Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

Financiamento: Apoiado por: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., e R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), e Sigma Xi Grant em Aid of Research (P.K.A.). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde, ou Sigma Xi.

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Houston e baylor College of Medicine. As diretrizes descritas na declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) sobre o uso de animais na visão e pesquisa oftalmológica foram seguidas no manuseio e utilização dos camundongos.
1. Preparação
<ol><li>Preparação da solução fluoresceína<ol>
<li>Prepare 1% de solução de...

O objetivo deste artigo de métodos era descrever um protocolo para a criação de uma ferida de abrasão epitelial córnea central no rato usando uma trefina e um taco de golfe sem corte. Este modelo de murina tem sido usado para estudar inflamação córnea e sua contribuição para a cicatrização de feridas. Esse tipo de modelo pode ser usado para estudar mecanismos de cicatrização de feridas córneas em condições fisiológicas normais e em patologias 17,28,29,41,42.<sup class=...

A córnea é o anterior transparente um terço do olho. A córnea serve várias funções, incluindo proteger as estruturas internas do olho e formar uma barreira estrutural que protege o olho contra infecções1. Mais importante, a córnea é fundamental para a visão, fornecendo cerca de dois terços do poder refrativo do olho 2,3. Crucial para o papel da córnea na visão é a sua transparência. No entanto, devido à sua posição externa, a córnea é exposta a uma grande variedade de lesões no dia-a-dia que podem levar à interrupção de sua função de barreira, perda de transparência e eventual cegueira. A perda de transparência da córnea é uma das principais causas de deficiência visual em todo o mundo, 4,5. As abrasões corneais são um motivo comum para as visitas ao pronto-socorro (PS), respondendo por metade dos casos relacionados aos olhos apresentados no PS6. Estima-se que mais de 1 milhão de indivíduos sofra de lesões relacionadas aos olhos anualmente nos Estados Unidos7. A cura eficiente da ferida córnea em resposta a essas lesões é fundamental para manter a homeostase da córnea e a preservação de suas capacidades de transparência e refração. Em eventos de cicatrização comprometida da córnea, a córnea torna-se vulnerável a infecções, ulcerações e cicatrizesde 8,9. Além disso, a crescente popularidade das cirurgias refrativas coloca um desafio traumático único na córnea10. Dada a importância fundamental da cicatrização da ferida córnea para a preservação da transparência e visão da córnea, uma melhor compreensão do processo normal de cicatrização da ferida córnea é um pré-requisito para a compreensão da cicatrização prejudicada da ferida córnea associada à infecção e doença.
Para isso, foram desenvolvidos diversos modelos animais de cicatrização de feridas córneas, 11,12,13,14,15. Modelos de murina de cicatrização de feridas córneas têm se mostrado úteis para promover nossa compreensão dos mecanismos de cura da ferida córnea que operam sob condições fisiológicas normais. Diferentes tipos de feridas córneas têm sido empregados no estudo da cicatrização de feridas córneas, cada uma adequada para investigar diferentes aspectos do processo de cicatrização da ferida. Os modelos de feridas mais comuns usados em estudos de cicatrização de feridas córneas são os modelos mecânicos e químicos de feridas. As feridas córneas químicas, principalmente envolvendo a criação de queimaduras alcalinas na córnea, são úteis para o estudo de úlceras córneas, opificação e neovascularização13. As feridas mecânicas da córnea envolvem ferimentos de desbridamento (abrasão) e ferimentos de ceratectomia 14,15,16. Uma membrana de porão epitelial de córnea intacta ou rompida define feridas de debridamento e ceratectomia, respectivamente. Nas feridas de desbridamento, a membrana do porão epitelial permanece intacta, enquanto nas feridas da querotetomia, a membrana do porão é rompida com penetração principalmente no estroma anterior. As feridas de desbridamento são mais úteis para estudar a re-epitelialização, a proliferação de células epiteliais, a resposta imune e a regeneração nervosa após o ferimento na córnea. As feridas de ceratectomia, por outro lado, são mais úteis para estudar cicatrizes na córnea 14,15.
Aqui, um protocolo para criar uma ferida de abrasão epitelial córnea central no rato usando uma trefina e um taco de golfe sem corte é descrito. Este modelo simples de cura de feridas na córnea é altamente reprodutível e bem publicado e agora está sendo usado para avaliar a cicatrização comprometida da ferida córnea no contexto da doença17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

A córnea é fundamental para a visão, representando cerca de dois terços do poder refrativo do olho. Crucial para o papel da córnea na visão é a sua transparência. No entanto, devido à sua posição externa, a córnea é altamente suscetível a uma grande variedade de lesões que podem levar à perda de transparência corneal e eventual cegueira. A cicatrização eficiente da ferida corneal em resposta a essas lesões é fundamental para a manutenção da homeostase da córnea e preservação da transparência corneal e capacidades de refração. Em eventos de cicatrização comprometida da ferida córnea, a córnea torna-se vulnerável a infecções, ulcerações e cicatrizes. Dada a importância fundamental da cicatrização da ferida córnea para a preservação da transparência e visão da córnea, uma melhor compreensão do processo normal de cicatrização da ferida córnea é um pré-requisito para a compreensão da cicatrização prejudicada da ferida córnea associada à infecção e doença. Em direção a este objetivo, modelos de murina de woundarás córneas têm se mostrado úteis para promover nossa compreensão dos mecanismos de cura da ferida córnea que operam sob condições fisiológicas normais. Aqui, um protocolo para criar uma abrasão epitelial córnea central em rato usando uma trefina e um taco de golfe sem cortes é descrito. Neste modelo, uma trefina circular de 2 mm de diâmetro, centrada sobre a córnea, é usada para demarcar a área da ferida. O taco de golfe spud é usado com cuidado para debridar o epitélio e criar uma ferida circular sem danificar a membrana do porão epitelial da córnea. A resposta inflamatória resultante prossegue como uma cascata bem caracterizada de eventos celulares e moleculares que são críticos para a cicatrização eficiente das feridas. Este modelo simples de cura de feridas na córnea é altamente reprodutível e bem publicado e agora está sendo usado para avaliar a cicatrização comprometida da ferida córnea no contexto da doença.

