Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

Financiamiento: Apoyado por: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. y R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), y Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud, o Sigma Xi.

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Houston y Baylor College of Medicine. Las pautas descritas en la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) sobre el uso de animales en la visión y la investigación oftálmica se siguieron en el manejo y uso de los ratones.
1. Preparación
<ol><li>Preparación de la solución de fluoresceína<ol>
<...

El propósito de este artículo de métodos fue describir un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo murino se ha utilizado para estudiar la inflamación corneal y su contribución a la cicatrización de heridas. Este tipo de modelo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de cicatrización de heridas corneales en condiciones fisiológicas normales y en patologías 17,28,29,41,42.</sup...

La córnea es el tercio anterior transparente del ojo. La córnea cumple varias funciones, incluida la protección de las estructuras internas del ojo y la formación de una barrera estructural que protege el ojo contra las infecciones1. Más importante aún, la córnea es crítica para la visión, proporcionando aproximadamente dos tercios del poder refractivo del ojo 2,3. Crucial para el papel de la córnea en la visión es su transparencia. Sin embargo, debido a su posición hacia afuera, la córnea está expuesta a una amplia variedad de lesiones en el día a día que pueden conducir a la interrupción de su función de barrera, pérdida de transparencia y eventual ceguera. La pérdida de transparencia corneal es una de las principales causas de discapacidad visual en todo el mundo 4,5. Las abrasiones corneales son una razón común para las visitas a la sala de emergencias (ER), que representa la mitad de los casos relacionados con los ojos presentados en la ER6. Se estima que más de 1 millón de personas sufren lesiones relacionadas con los ojos anualmente en los Estados Unidos7. La cicatrización eficiente de heridas corneales en respuesta a estas lesiones es fundamental para mantener la homeostasis corneal y preservar su transparencia y capacidades refractivas. En caso de cicatrización comprometida de la herida corneal, la córnea se vuelve vulnerable a infecciones, ulceraciones y cicatrices 8,9. Además, la creciente popularidad de las cirugías refractivas coloca un desafío traumático único en la córnea10. Dada la importancia fundamental de la cicatrización de heridas corneales para la preservación de la transparencia y la visión corneales, una mejor comprensión del proceso normal de curación de heridas corneales es un requisito previo para comprender la cicatrización deficiente de heridas corneales asociadas con infecciones y enfermedades.
Con ese fin, se han desarrollado varios modelos animales de cicatrización de heridas corneales 11,12,13,14,15. Los modelos murinos de curación de heridas corneales han demostrado ser útiles para promover nuestra comprensión de los mecanismos de curación de heridas corneales que operan en condiciones fisiológicas normales. Se han empleado diferentes tipos de heridas corneales en el estudio de la cicatrización de heridas corneales, cada una adecuada para investigar diferentes aspectos del proceso de curación de heridas. Los tipos más comunes de modelos de heridas utilizados en los estudios de cicatrización de heridas corneales son los modelos de heridas mecánicas y químicas. Las heridas corneales químicas, que en su mayoría implican la creación de quemaduras alcalinas en la córnea, son útiles para estudiar las úlceras corneales, la opacificación y la neovascularización13. Las heridas corneales mecánicas implican heridas por desbridamiento (abrasión) y heridas por queratectomía 14,15,16. Una membrana basal epitelial corneal intacta o rota define las heridas de desbridamiento y queratectomía, respectivamente. En las heridas de desbridamiento, la membrana basal epitelial permanece intacta, mientras que en las heridas de queratectomía, la membrana basal se rompe con la penetración principalmente en el estroma anterior. Las heridas de desbridamiento son más útiles para estudiar la reepitelización, la proliferación de células epiteliales, la respuesta inmune y la regeneración nerviosa después de la herida corneal. Las heridas de queratectomía, por otro lado, son más útiles para estudiar la cicatrización corneal14,15.
Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo simple de curación de heridas corneales es altamente reproducible y bien publicado y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de la enfermedad17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

La córnea es crítica para la visión, ya que representa aproximadamente dos tercios del poder refractivo del ojo. Crucial para el papel de la córnea en la visión es su transparencia. Sin embargo, debido a su posición externa, la córnea es altamente susceptible a una amplia variedad de lesiones que pueden conducir a la pérdida de transparencia corneal y eventual ceguera. La cicatrización eficiente de heridas corneales en respuesta a estas lesiones es fundamental para mantener la homeostasis corneal y preservar la transparencia corneal y las capacidades refractivas. En caso de cicatrización comprometida de la herida corneal, la córnea se vuelve vulnerable a infecciones, ulceraciones y cicatrices. Dada la importancia fundamental de la cicatrización de heridas corneales para la preservación de la transparencia y la visión corneales, una mejor comprensión del proceso normal de curación de heridas corneales es un requisito previo para comprender la cicatrización deficiente de heridas corneales asociadas con infecciones y enfermedades. Hacia este objetivo, los modelos murinos de heridas corneales han demostrado ser útiles para promover nuestra comprensión de los mecanismos de curación de heridas corneales que operan en condiciones fisiológicas normales. Aquí, se describe un protocolo para crear una abrasión epitelial corneal central en ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. En este modelo, se utiliza una trefina circular de 2 mm de diámetro, centrada sobre la córnea, para demarcar el área de la herida. El palo de golf se utiliza con cuidado para desbridar el epitelio y crear una herida circular sin dañar la membrana basal epitelial corneal. La respuesta inflamatoria resultante procede como una cascada bien caracterizada de eventos celulares y moleculares que son críticos para la curación eficiente de heridas. Este modelo simple de curación de heridas corneales es altamente reproducible y bien publicado y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de la enfermedad.

