Name: flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives
Uploaded: 2021-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives at JoVE.com

אנו מודים בחביבות למרכז ההדמיה המולקולרית ולמתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה באוניברסיטת ברגן בנורווגיה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממועצת המחקר הנורבגית (מספר מענק: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ומועצת המלגות של סין (מספר הפרויקט: 201906220275).

הערה: עיין בטבלת החומרים ובטבלה המשלימה S1 לקבלת מתכונים של כל המדיות והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים לתאי NCS, נוירונים דופמינרגיים (DA) ואסטרוציטים
<ol><li>הכינו צלחות מצופות מטריצה.<ol><li>להפשיר בקבוקו?...

<ol>
	<li>Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+the+potential+countermeasure.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure.</a> CNS Neuroscience &amp; Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).</li><li>Chen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+riboside+and+metformin+ameliorate+mitophagy+defect+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+with+POLG+mutations.">Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+phenotypes+in+iPSC-derived+neural+stem+cells+with+POLG+mutations.">Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).</li><li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--fusion,+fission,+movement,+and+mitophagy--in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases.</a> Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+key+modulator+in+neurodegenerative+diseases.">Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases.</a> Molecules. 24 (8), 1583 (2019).</li><li>Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interplay+between+cristae+biogenesis,+mitochondrial+dynamics+and+mitochondrial+DNA+integrity.">Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).</li><li>Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Sch&#246;ler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+human+disease+using+stem+cell+models.">Investigating human disease using stem cell models.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).</li><li>Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell+models+of+disease+and+the+prognosis+of+academic+medicine.">Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine.</a> Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation.">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. , 337 (2021).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li><li>Juopperi, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+generated+from+patient+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+features+of+Huntington's+disease+patient+cells.">Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells.</a> Molecular Brain. 5, 17 (2012).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+derived+astrocytes+with+POLG+mutations+and+mitochondrial+dysfunction+including+abnormal+NAD++metabolism+is+toxic+for+neurons.">Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+induced+pluripotent+stem+cells:+induction,+maintenance,+and+differentiation+into+functional+schwann+cells.">Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).</li><li>Hong, Y. J., Do, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+lineage+differentiation+from+pluripotent+stem+cells+to+mimic+human+brain+tissues.">Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).</li><li>Lundin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS-derived+astroglia+from+a+stable+neural+precursor+state+show+improved+functionality+compared+with+conventional+astrocytic+models.">Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation.">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).</li><li>Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+MitoTracker+Green&#8482;+and+CMXrosamine+to+measure+changes+in+mitochondrial+membrane+potentials+in+living+cells+and+tissues.">Efficacy of MitoTracker Green&#8482; and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues.</a> Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).</li><li>Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+mitochondrial+membranes+with+10-nonyl+acridine+orange,+MitoFluor+Green,+and+MitoTracker+Green+is+affected+by+mitochondrial+membrane+potential+altering+drugs.">Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs.</a> Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).</li><li>Buckman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+labeling+in+primary+neuronal+and+astrocytic+cultures:+influence+of+mitochondrial+membrane+potential+and+oxidants.">MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).</li><li>Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-density-dependent+changes+in+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+production+in+human+skin+cells+post+sunlight+exposure.">Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure.</a> Photodermatology, Photoimmunology &amp; Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).</li></ol>

להלן פרוטוקולים ליצירת נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC ולהערכת היבטים רבים של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות ציטומטריה של זרימה. פרוטוקולים אלה מאפשרים המרה יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הן לתאי עצב והן לאסטרוציטים גליים, ואפיון מפורט של תפקוד המיטוכונדריה, בעיקר בתאים חיים. הפרו...

