Name: flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives
Uploaded: 2021-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives at JoVE.com

We danken het Molecular Imaging Centre en de Flow Cytometry Core Facility aan de Universiteit van Bergen in Noorwegen. Dit werk werd ondersteund door financiering van de Norwegian Research Council (Grant number: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat en de China Scholarship Council (projectnummer: 201906220275).

OPMERKING: Zie de tabel met materialen en de aanvullende tabel S1 voor recepten van alle media en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Differentiatie van menselijke iPSC's in NCS'en, dopaminerge (DA) neuronen en astrocyten
<ol><li>Bereid matrix-gecoate platen voor.<ol><li>Ontdooi een flacon met 5 ml matrix op ijs een nacht. Verdun 1 ml matrix met 99 ml koude Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F...

<ol>
	<li>Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+the+potential+countermeasure.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure.</a> CNS Neuroscience &amp; Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).</li><li>Chen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+riboside+and+metformin+ameliorate+mitophagy+defect+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+with+POLG+mutations.">Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+phenotypes+in+iPSC-derived+neural+stem+cells+with+POLG+mutations.">Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).</li><li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--fusion,+fission,+movement,+and+mitophagy--in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases.</a> Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+key+modulator+in+neurodegenerative+diseases.">Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases.</a> Molecules. 24 (8), 1583 (2019).</li><li>Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interplay+between+cristae+biogenesis,+mitochondrial+dynamics+and+mitochondrial+DNA+integrity.">Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).</li><li>Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Sch&#246;ler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+human+disease+using+stem+cell+models.">Investigating human disease using stem cell models.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).</li><li>Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell+models+of+disease+and+the+prognosis+of+academic+medicine.">Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine.</a> Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation.">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. , 337 (2021).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li><li>Juopperi, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+generated+from+patient+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+features+of+Huntington's+disease+patient+cells.">Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells.</a> Molecular Brain. 5, 17 (2012).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+derived+astrocytes+with+POLG+mutations+and+mitochondrial+dysfunction+including+abnormal+NAD++metabolism+is+toxic+for+neurons.">Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+induced+pluripotent+stem+cells:+induction,+maintenance,+and+differentiation+into+functional+schwann+cells.">Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).</li><li>Hong, Y. J., Do, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+lineage+differentiation+from+pluripotent+stem+cells+to+mimic+human+brain+tissues.">Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).</li><li>Lundin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS-derived+astroglia+from+a+stable+neural+precursor+state+show+improved+functionality+compared+with+conventional+astrocytic+models.">Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation.">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).</li><li>Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+MitoTracker+Green&#8482;+and+CMXrosamine+to+measure+changes+in+mitochondrial+membrane+potentials+in+living+cells+and+tissues.">Efficacy of MitoTracker Green&#8482; and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues.</a> Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).</li><li>Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+mitochondrial+membranes+with+10-nonyl+acridine+orange,+MitoFluor+Green,+and+MitoTracker+Green+is+affected+by+mitochondrial+membrane+potential+altering+drugs.">Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs.</a> Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).</li><li>Buckman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+labeling+in+primary+neuronal+and+astrocytic+cultures:+influence+of+mitochondrial+membrane+potential+and+oxidants.">MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).</li><li>Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-density-dependent+changes+in+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+production+in+human+skin+cells+post+sunlight+exposure.">Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure.</a> Photodermatology, Photoimmunology &amp; Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).</li></ol>

Hierin zijn protocollen voor het genereren van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten en het evalueren van meerdere aspecten van mitochondriale functie met behulp van flowcytometrie. Deze protocollen maken een efficiënte omzetting van menselijke iPSC's in zowel neuronen als glia-astrocyten mogelijk en de gedetailleerde karakterisering van mitochondriale functie, meestal in levende cellen. De protocollen bieden ook een co-staining flowcytometrie-gebaseerde strategie voor het verwerven en analyseren van meerdere mitochondr...

