Name: an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

Finansiering: Stöds av: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. och R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) och Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte de officiella åsikterna från National Institutes of Health eller Sigma Xi.

Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committees vid University of Houston och Baylor College of Medicine. Riktlinjerna som beskrivs i Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande om användning av djur i syn- och oftalmisk forskning följdes vid hantering och användning av mössen.
1. Förberedelse
<ol><li>Framställning av fluoresceinlösning<ol>
<li>Bered 1% fluoresceinlösning genom att lösa upp 10 mg natriumfluores...

Syftet med detta metodpapper var att beskriva ett protokoll för att skapa ett centralt hornhinneepitelialt nötningssår i musen med hjälp av en trefin och en trubbig golfklubbspud. Denna murina modell har använts för att studera hornhinneinflammation och dess bidrag till sårläkning. Denna typ av modell kan användas för att studera hornhinnans sårläkningsmekanismer under normala fysiologiska förhållanden och i patologier 17,28,29,41,42.<sup...

Hornhinnan är den genomskinliga främre tredjedelen av ögat. Hornhinnan fyller flera funktioner, inklusive att skydda ögats inre strukturer och bilda en strukturell barriär som skyddar ögat mot infektioner1. Ännu viktigare är att hornhinnan är kritisk för synen och ger cirka två tredjedelar av ögats brytningskraft 2,3. Avgörande för hornhinnans roll i synen är dess transparens. På grund av sin yttre position utsätts hornhinnan dock för en mängd olika skador dagligen som kan leda till störningar i dess barriärfunktion, förlust av transparens och eventuell blindhet. Förlust av hornhinnans genomskinlighet är en ledande orsak till synnedsättning över hela världen 4,5. Nötningar i hornhinnan är en vanlig orsak till besök på akuten (ER) och står för hälften av de ögonrelaterade fall som presenteras vid ER6. Över 1 miljon individer beräknas drabbas av ögonrelaterade skador årligen i USA7. Effektiv hornhinnesårläkning som svar på dessa skador är avgörande för att upprätthålla hornhinnans homeostas och bevara dess transparens och brytningsförmåga. I händelse av komprometterad hornhinne sårläkning blir hornhinnan sårbar för infektioner, sår och ärrbildning 8,9. Den ökande populariteten för brytningsoperationer placerar också en unik traumatisk utmaning på hornhinnan10. Med tanke på den grundläggande betydelsen av hornhinnans sårläkning för bevarandet av hornhinnans transparens och syn, är en bättre förståelse av den normala hornhinnans sårläkningsprocess en förutsättning för att förstå nedsatt hornhinnesårläkning i samband med infektion och sjukdom.
För detta ändamål har flera djurmodeller av hornhinnans sårläkning utvecklats 11,12,13,14,15. Murina modeller av hornhinnesårläkning har visat sig vara användbara för att främja vår förståelse av hornhinnans sårläkningsmekanismer som fungerar under normala fysiologiska förhållanden. Olika typer av hornhinnesår har använts för att studera hornhinnans sårläkning, var och en lämplig för att undersöka olika aspekter av sårläkningsprocessen. De vanligaste typerna av sårmodeller som används i hornhinnans sårläkningsstudier är de mekaniska och kemiska sårmodellerna. Kemiska hornhinnesår, som mestadels involverar skapandet av alkaliska brännskador på hornhinnan, är användbara för att studera hornhinnesår, opacifiering och neovaskularisering13. Mekaniska hornhinnesår involverar debrideringssår (nötning) och keratektomi sår 14,15,16. Ett intakt eller brutet hornhinneepitelialt källarmembran definierar debridering respektive keratektomi sår. I debrideringssår förblir epitelialt källarmembran intakt, medan i keratektomi sår bryts källarmembranet med penetration mestadels i den främre stroma. Debrideringssår är mest användbara för att studera reepitelisering, epitelcellsproliferation, immunsvar och nervregenerering efter hornhinnesår. Keratektomi sår, å andra sidan, är mest användbara för att studera hornhinnans ärrbildning14,15.
Här beskrivs ett protokoll för att skapa ett centralt hornhinneepitelialt nötningssår i musen med hjälp av en trefin och en trubbig golfklubbspud. Denna enkla hornhinnesårläkningsmodell är mycket reproducerbar och välpublicerad och används nu för att utvärdera komprometterad hornhinnesårläkning i samband med sjukdom17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD41 antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>553847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G antibody</td>
			<td>BD Bioscience, Pharmingen</td>
			<td>551459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>B14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Toploading Balances (Weighing scale)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>T038181000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golf-club spud</td>
			<td>Stephens instruments</td>
			<td>S2-1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris curve scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-890-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>AM9624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium fluorescein salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade (scapel blade)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>10022-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trephine</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX -100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-295-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11923-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Patterson veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an epithelial abrasion model for studying corneal wound healing