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים הנמצאים כמעט בכל התאים האאוקריוטים. המיטוכונדריה אחראים על אספקת האנרגיה על ידי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחון חמצוני ומשמשים כמתווכים מטבוליים לביוסינתזה ולחילוף חומרים. המיטוכונדריה מעורבת עמוקות בתהליכים תאיים חשובים רבים אחרים, כגון ייצור ROS, מוות של תאים וויסות תוך-תאישל Ca 2+. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה נקשר למחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר (AD), מחלת הנטינגטון (HD), אטקסיה של פרידריך (FRDA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS)1. גם תפקוד לקוי מוגבר של המיטוכונדריה וחריגה ב-mtDNA נחשבים כתורמים להזדקנות האנושית 2,3.
סוגים שונים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מתרחשים במחלות נוירודגנרטיביות, ושינויים בנפח המיטוכונדריה, דה-פולריזציה של MMP, ייצור ROS ושינויים במספר עותק mtDNA נפוצים 4,5,6,7. לכן, ליכולת למדוד תפקודים מיטוכונדריאליים אלה ואחרים יש חשיבות רבה כאשר חוקרים את מנגנוני המחלה ובודקים גורמים טיפוליים פוטנציאליים. יתר על כן, לאור היעדרם של מודלים חייתיים המשכפלים נאמנה מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות, הקמת מערכות מודל in vitro מתאימות המשחזרות את המחלה האנושית בתאי המוח היא צעד חשוב לקראת הבנה טובה יותר של מחלות אלה ופיתוח טיפולים חדשים 2,3,8,9.
ניתן להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים כדי ליצור תאי מוח שונים, כולל תאים עצביים ולא עצביים (כלומר, תאי גליה), ונזק מיטוכונדריאלי הקשור למחלות נוירודגנרטיביות נמצא בשני סוגי התאים 3,10,11,12,13. שיטות מתאימות להתמיינות iPSC לשושלות עצביות וגליאליות זמינות14,15,16. תאים אלה מספקים פלטפורמה ייחודית לבני אדם/מטופלים למידול מחלות במבחנה ולבדיקת תרופות. יתר על כן, מכיוון שאלה נגזרים מחולים, נוירונים שמקורם ב- iPSC ותאי גליה מספקים מודלים של מחלות המשקפים את מה שקורה בבני אדם בצורה מדויקת יותר.
נכון להיום, קיימות מעט שיטות נוחות ואמינות למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים, במיוחד תאי עצב חיים ותאי גלייה. השימוש בציטומטריה של זרימה מספק למדען כלי רב עוצמה למדידת פרמטרים ביולוגיים, כולל תפקוד מיטוכונדריאלי, בתאים בודדים. פרוטוקול זה מספק פרטים ליצירת סוגים שונים של תאי מוח, כולל תאי גזע עצביים (תאי גזע עצביים), נוירונים ואסטרוציטים גליאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים, כמו גם גישות חדשניות המבוססות על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל iPSCs ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. הפרוטוקול מספק גם אסטרטגיית צביעה משותפת לשימוש בציטומטריה של זרימה למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP, רמת ROS מיטוכונדריאלית, מתחמי MRC ו- TFAM. על ידי שילוב מדדים של נפח או מסה מיטוכונדריאלית, פרוטוקולים אלה מאפשרים גם מדידה של הרמה הכוללת והרמה הספציפית לכל יחידת מיטוכונדריה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857, RRID:AB_445175</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287, RRID:AB_778073</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959, RRID:AB_2341193</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Pax6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5790, RRID:AB_305110</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nestin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-23927, RRID:AB_627994</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:50, 20 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFAP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674, RRID:AB_304558</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-S100&#946;&#160; conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196442, RRID:AB_2722596</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75875, RRID:AB_1310786</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tuj 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab78078, RRID:AB_2256751</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32127, RRID:AB_2286949</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD-95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723, RRID:AB_303248</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198308</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use mouse monoclonal IgG2b&#160; Alexa Fluor&#174; 488 as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Cat# sc-17764 RRID:AB_628381</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use mouse monoclonal IgG2a&#160; Alexa Fluor&#174; 488 as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NDUFB10</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196019</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SDHA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137040</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14744, RRID:AB_301443</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use&#160; Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-mouse IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABM Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3187</td>
			<td>Basal medium for astrocyte culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGM SingleQuots Supplement Pack</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td>Supplement for astrocyte culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Basal medium for dilute Geltrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Europa Bioproducts</td>
			<td>EQBAH62-1000</td>
			<td>Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>DA neurons medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11905031</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning non-treated culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430589</td>
			<td>Suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Used for a variety of cell culture wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Astrocyte differentiation basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Basal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516901</td>
			<td>Basal medium for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517101</td>
			<td>Supplement for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic (AA 10&#8211;155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12103C</td>
			<td>Medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td>Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid aspiration system BVC control</td>
			<td>Vacuubrand, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (PFA) 16%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>Used for attachment and maintenance of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>DA neurons medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>Used for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31765027</td>
			<td>Basal medium for CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin beta-1 human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3055</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Stain the nuclei for confocal image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubators</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21980032</td>
			<td>Basal medium for CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1376497</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution AMPK Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>171261</td>
			<td>Neural induction medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like Growth Factor-I human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Basal medium for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Used for mitochondrial volume indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSox Red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Used for mitochondrial ROS indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Neural induction medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>Used for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shakers - SSM1</td>
			<td>Stuart Equipment, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72204</td>
			<td>Promotes DA neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting the coverslip for confocal image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Used for a variety of wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>423-F8-025/CF</td>
			<td>Promotes DA neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>TB1614-GMP</td>
			<td>Neural Induction Medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Neural Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10508-01</td>
			<td>Supplement for NSCs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>652202</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for cells permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113852</td>
			<td>Used for mitochondrial membrane potential staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments</td>
			<td>Grant Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives

