Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

Støtte: Støttet av: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., og R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) og Sigma Xi Grant i Aid of Research (P.K.A.). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke de offisielle synspunktene til National Institutes of Health, eller Sigma Xi.

Alle dyreprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees ved University of Houston og Baylor College of Medicine. Retningslinjene som er skissert i Arvo-erklæringen (Association for Research in Vision and Ophthalmology) om bruk av dyr i syn og oftalmisk forskning, ble fulgt i håndtering og bruk av musene.
1. Forberedelse
<ol><li>Fremstilling av fluoresceinoppløsning<ol>
<li>Forbered 1% fluoresceinoppløsning ved å oppløse 10 mg natriumfluorescei...

Hensikten med dette metodepapiret var å beskrive en protokoll for å skape et sentralt hornhinnen epitelisk slitasje sår i musen ved hjelp av en trefin og en stump golfklubb spud. Denne murinmodellen har blitt brukt til å studere hornhinnebetennelse og dets bidrag til sårheling. Denne typen modell kan brukes til å studere hornhinnen sår healing mekanismer under normale fysiologiske forhold og i patologier 17,28,29,41,42.<s...

Hornhinnen er den gjennomsiktige fremre en tredjedel av øyet. Hornhinnen tjener flere funksjoner, inkludert å beskytte øyets indre strukturer og danne en strukturell barriere som beskytter øyet mot infeksjoner1. Enda viktigere er at hornhinnen er kritisk for synet, og gir omtrent to tredjedeler av øyets brytningskraft 2,3. Avgjørende for hornhinnens rolle i visjonen er dens gjennomsiktighet. På grunn av sin ytre posisjon er hornhinnen imidlertid utsatt for et bredt spekter av skader på daglig basis som kan føre til forstyrrelse av barrierefunksjonen, tap av gjennomsiktighet og eventuell blindhet. Tap av hornhinnen åpenhet er en ledende årsak til synshemming over hele verden 4,5. Hornhinnens slitasje er en vanlig årsak til besøk på akuttmottaket (ER), som står for halvparten av de øyerelaterte tilfellene som presenteres på ER6. Over 1 million individer anslås å lide av øyerelaterte skader årlig i USA7. Effektiv hornhinnen sår healing som svar på disse skadene er avgjørende for å opprettholde hornhinnen homeostase og bevaring av sin åpenhet og brytning evner. I tilfeller av kompromittert hornhinnen sår healing, hornhinnen blir sårbar for infeksjoner, sårdannelser, ogarrdannelse 8,9. Også den økende populariteten til brytning operasjoner plasserer en unik traumatisk utfordring på hornhinnen10. Gitt den grunnleggende betydningen av hornhinnen sår healing til bevaring av hornhinnen åpenhet og syn, en bedre forståelse av den normale hornhinnen sår healing prosessen er en forutsetning for å forstå svekket hornhinnen sår healing forbundet med infeksjon og sykdom.
For det formål har flere dyremodeller av hornhinnen sårheling blitt utviklet 11,12,13,14,15. Murine modeller av hornhinnen sår healing har vist seg nyttig i å fremme vår forståelse av hornhinnen sår healing mekanismer opererer under normale fysiologiske forhold. Ulike typer hornhinnen sår har vært ansatt i å studere hornhinnen sår healing, hver egnet for å undersøke ulike aspekter av sår healing prosessen. De vanligste typene sårmodeller som brukes i hornhinnen sårhelingsstudier er de mekaniske og kjemiske sårmodellene. Kjemiske hornhinnen sår, for det meste involverer etableringen av alkaliske brannskader på hornhinnen, er nyttige for å studere hornhinnen sår, opacification, og neovascularization13. Mekaniske hornhinnen sår involverer debridement (slitasje) sår og keratectomy sår 14,15,16. En intakt eller brutt hornhinnen epitelial kjellermembran definerer henholdsvis debridement og keratectomy sår. I debridement sår forblir den epiteliale kjellermembranen intakt, mens kjellermembranen i keratektomi sår brytes med penetrasjon for det meste inn i det fremre stromaet. Debridement sår er mest nyttige for å studere re-epitelialisering, epitelcelleproliferasjon, immunrespons og nerveregenerering etter hornhinnen sår. Keratectomy sår, derimot, er mest nyttige for å studere hornhinnenarrdannelse 14,15.
Her beskrives en protokoll for å skape et sentralt hornhinnen epitelisk slitasjesår i musen ved hjelp av en trefin og en stump golfklubb spud. Denne enkle hornhinnen sår healing modellen er svært reproduserbar og godt publisert og blir nå brukt til å evaluere kompromittert hornhinnen sår healing i sammenheng med sykdom17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

Hornhinnen er kritisk for synet, og står for omtrent to tredjedeler av øyets brytningskraft. Avgjørende for hornhinnens rolle i visjonen er dens gjennomsiktighet. På grunn av sin ytre posisjon er hornhinnen imidlertid svært utsatt for et bredt spekter av skader som kan føre til tap av hornhinnens gjennomsiktighet og eventuell blindhet. Effektiv hornhinnen sår healing som svar på disse skadene er avgjørende for å opprettholde hornhinnen homeostase og bevaring av hornhinnen gjennomsiktighet og brytning evner. I tilfeller av kompromittert hornhinnen sår healing, hornhinnen blir sårbar for infeksjoner, sårdannelser, og arrdannelse. Gitt den grunnleggende betydningen av hornhinnen sår healing til bevaring av hornhinnen åpenhet og syn, en bedre forståelse av den normale hornhinnen sår healing prosessen er en forutsetning for å forstå svekket hornhinnen sår healing forbundet med infeksjon og sykdom. Mot dette målet har murine modeller av hornhinnen sår vist seg nyttig for å fremme vår forståelse av hornhinnen sår healing mekanismer som opererer under normale fysiologiske forhold. Her beskrives en protokoll for å skape en sentral hornhinnen epitelal slitasje i musen ved hjelp av en trefin og en stump golfklubb spud. I denne modellen brukes en 2 mm diameter sirkulær trefin, sentrert over hornhinnen, til å avgrense sårområdet. Golfklubben spud brukes med forsiktighet til å debride epitelet og skape et sirkulært sår uten å skade hornhinnen epitelial kjellermembran. Den resulterende inflammatoriske responsen fortsetter som en godt karakterisert kaskade av cellulære og molekylære hendelser som er kritiske for effektiv sårheling. Denne enkle hornhinnen sår healing modellen er svært reproduserbar og godt publisert og blir nå brukt til å evaluere kompromittert hornhinnen sår healing i sammenheng med sykdom.