Hornhinnan är kritisk för synen och står för cirka två tredjedelar av ögats brytningskraft. Avgörande för hornhinnans roll i synen är dess transparens. På grund av sin yttre position är hornhinnan emellertid mycket mottaglig för en mängd olika skador som kan leda till förlust av hornhinnans genomskinlighet och eventuell blindhet. Effektiv hornhinnesårläkning som svar på dessa skador är avgörande för att upprätthålla hornhinnans homeostas och bevara hornhinnans transparens och brytningsförmåga. I händelse av komprometterad hornhinne sårläkning blir hornhinnan sårbar för infektioner, sår och ärrbildning. Med tanke på den grundläggande betydelsen av hornhinnans sårläkning för bevarandet av hornhinnans transparens och syn, är en bättre förståelse av den normala hornhinnans sårläkningsprocess en förutsättning för att förstå nedsatt hornhinnesårläkning i samband med infektion och sjukdom. Mot detta mål har murina modeller av hornhinnesår visat sig vara användbara för att främja vår förståelse av hornhinnans sårläkningsmekanismer som fungerar under normala fysiologiska förhållanden. Här beskrivs ett protokoll för att skapa en central hornhinneepitel nötning i mus med hjälp av en trefin och en trubbig golfklubba spud. I denna modell används en cirkulär trefin med en diameter på 2 mm, centrerad över hornhinnan, för att avgränsa sårområdet. Golfklubbspuden används med försiktighet för att debridera epitelet och skapa ett cirkulärt sår utan att skada hornhinnans epiteliala källarmembran. Det resulterande inflammatoriska svaret fortskrider som en väl karakteriserad kaskad av cellulära och molekylära händelser som är avgörande för effektiv sårläkning. Denna enkla hornhinnesårläkningsmodell är mycket reproducerbar och välpublicerad och används nu för att utvärdera komprometterad hornhinnesårläkning i samband med sjukdom.

Figur 3 visar en transmissionselektronmikrograf av ett hornhinnesår skapat med den trubbiga golfklubbspuden, vilket visar att epitelialt källarmembran verkligen är intakt efter skada.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Figur 3: Epitelialt källarmembran förblir intakt efter nötning av hornhinnan. Transmissionselektronmikrograf av ...

Watch this Scientific Journal Video about An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing at JoVE.com

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Här beskrivs ett protokoll för att skapa ett centralt hornhinneepitelialt nötningssår i musen med hjälp av en trefin och en trubbig golfklubbspud. Denna hornhinne sårläkningsmodell är mycket reproducerbar och används nu för att utvärdera komprometterad hornhinne sårläkning i samband med sjukdomar.