La Figura 3 muestra una micrografía electrónica de transmisión de una herida corneal creada con el palo de golf romo spud, demostrando que la membrana basal epitelial está intacta después de la lesión.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figura 3: La membrana basal epitelial permanece intacta después de la abrasión corneal. Micr...

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An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo de cicatrización de heridas corneales es altamente reproducible y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de enfermedades.

Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Este protocolo es significativo porque es un excelente modelo para estudiar la inflamación corneal y su contribución a la cicatrización de heridas en condiciones normales y patológicas. La principal ventaja de esta técnica es que crea una herida epitelial precisa y reproducible sin romper la membrana basal. Este modelo de heridas corneales es sencillo y rápido de realizar.Demostrando el procedimiento estará el Príncipe Akowuah, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, prepare una solución de fluoresceína al 1% disolviendo 10 miligramos de sal de fluoresceína de sodio en un mililitro de solución salina estéril o PBS. A continuación, para la anestesia, prepare 10 mililitros de un cóctel de ketamina-xilazina mezclando dos mililitros de ketamina, un mililitro de xilazina y siete mililitros de PBS estéril.Después de anestesiar a un ratón C57 negro 6 de 8 a 12 semanas de edad, evalúe la profundidad de la anestesia evaluando el reflejo del pedal después del pellizco del dedo del pie. Para crear la herida corneal epitelial, coloque el ratón anestesiado bajo un microscopio de disección. Enrolle solo el ojo derecho o izquierdo y mantenga la consistencia con el ojo herido cuando se mueve del ratón al ratón.Mantenga el ojo bien abierto sosteniendo los párpados con el pulgar y el dedo índice. Luego, usando una trefina estéril de dos milímetros de diámetro, demarque el centro de la córnea y gire suavemente la trefina para causar una impresión en el epitelio corneal. No aplique presión excesiva, ya que esto puede resultar en perforación corneal.A continuación, sosteniendo el palo de golf romo estéril en un ángulo de aproximadamente 45 grados desde la superficie de la córnea, desbridar el epitelio mediante un raspado cuidadoso y continuo dentro del área demarcada utilizando el spud. No aplique fuerza excesiva y mantenga la hidratación usando PBS estéril si es necesario. Para monitorear el cierre de la herida y la reepitelización, pipetee de 1 a 1.5 microlitros de solución de fluoresceína al 1% en la superficie herida y tome imágenes de la córnea con un microscopio digital con una fuente de luz azul.Imagine la córnea herida en momentos específicos después de la herida. Tome imágenes dentro del primer minuto de la adición de solución de fluoresceína para evitar la propagación de la solución al epitelio circundante, lo que puede llevar a una sobreestimación del tamaño de la herida. A continuación, utilizando un software de análisis de imágenes, rastree el área de la herida y exprese el área de la herida en cada punto de tiempo como un porcentaje del área original de la herida a la hora cero.Una micrografía electrónica de transmisión de la herida corneal demuestra que la membrana basal del epitelio permanece intacta incluso después de la lesión. En ratones salvajes de 8 a 12 semanas de edad, el cierre de la herida se completa 24 horas después de la herida. La respuesta inflamatoria a la herida se caracteriza por imágenes celulares en el limbo.Aquí se muestra la vasculatura limbal de una córnea no enrollada con neutrófilos extravasculares, y la de una córnea herida con plaquetas extravasculares y neutrófilos 30 horas después de la abrasión. Para reproducir con éxito este protocolo, se debe usar la misma cepa en cada rango de ratón, y se debe crear el tamaño y la profundidad de la herida como se describe.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

Una técnica simplificada para fabricar un modelo de lesión isquémica

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Investigación

Medicina

Murine Model of Wound Healing

Modelo murino de Curación de Heridas

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Una Lesión álcalis quemar modelo de neovascularización corneal en el ratón

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Multimodal Fase cuantitativa de imágenes con Digital holográfica Microscopía evaluación exacta de la inflamación intestinal Curación de heridas y epitelial

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creación y el transplante de una hoja de células madre derivadas de adiposo (ASC) en un modelo de curación de herida diabética

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Desarrollo de un Modelo de recubrimiento pulpar directo para la Evaluación de la Pulpa Curación de Heridas y formación de dentina reparadora en ratones

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Targeting Communicantes grises del Rami en Sympathectomy Lumbar químico selectivo

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...