Mitochondriën zijn essentiële organellen die in bijna alle eukaryote cellen aanwezig zijn. Mitochondriën zijn verantwoordelijk voor de energievoorziening door adenosinetrifosfaat (ATP) te produceren via oxidatieve fosforylering en fungeren als metabole intermediairs voor biosynthese en metabolisme. Mitochondriën zijn nauw betrokken bij vele andere belangrijke cellulaire processen, zoals ROS-generatie, celdood en intracellulaire Ca2 + -regulatie. Mitochondriale disfunctie is in verband gebracht met verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Huntington (HD), Friedreich's ataxie (FRDA) en amyotrofische laterale sclerose (ALS)1. Verhoogde mitochondriale disfunctie en mtDNA-afwijking worden ook verondersteld bij te dragen aan de veroudering van de mens 2,3.
Verschillende soorten mitochondriale disfunctie komen voor bij neurodegeneratieve ziekten, en veranderingen in mitochondriaal volume, MMP-depolarisatie, productie van ROS en veranderingen in mtDNA-kopienummer komen vaak voor 4,5,6,7. Daarom is het vermogen om deze en andere mitochondriale functies te meten van groot belang bij het bestuderen van ziektemechanismen en het testen van potentiële therapeutische middelen. Bovendien, gezien het gebrek aan diermodellen die menselijke neurodegeneratieve ziekten getrouw repliceren, is het opzetten van geschikte in vitro modelsystemen die de menselijke ziekte in hersencellen samenvatten een belangrijke stap in de richting van een beter begrip van deze ziekten en de ontwikkeling van nieuwe therapieën 2,3,8,9.
Menselijke iPSC's kunnen worden gebruikt om verschillende hersencellen te genereren, waaronder neuronale en niet-neuronale cellen (d.w.z. gliacellen), en mitochondriale schade geassocieerd met neurodegeneratieve ziekte is gevonden in beide celtypen 3,10,11,12,13. Geschikte methoden voor iPSC-differentiatie in neurale en gliale afstammingslijnen zijn beschikbaar 14,15,16. Deze cellen bieden een uniek platform voor mens/patiënt voor in vitro ziektemodellering en geneesmiddelenscreening. Verder, omdat deze zijn afgeleid van patiënten, bieden iPSC-afgeleide neuronen en gliacellen ziektemodellen die nauwkeuriger weergeven wat er bij mensen gebeurt.
Tot op heden zijn er weinig handige en betrouwbare methoden beschikbaar voor het meten van meerdere mitochondriale functionele parameters in iPSC's, met name levende neuronen en gliacellen. Het gebruik van flowcytometrie biedt de wetenschapper een krachtig hulpmiddel voor het meten van biologische parameters, waaronder mitochondriale functie, in afzonderlijke cellen. Dit protocol biedt details voor het genereren van verschillende soorten hersencellen, waaronder neurale stamcellen (NSC's), neuronen en glia-astrocyten van iPSC's, evenals nieuwe op flowcytometrie gebaseerde benaderingen om meerdere mitochondriale parameters in verschillende celtypen te meten, waaronder iPSC's en iPSC-afgeleide neurale en gliacellen. Het protocol biedt ook een co-kleuringsstrategie voor het gebruik van flowcytometrie om mitochondriaal volume, MMP, mitochondriaal ROS-niveau, MRC-complexen en TFAM te meten. Door metingen van mitochondriaal volume of massa op te nemen, maken deze protocollen ook de meting van zowel het totale niveau als het specifieke niveau per mitochondriale eenheid mogelijk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857, RRID:AB_445175</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287, RRID:AB_778073</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959, RRID:AB_2341193</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Pax6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5790, RRID:AB_305110</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nestin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-23927, RRID:AB_627994</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:50, 20 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFAP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674, RRID:AB_304558</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-S100&#946;&#160; conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196442, RRID:AB_2722596</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75875, RRID:AB_1310786</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tuj 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab78078, RRID:AB_2256751</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32127, RRID:AB_2286949</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD-95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723, RRID:AB_303248</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198308</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use mouse monoclonal IgG2b&#160; Alexa Fluor&#174; 488 as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Cat# sc-17764 RRID:AB_628381</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use mouse monoclonal IgG2a&#160; Alexa Fluor&#174; 488 as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NDUFB10</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196019</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SDHA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137040</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14744, RRID:AB_301443</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use&#160; Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-mouse IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABM Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3187</td>
			<td>Basal medium for astrocyte culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGM SingleQuots Supplement Pack</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td>Supplement for astrocyte culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Basal medium for dilute Geltrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Europa Bioproducts</td>
			<td>EQBAH62-1000</td>
			<td>Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>DA neurons medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11905031</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning non-treated culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430589</td>
			<td>Suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Used for a variety of cell culture wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Astrocyte differentiation basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Basal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516901</td>
			<td>Basal medium for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517101</td>
			<td>Supplement for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic (AA 10&#8211;155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12103C</td>
			<td>Medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td>Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid aspiration system BVC control</td>
			<td>Vacuubrand, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (PFA) 16%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>Used for attachment and maintenance of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>DA neurons medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>Used for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31765027</td>
			<td>Basal medium for CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin beta-1 human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3055</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Stain the nuclei for confocal image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubators</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21980032</td>
			<td>Basal medium for CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1376497</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution AMPK Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>171261</td>
			<td>Neural induction medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like Growth Factor-I human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Basal medium for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Used for mitochondrial volume indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSox Red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Used for mitochondrial ROS indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Neural induction medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>Used for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shakers - SSM1</td>
			<td>Stuart Equipment, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72204</td>
			<td>Promotes DA neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting the coverslip for confocal image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Used for a variety of wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>423-F8-025/CF</td>
			<td>Promotes DA neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>TB1614-GMP</td>
			<td>Neural Induction Medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Neural Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10508-01</td>
			<td>Supplement for NSCs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>652202</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for cells permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113852</td>
			<td>Used for mitochondrial membrane potential staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments</td>
			<td>Grant Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives

