente, tenendo lo spud sterile smussato della mazza da golf con un angolo di circa 45 gradi dalla superficie della cornea, sbrigliare l'epitelio raschiando attentamente e continuamente all'interno dell'area delimitata utilizzando lo spud. Non applicare una forza eccessiva e mantenere l'idratazione utilizzando PBS sterile, se necessario. Per il monitoraggio della chiusura e della riepitelizzazione della ferita, pipettare da 1 a 1,5 microlitri di soluzione di fluoresceina all'1% sulla superficie ferita e visualizzare la cornea utilizzando un microscopio digitale con una sorgente di luce blu.Immagina la cornea ferita in momenti specifici dopo la ferita. Scatta immagini entro il primo minuto di aggiunta di soluzione di fluoresceina per evitare la diffusione della soluzione all'epitelio circostante, che può portare a una sovrastima delle dimensioni della ferita. Successivamente, utilizzando un software di analisi delle immagini, tracciare l'area della ferita ed esprimere l'area della ferita in ogni punto temporale come percentuale dell'area della ferita originale all'ora zero.Una micrografia elettronica a trasmissione della ferita corneale dimostra che la membrana basale dell'epitelio rimane intatta anche dopo la lesione. Nei topi selvatici di 8-12 settimane, la chiusura della ferita è completa 24 ore dopo la ferita. La risposta infiammatoria alla ferita è caratterizzata dall'imaging cellulare al limbus.Qui è mostrata la vascolarizzazione limbare di una cornea non avvolta con neutrofili extra-vascolari e quella di una cornea ferita con piastrine extravascolari e neutrofili 30 ore dopo l'abrasione. Per riprodurre correttamente questo protocollo, è necessario utilizzare lo stesso ceppo in ogni intervallo di mouse e le dimensioni e la profondità della ferita devono essere create come descritto.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

Una tecnica semplificata per produrre un modello di lesione ischemica

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Ricerca

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Modello murino di guarigione delle ferite

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Un Injury Modello alcali-burn di neovascolarizzazione corneale nel mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creazione e il trapianto di un foglio di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) in un modello diabetico di guarigione

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

La microscopia basato su metodi per la valutazione della migrazione delle cellule epiteliali durante In Vitro la guarigione arrotolata

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

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