Name: flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives
Uploaded: 2021-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives at JoVE.com

노르웨이 베르겐 대학교의 분자 이미징 센터와 유세포 분석 핵심 시설에 감사드립니다. 이 연구는 노르웨이 연구위원회 (보조금 번호 : 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat 및 중국 장학위원회 (프로젝트 번호 : 201906220275)의 자금으로 지원되었습니다.

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 매체 및 솔루션의 레시피에 대해서는 재료 표 및 보충 표 S1 을 참조하십시오.
1. 인간 iPSC를 NCS, 도파민성(DA) 뉴런 및 성상세포로 분화
<ol><li>매트릭스 코팅 플레이트를 준비하십시오.<ol><li>매트릭스 5mL가 담긴 바이알을 얼음에서 밤새 해동합니다. 1mL의 매트릭스를 차가운 고급 Dulbecco의 변형 된 독수리 ?...

<ol>
	<li>Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+the+potential+countermeasure.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure.</a> CNS Neuroscience &amp; Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).</li><li>Chen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+riboside+and+metformin+ameliorate+mitophagy+defect+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+with+POLG+mutations.">Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+phenotypes+in+iPSC-derived+neural+stem+cells+with+POLG+mutations.">Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).</li><li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--fusion,+fission,+movement,+and+mitophagy--in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases.</a> Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+key+modulator+in+neurodegenerative+diseases.">Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases.</a> Molecules. 24 (8), 1583 (2019).</li><li>Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interplay+between+cristae+biogenesis,+mitochondrial+dynamics+and+mitochondrial+DNA+integrity.">Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).</li><li>Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Sch&#246;ler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+human+disease+using+stem+cell+models.">Investigating human disease using stem cell models.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).</li><li>Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell+models+of+disease+and+the+prognosis+of+academic+medicine.">Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine.</a> Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation.">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. , 337 (2021).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li><li>Juopperi, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+generated+from+patient+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+features+of+Huntington's+disease+patient+cells.">Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells.</a> Molecular Brain. 5, 17 (2012).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+derived+astrocytes+with+POLG+mutations+and+mitochondrial+dysfunction+including+abnormal+NAD++metabolism+is+toxic+for+neurons.">Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+induced+pluripotent+stem+cells:+induction,+maintenance,+and+differentiation+into+functional+schwann+cells.">Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).</li><li>Hong, Y. J., Do, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+lineage+differentiation+from+pluripotent+stem+cells+to+mimic+human+brain+tissues.">Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).</li><li>Lundin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS-derived+astroglia+from+a+stable+neural+precursor+state+show+improved+functionality+compared+with+conventional+astrocytic+models.">Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation.">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).</li><li>Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+MitoTracker+Green&#8482;+and+CMXrosamine+to+measure+changes+in+mitochondrial+membrane+potentials+in+living+cells+and+tissues.">Efficacy of MitoTracker Green&#8482; and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues.</a> Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).</li><li>Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+mitochondrial+membranes+with+10-nonyl+acridine+orange,+MitoFluor+Green,+and+MitoTracker+Green+is+affected+by+mitochondrial+membrane+potential+altering+drugs.">Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs.</a> Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).</li><li>Buckman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+labeling+in+primary+neuronal+and+astrocytic+cultures:+influence+of+mitochondrial+membrane+potential+and+oxidants.">MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).</li><li>Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-density-dependent+changes+in+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+production+in+human+skin+cells+post+sunlight+exposure.">Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure.</a> Photodermatology, Photoimmunology &amp; Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).</li></ol>

본원에는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포를 생성하고 유세포분석을 사용하여 미토콘드리아 기능의 여러 측면을 평가하기 위한 프로토콜이 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 인간 iPSC를 뉴런과 신경교 성상 세포로 효율적으로 변환하고 대부분 살아있는 세포에서 미토콘드리아 기능을 자세히 특성화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 살아있는 세포의 부피, MMP 및 미토콘드리아 ROS 수준과 고정 세포?...