En epitelial nötningsmodell för att studera hornhinnans sårläkning

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det är en utmärkt modell för att studera hornhinneinflammation och dess bidrag till sårläkning under normala och patologiska förhållanden. Den största fördelen med denna teknik är att den skapar ett exakt och reproducerbart epitelsår utan att bryta källarmembranet. Denna modell av hornhinnesår är enkel och snabb att utföra.Demonstrerar proceduren kommer att vara Prince Akowuah, en doktorand från mitt laboratorium. Börja med att förbereda en 1% fluoresceinlösning genom att lösa upp 10 milligram natriumfluoresceinsalt i en milliliter steril saltlösning eller PBS. Därefter, för anestesi, förbered 10 ml av en ketamin-xylazincocktail genom att blanda två milliliter ketamin, en milliliter xylazin och sju milliliter steril PBS.Efter att ha sövt en 8 till 12 veckor gammal C57 svart 6 vildmus, utvärdera anestesidjupet genom att bedöma pedalreflexen efter tånypning. För att skapa epitelial hornhinne sår, placera den bedövade musen under ett dissektionsmikroskop. Linda endast höger eller vänster öga och behåll konsistensen med ögat som skadas när du flyttar från mus till mus.Håll ögat vidöppet genom att hålla ögonlocken med tummen och pekfingret. Använd sedan en steril trefin med två millimeter diameter, avgränsa hornhinnans mitt och snurra försiktigt trefinet för att göra intryck på hornhinneepitelet. Applicera inte överdrivet tryck, eftersom detta kan leda till hornhinneperforering.Därefter håller du den sterila trubbiga golfklubbspuden i cirka 45 graders vinkel från hornhinnans yta och debriderar epitelet genom noggrann och kontinuerlig skrapning inom det avgränsade området med hjälp av spuden. Applicera inte överdriven kraft och behåll hydrering med steril PBS om det behövs. För övervakning av sårförslutning och återepitelisering, pipettera 1 till 1,5 mikroliter av 1% fluoresceinlösning på den sårade ytan och avbilda hornhinnan med ett digitalt mikroskop med en blå ljuskälla.Avbilda den sårade hornhinnan vid specifika tidpunkter efter sårning. Ta bilder inom den första minuten av tillsats av fluoresceinlösning för att undvika spridning av lösningen till det omgivande epitelet, vilket kan leda till en överskattning av sårstorleken. Därefter, med hjälp av en bildanalysprogramvara, spåra sårområdet och uttrycka sårområdet vid varje tidpunkt som en procentandel av det ursprungliga sårområdet vid noll timme.En transmissionselektronmikrograf av hornhinnesåret visar att epitelets källarmembran förblir intakt även efter skadan. Hos 8 till 12 veckor gamla vildtypsmöss är sårförslutningen klar 24 timmar efter sårning. Inflammatoriskt svar på sårning kännetecknas av cellavbildning vid limbus.Här visas limbal vaskulaturen hos en okvinnnad hornhinna med extra vaskulära neutrofiler och den hos en sårad hornhinna med extravaskulära blodplättar och neutrofiler 30 timmar efter nötning. För att lyckas reproducera detta protokoll måste samma stam i varje musområde användas, och sårstorleken och djupet måste skapas enligt beskrivningen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

En förenklad teknik för framställning av en ischemisk sårmodell

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Murine Model of Wound Healing

Murinmodell sårläkning

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-bränna Skada Modell av hornhinneneovaskularisering i musen

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

Multimodal Kvantitativ fas Imaging med Digital Holographic Microscopy Bedömer Noggrant tarminflammation och epitelceller sårläkning

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Skapande och Transplantation av en Adipose-derived Stem Cell (ASC) blad i en diabetiker sårläkning modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Utveckling av en direkt Pulp-tak modell för utvärdering av pulpa sårläkning och Reparativ Dentin bildning hos möss

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Mikroskopi datorbaserade metoder för bedömning av epitelial cellmigration under In Vitro sårläkning

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hornhinnans epitel nötning med okulär Burr som modell för hornhinnan sårläkning

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårläkning korneal orgel kultur modell för studier

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Inriktning grå Rami Communicantes i selektiv kemiska ländryggen Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...