מיטוכונדריה חשובים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירודגנרטיביות רבות. שינויים בנפח המיטוכונדריה, בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP), בייצור מיטוכונדריאלי של מיני חמצן תגובתי (ROS) ובמספר העתק הדנ"א המיטוכונדריאלי (mtDNA) הם לעתים קרובות מאפיינים של תהליכים אלה. דו"ח זה מפרט גישה חדשנית המבוססת על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. אסטרטגיה מבוססת זרימה זו משתמשת בתאים חיים למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP ורמות ROS, כמו גם בתאים קבועים כדי להעריך רכיבים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) וחלבונים הקשורים ל-mtDNA כגון גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM). 
על ידי צביעה משותפת עם כתבים פלואורסצנטיים, כולל MitoTracker Green (MTG), טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר (TMRE) ו-MitoSox Red, ניתן לכמת שינויים בנפח המיטוכונדריה, ב-MMP וב-ROS המיטוכונדריאלי וקשורים לתכולת המיטוכונדריה. צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד תת-יחידות מורכבות של MRC וטרנסלוקאז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 20 (TOMM20) מאפשרת הערכה של ביטוי תת-יחידות MRC. מכיוון שכמות ה-TFAM פרופורציונלית למספר העותקים של mtDNA, המדידה של TFAM ל-TOMM20 נותנת מדידה עקיפה של mtDNA לכל נפח מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע תוך 2-3 שעות. חשוב לציין שפרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של פרמטרים מיטוכונדריאליים, הן ברמה הכוללת והן ברמה הספציפית לכל נפח מיטוכונדריאלי, באמצעות ציטומטריה של זרימה.

תיאור סכמטי של שיטת ההתמיינות והאסטרטגיות הציטומטריות של הזרימה מוצג באיור 3. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מובחנים לרוזטות עצביות ואז מורמים לתרבית תרחיף לצורך התמיינות לתחומים עצביים. התחומים העצביים מובחנים עוד יותר ומבשילים לנוירוני DA. הכדורים העצביים מפורקים לתאים...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