A Figura 3 mostra um micrografo eletrônico de transmissão de uma ferida córnea criada com o taco de golfe sem corte, demonstrando que a membrana do porão epitelial está de fato intacta após a lesão.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figura 3: A membrana do porão epitelial permanece intacta após a abrasão da córnea. Microgra...

Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Aqui, um protocolo para criar uma ferida de abrasão epitelial córnea central no rato usando uma trefina e um taco de golfe sem corte é descrito. Este modelo de cura de feridas na córnea é altamente reprodutível e agora está sendo usado para avaliar a cicatrização comprometida da ferida córnea no contexto das doenças.

Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Este protocolo é significativo porque é um excelente modelo para estudar a inflamação da córnea e sua contribuição para a cicatrização de feridas em condições normais e patológicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela cria uma ferida epitelial precisa e reprodutível sem romper a membrana do porão. Este modelo de woundamento córnea é simples e rápido de executar.Demonstrando o procedimento estará o Príncipe Akowuah, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para começar, prepare uma solução de 1%fluoresceína dissolvendo 10 miligramas de sal de fluoresceína de sódio em um mililitro de soro fisiológico estéril ou PBS. Em seguida, para anestesia, prepare 10 mililitros de um coquetel de cetamina-xilazina misturando dois mililitros de cetamina, um mililitro de xilazina, e sete mililitros de PBS estéril.Depois de anestesiar um rato C57 preto 6 preto de 8 a 12 semanas, avalie a profundidade da anestesia avaliando o reflexo do pedal após o aperto do dedo do pé. Para criar a ferida córnea epitelial, coloque o rato anestesiado sob um microscópio de dissecção. Fera apenas o olho direito ou esquerdo e mantenha a consistência com o olho sendo ferido ao mover-se de rato para rato.Mantenha os olhos abertos segurando as pálpebras com o polegar e o dedo indicador. Em seguida, usando uma trefina estéril de dois milímetros de diâmetro, demarca o centro da córnea e gire suavemente a trefina para causar uma impressão no epitélio córnea. Não aplique pressão excessiva, pois isso pode resultar em perfuração corneal.Em seguida, segurando o estéril taco de golfe contundente spud em um ângulo de aproximadamente 45 graus da superfície da córnea, debrida o epitélio por raspagem cuidadosa e contínua dentro da área demarcada usando o spud. Não aplique força excessiva e mantenha a hidratação usando PBS estéril, se necessário. Para monitorar o fechamento da ferida e a re-epitelização, pipeta de 1 a 1,5 microlitros de solução de 1%fluoresceína na superfície ferida e imagem da córnea usando um microscópio digital com uma fonte de luz azul.Imagem da córnea ferida em momentos específicos após o ferimento. Tire imagens no primeiro minuto da solução de fluoresceína para evitar a disseminação da solução para o epitélio circundante, o que pode levar a uma superestimação do tamanho da ferida. Em seguida, usando um software de análise de imagem, rastreie a área da ferida e expresse a área da ferida em cada ponto de tempo como uma porcentagem da área original da ferida a zero hora.Um micrografo eletrônico de transmissão da ferida córnea demonstra que a membrana do porão do epitélio permanece intacta mesmo após a lesão. Em camundongos de 8 a 12 semanas de idade, o fechamento da ferida é completo 24 horas após o ferimento. A resposta inflamatória ao ferimento é caracterizada por imagens celulares no limbus.Mostrada aqui é a vasculatura limbal de uma córnea desenrolada com neutrófilos extra-vasculares, e a de uma córnea ferida com plaquetas extravasculares e neutrófilos 30 horas após a abrasão. Para reproduzir com sucesso este protocolo, a mesma cepa em cada gama de mouse deve ser usada, e o tamanho e profundidade da ferida devem ser criados conforme descrito.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

Uma técnica simplificada para a produção de um modelo de ferida isquêmica

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Modelo Murino de Cicatrização

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Um ferimento Modelo Alkali queima de córnea neovascularização no Rato

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Multimodal Quantitative Fase de imagem com o Digital Holographic Microscopia com precisão Avalia Cura inflamação intestinal e epitelial de Feridas

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Criação e transplante de uma folha de células-tronco adiposo-derivado (ASC) em um modelo de cicatrização de feridas diabética

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Desenvolvimento de um Modelo-capeamento pulpar direto para a Avaliação dos pulpar cicatrização de feridas e Formação reparadora dentina em Ratos

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Direcionamento de Rami cinza Communicantes em simpatectomia lombar química seletiva

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...