Mitochondriën zijn belangrijk in de pathofysiologie van veel neurodegeneratieve ziekten. Veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal (MMP), mitochondriale productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en mitochondriaal DNA (mtDNA) kopienummer zijn vaak kenmerken van deze processen. Dit rapport beschrijft een nieuwe op flowcytometrie gebaseerde benadering om meerdere mitochondriale parameters in verschillende celtypen te meten, waaronder door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en van iPSC afgeleide neurale en gliacellen. Deze op stroom gebaseerde strategie maakt gebruik van levende cellen om mitochondriaal volume, MMP- en ROS-niveaus te meten, evenals vaste cellen om componenten van de mitochondriale ademhalingsketen (MRC) en mtDNA-geassocieerde eiwitten zoals mitochondriale transcriptiefactor A (TFAM) te schatten. 
Door co-kleuring met fluorescerende verslaggevers, waaronder MitoTracker Green (MTG), tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) en MitoSox Red, kunnen veranderingen in mitochondriaal volume, MMP en mitochondriale ROS worden gekwantificeerd en gerelateerd aan mitochondriaal gehalte. Dubbele kleuring met antilichamen tegen MRC-complexe subeenheden en translocase van buitenste mitochondriaal membraan 20 (TOMM20) maakt de beoordeling van MRC-subeenheidexpressie mogelijk. Omdat de hoeveelheid TFAM evenredig is met het mtDNA-kopienummer, geeft de meting van TFAM per TOMM20 een indirecte meting van mtDNA per mitochondriaal volume. Het gehele protocol kan binnen 2-3 uur worden uitgevoerd. Belangrijk is dat deze protocollen de meting van mitochondriale parameters mogelijk maken, zowel op het totale niveau als op het specifieke niveau per mitochondriaal volume, met behulp van flowcytometrie.

Een schematische beschrijving van de differentiatiemethode en flowcytometrische strategieën is weergegeven in figuur 3. Menselijke iPSC's worden gedifferentieerd in neurale rozetten en vervolgens opgetild in suspensiecultuur voor differentiatie in neurale sferen. Neurale bollen worden verder gedifferentieerd en gerijpt tot DA-neuronen. Neurale bollen worden gedissocieerd in afzonderlijke cellen om glia-astrocyten te genereren, opnieuw geplateerd in monolagen als NSC's en vervolgens gediffer...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