הפרוטוקול שלנו מספק למדען כלי רב עוצמה לשילוב מספר פרמטרים זעירים ברמת התא הבודד מה-IPS האנושי ונגזרותיו העצביות והברורות. פרוטוקולים אלה מאפשרים שילוב של פרמטרים מיטוכונדריאליים, הן ברמה הכוללת והן ברמה הספציפית לכל נפח מיטוכונדריאלי, באמצעות ציטומטריה של זרימה. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מספר סוגי תאים כולל אלה ממחלות נוירודגנרטיביות אחרות.לכן, הוא יכול בכך לעזור לספק תובנה לגבי המנגנונים שמאחורי סוגי מחלות אלה וגם עשוי לסייע בסינון טיפולי. כדי להתחיל, זרעו את התאים בנפרד לארבע בארות בצלחת של שש בארות ודגרו על התאים עד להשגת 50 עד 60% מפגש. בסוף תקופת התרבית, הכינו חמש תמיסות צביעה אישיות המכילות שילובים שונים של מדיום תרבית, FCCP, TMRE, MTG וממרח גרב מיטו.הוסיפו אותם לבארות המתאימות, ודגרו את התאים כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, לשאוף את המדיום מכל הבארות לשטוף עם PBS. עבור ניתוק תאים, דגירה של התאים עם מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.נטרל את מגיב הדיסוציאציה של התא עם מיליליטר אחד של DMEM, בתוספת 10% FBS. לאחר מכן אסוף את תוכן הבאר בצינור כרוניקה של 15 מיליליטר. גלולה במורד התאים על ידי צנטרציה ושטפו את כדור התא עם PBS פעם או פעמיים.לשאוף את כל supernatant, משאיר כ 100 microliters בצינור. להשעות מחדש את כדורי התא ב 300 מיקרוליטר של PBS. לאחר העברת השעיית התא לתוך צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר, לשמור את הצינור בחושך בטמפרטורת החדר.נתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה עם הגדרות מסנן מעבר הפס המתוארות בכתב היד של הטקסט. יש לנתק כמיליון תאים באמצעות מגיב הדיסוציאציה של התא ולהוריד את התאים כפי שהוכח קודם לכן. נטרל את תרחיף התא עם DMEM בתוספת 10% FBS ואסוף את המתלה בצינור 15 מיליליטר.לתקן את התאים עם מיליליטר אחד של 1.6% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. Permeabolize את התאים עם מיליליטר אחד של קרח קר 90% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן לחסום את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ חוסם, ולשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS, כפי שהודגם.כדי לזהות קומפלקסים ותת-יחידות מיטוכונדריאליות שונות, דגרו על התאים במשך 30 דקות עם הנוגדנים הראשוניים המתוארים בכתב היד של הטקסט. לאחר שטיפת התאים פעם אחת עם PBS, לדגור על התאים עם נוגדן משני במשך 30 דקות. בתום הדגירה, יש לשטוף ולהשעות מחדש את התאים וה-PBS כפי שהוכח.מעבירים את מתלה התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר, המוחזק בחושך על קרח. לאחר מכן, לנתח את התאים על ציטומטר זרימה ולזהות אותות ולסנן אחד באמצעות 5 30/30 פס לעבור מסנן. עבור כל תת-אוכלוסייה של תאים, בחר תרשים היסטוגרמה ונתח את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית או MFI של ערוצי הסינון השונים.חשב את רמות TMRE, ערכים ספציפיים עבור תת-יחידה מורכבת של MMP ROS ו- TFAM, כמתואר בכתב היד של הטקסט. ציטומטריה של זרימה ותאים חיים שימשו לחקר נפח מיטוכונדריאלי MMP ורמות ROS. בתאי עצב מסוג POLG DA נצפו MMP ספציפי נמוך יותר ו-ROS ספציפי גבוה יותר, בעוד שלא נצפו שינויים בנפח המיטוכונדריה, סך ה-MMP וה-ROS.האסטרוציטים של POLG ירדו ב-MMP, אך לא חל שינוי בנפח המיטוכונדריה וב-ROS. ציטומטריה של זרימה ותאים קבועים שימשו כדי לחקור את הרמה של תת-יחידה מורכבת MRC ו- TFAM. תאי עצב של DA הראו עלייה ב-COMPLEX 1 וב-TFAM לעומת שליטה, אך לא חל שינוי בשתי רמות מורכבות.אסטרוציטים של POLG הראו הפחתה של קומפלקס אחד ארבע ו- TFAM ספציפי. מכיוון שצפיפות התא יכולה להשפיע גם על MMP ועל הקשר בין MTG לפלואורסצנציה של MMP, זהו ספציפי לתא. התאמת פרוטוקול זה לסוגי תאים אחרים תדרוש ככל הנראה אופטימיזציה בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אסיס מבוסס מיקרוסקופי, למשל מיקרוסקופיה קונפוקלית, המספקת פרטים נוספים על מבנים מיטוכונדריאליים.לכן, בעוד שאסטרטגיה זו מזהה תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בתאי עצב DA ובאסטרוציטים ממחלה מיטוכונדריאלית ידועה, ניתן ליישם טכניקות אלה גם כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה בכל סוג של תאים ומחלות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...