Figur 3 viser en transmisjonselektronmikrograf av et hornhinnesår opprettet med den stumpe golfklubben spud, som viser at epitelets kjellermembran faktisk er intakt etter skade.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figur 3: Epitelial kjellermembran forblir intakt etter hornhinnens slitasje. Overføring elektronmikrograf av et hornhinnen...

Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Her beskrives en protokoll for å skape et sentralt hornhinnen epitelisk slitasjesår i musen ved hjelp av en trefin og en stump golfklubb spud. Denne hornhinnen sår healing modellen er svært reproduserbar og blir nå brukt til å evaluere kompromittert hornhinnen sår healing i sammenheng med sykdommer.

En epitelal slitasje modell for å studere hornhinnen sår healing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Denne protokollen er viktig fordi det er en utmerket modell for å studere hornhinnebetennelse og dets bidrag til sårheling under normale og patologiske forhold. Den største fordelen med denne teknikken er at den skaper et presist og reproduserbart epitelsår uten å bryte kjellermembranen. Denne modellen av hornhinnen sår er grei og rask å utføre.Å demonstrere prosedyren vil være prins Akowuah, en stipendiat fra laboratoriet mitt. Til å begynne med, lag en 1% fluoresceinoppløsning ved å oppløse 10 milligram natriumfluoresceinsalt i en milliliter steril saltvann eller PBS. Deretter, for anestesi, forberede 10 milliliter av en ketamin-xylazine cocktail ved å blande to milliliter ketamin, en milliliter xylazine og syv milliliter sterile PBS.Etter bedøvelse av en 8-til-12-ukers svart C57 svart 6 wild-type mus, bør du evaluere dybden av anestesi ved å vurdere pedalrefleksen etter tåklemme. For å lage epitelkornsår, plasser den bedøvede musen under et disseksjonsmikroskop. Sår bare høyre eller venstre øye og opprettholde konsistens med øyet blir såret når du beveger deg fra mus til mus.Hold øyet åpent ved å holde øyelokkene med tommelen og pekefingeren. Deretter, ved hjelp av en steril trefin med to millimeter diameter, avgrenser du midten av hornhinnen og snurrer forsiktig trefinen for å gjøre inntrykk på hornhinnen epitel. Ikke bruk for høyt trykk, da dette kan føre til hornhinnen perforering.Deretter holder du den sterile stumpe golfklubben spud i en omtrent 45-graders vinkel fra hornhinnens overflate, debrider epitelet ved forsiktig og kontinuerlig skraping innenfor det avgrensede området ved hjelp av spydet. Ikke bruk overdreven kraft og opprettholde hydrering ved hjelp av steril PBS om nødvendig. For overvåking av sårlukking og re-epitelisering, pipette 1 til 1,5 mikroliter av 1% fluorescein løsning på den sårede overflaten og bilde hornhinnen ved hjelp av et digitalt mikroskop med en blå lyskilde.Bilde den sårede hornhinnen på bestemte tidspunkter etter såring. Ta bilder i løpet av det første minuttet av fluoresceinløsningstillegg for å unngå spredning av løsningen til det omkringliggende epitelet, noe som kan føre til en overestimering av sårstørrelsen. Deretter, ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare, spor sårområdet og uttrykk sårområdet på hvert tidspunkt som en prosentandel av det opprinnelige sårområdet på null timer.En transmisjonselektronmikrograf av hornhinnens sår viser at epitelets kjellermembran forblir intakt selv etter skaden. I 8-til-12 uker gamle villtype mus er sårlukking fullført 24 timer etter såring. Inflammatorisk respons på sår er preget av celleavbildning på limbusen.Vist her er limbal vaskulatur av en unwounded hornhinnen med ekstra-vaskulære nøytrofiler, og at av en såret hornhinne med ekstravaskulære blodplater og nøytrofiler 30 timer etter slitasje. For å reprodusere denne protokollen må den samme belastningen i hvert museområde brukes, og sårstørrelsen og dybden må opprettes som beskrevet.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

En Forenklet teknikk for produksjon av en iskemisk sår modell

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-brenner Injury Modell av Corneal neovaskulariseringen i mus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Multimodal Kvantitativ Phase Imaging med Digital Holografisk Mikros Nøyaktig Vurderer tarmbetennelse og epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Opprettelse og transplantasjon av en liggende under Adipose-avledet stilk cellen (ASC) ark i en diabetiker sårhelende modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Utvikling av en direkte Pulp-capping modell for evaluering av pulpal Wound Healing og reparerende Dentin Dannelse i Mus

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Mikroskopi basert metoder for vurdering av epitelial celle migrasjon ved In Vitro sårheling

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hornhinnen Epithelial slitasje med okulær Burr som modell for hornhinnen sårtilheling

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårtilheling hornhinnen Organ kultur modell for studier

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Målretting grå Rami Communicantes i selektiv kjemiske lumbale Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...