Ons protocol biedt de wetenschapper een krachtig hulpmiddel voor het combineren van meerdere microparameters op het niveau van één cel van menselijke IPS en hun neuro- en heldere derivaten. Dit protocol maakt het mogelijk om mitochondriale parameters te verbeteren, zowel op het totale niveau als op het specifieke niveau per mitochondriaal volume, met behulp van flowcytometrie. Deze techniek kan worden toegepast op verschillende celtypen, waaronder die van andere neurodegeneratieve ziekten.Het kan dus helpen inzicht te geven in de mechanismen achter deze ziektetypen en mogelijk ook helpen bij therapeutische screening. Om te beginnen, zaai de cellen afzonderlijk in vier putten in een zes putplaat en incubeer de cellen totdat 50 tot 60% confluentie is bereikt. Bereid aan het einde van de kweekperiode vijf individuele kleuringsoplossingen met verschillende combinaties van kweekmedium, FCCP, TMRE, MTG en mito sokkenspread.Voeg ze toe aan de respectievelijke putten en incubeer de cellen zoals beschreven in het manuscript. Haal vervolgens het medium uit alle putjes en was met PBS. Voor celloslating incubeer je de cellen met één milliliter celdissociatiereagens bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.Neutraliseer het celdissociatiereagens met één milliliter DMEM, aangevuld met 10%FBS. Verzamel vervolgens de putinhoud in een kroniekbuis van 15 milliliter. Pellet de cellen door middel van centrificatie en was de celpellet een of twee keer met PBS.Adem al het supernatant aan, waardoor er ongeveer 100 microliter in de buis achterblijft. Suspensie de celpellets opnieuw in 300 microliter PBS. Nadat u de celsuspensie in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter hebt overgebracht, houdt u de buis bij kamertemperatuur in het donker.Analyseer de cellen met behulp van de flowcytometer met de bandpasfilterinstellingen die in het tekstmanuscript worden beschreven. Maak ongeveer 1 miljoen cellen los met behulp van het celdissociatiereagens en pelleteer de cellen zoals eerder aangetoond. Neutraliseer de celsuspensie met DMEM plus 10% FBS en verzamel de suspensie in een buis van 15 milliliter.Bevestig de cellen met één milliliter van 1,6% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Permeaboliseer de cellen met één milliliter ijskoude 90% methanol bij min 20 graden Celsius gedurende 20 minuten. Blokkeer vervolgens de monsters in één milliliter blokkerende buffer en was de cellen door centrifugatie met PBS, zoals aangetoond.Om verschillende mitochondriale complexen en subeenheden te detecteren, incubeer de cellen gedurende 30 minuten met de respectieve primaire antilichamen die in het tekstmanuscript worden beschreven. Nadat u de cellen eenmaal met PBS hebt gewassen, incubeert u de cellen gedurende 30 minuten met secundaire antilichamen. Aan het einde van de incubatie, was en suspensie de cellen en PBS opnieuw zoals aangetoond.Breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter, in het donker op ijs. Analyseer vervolgens de cellen op de flowcytometer en detecteer signalen en filter er een met behulp van een 5 30/30-banddoorlaatfilter. Selecteer voor elke celsubpopulatie een histogramplot en analyseer de mediane fluorescentie-intensiteit of MFI van de verschillende filterkanalen.Bereken de TMRE-niveaus, specifieke waarden voor MMP ROS complexe subeenheid en TFAM, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Flowcytometrie en levende cellen werden gebruikt om MMP mitochondriaal volume en ROS-niveaus te onderzoeken. In POLG DA-neuronen werd een lager specifiek MMP en een hoger specifiek ROS waargenomen, terwijl er geen veranderingen waren in mitochondriaal volume, totale MMP en ROS.POLG-astrocyten hadden een verminderde MMP, maar geen verandering in mitochondriaal volume en ROS. Flowcytometrie en vaste cellen werden gebruikt om het niveau van MRC-complexe subeenheid en TFAM te onderzoeken. DA-neuronen vertoonden verhoogde complexe één en TFAM versus controle, maar geen verandering in complex twee niveau.POLG astrocyten vertoonden een reductie van complex één vier en specifiek TFAM. Omdat de celdichtheid ook MMP en de relatie tussen MTG- en MMP-fluorescentie kan beïnvloeden, is dit celspecifiek. Aanpassing van dit protocol aan andere celtypen vereist waarschijnlijk optimalisatie Na deze procedure kan microscopische asis, bijvoorbeeld confocale microscopie, worden uitgevoerd, met aanvullende details over mitochondriale structuren.Dus, terwijl deze strategie mitochondriale disfunctie detecteert in DA-neuronen en astrocyten van een bekende mitochondriale ziekte, kunnen deze technieken ook worden toegepast om de mitochondriale functie in elk type cel en ziekte te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Voedingsvrije Afleiding van neurale stamcellen uit humane pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...