미토콘드리아는 거의 모든 진핵 세포에 존재하는 필수 세포 기관입니다. 미토콘드리아는 산화적 인산화를 통해 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하여 에너지 공급을 담당하고 생합성 및 대사를 위한 대사 매개체 역할을 합니다. 미토콘드리아는 ROS 생성, 세포 사멸 및 세포 내Ca2+ 조절과 같은 다른 많은 중요한 세포 과정에 깊이 관여합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨병(PD), 알츠하이머병(AD), 헌팅턴병(HD), 프리드라이히 운동실조증(FRDA) 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)1을 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 증가된 미토콘드리아 기능 장애 및 mtDNA 이상도 인간의 노화에 기여하는 것으로 생각됩니다 2,3.
다양한 유형의 미토콘드리아 기능 장애가 신경 퇴행성 질환에서 발생하며 미토콘드리아 부피의 변화, MMP 탈분극, ROS 생성 및 mtDNA 복제 수의 변화가 일반적입니다 4,5,6,7. 따라서 이러한 기능 및 기타 미토콘드리아 기능을 측정하는 능력은 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적 인 치료제를 테스트 할 때 매우 중요합니다. 더욱이, 인간 신경퇴행성 질환을 충실하게 복제하는 동물 모델의 부족을 고려할 때, 뇌 세포에서 인간 질병을 요약하는 적절한 시험관내 모델 시스템을 확립하는 것은 이러한 질병에 대한 더 큰 이해와 새로운 치료법의 개발을 향한 중요한 단계입니다 2,3,8,9.
인간 iPSC는 뉴런 및 비뉴런 세포(즉, 신경교 세포)를 비롯한 다양한 뇌 세포를 생성하는데 사용될 수 있으며, 신경퇴행성 질환과 관련된 미토콘드리아 손상은 두 세포 유형 3,10,11,12,13 모두에서 발견되었다. 신경 및 신경교 계통으로의 iPSC 분화를 위한 적절한 방법이 이용가능하다14,15,16. 이 세포는 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 고유한 인간/환자 플랫폼을 제공합니다. 또한 환자에서 파생되기 때문에 iPSC 유래 뉴런과 신경교 세포는 인간에서 일어나는 일을보다 정확하게 반영하는 질병 모델을 제공합니다.
현재까지 iPSC, 특히 살아있는 뉴런과 신경교 세포에서 여러 미토콘드리아 기능 파라미터를 측정하는 편리하고 신뢰할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 유세포 분석의 사용은 과학자에게 단일 세포에서 미토콘드리아 기능을 포함한 생물학적 매개 변수를 측정하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 iPSC의 신경 줄기 세포(NSC), 뉴런 및 신경교 성상세포를 포함한 다양한 유형의 뇌 세포 생성에 대한 세부 정보와 iPSC 및 iPSC 유래 신경 및 신경교 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하는 새로운 유세포 분석 기반 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 유세포분석을 사용하여 미토콘드리아 부피, MMP, 미토콘드리아 ROS 수준, MRC 복합체 및 TFAM을 측정하기 위한 공동염색 전략을 제공합니다. 미토콘드리아 부피 또는 질량의 측정을 통합함으로써, 이러한 프로토콜은 또한 미토콘드리아 단위 당 총 수준과 특정 수준의 측정을 허용합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857, RRID:AB_445175</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287, RRID:AB_778073</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959, RRID:AB_2341193</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Pax6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5790, RRID:AB_305110</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nestin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-23927, RRID:AB_627994</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:50, 20 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFAP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674, RRID:AB_304558</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-S100&#946;&#160; conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196442, RRID:AB_2722596</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75875, RRID:AB_1310786</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tuj 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab78078, RRID:AB_2256751</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32127, RRID:AB_2286949</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD-95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723, RRID:AB_303248</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198308</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use mouse monoclonal IgG2b&#160; Alexa Fluor&#174; 488 as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Cat# sc-17764 RRID:AB_628381</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use mouse monoclonal IgG2a&#160; Alexa Fluor&#174; 488 as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NDUFB10</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196019</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SDHA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137040</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14744, RRID:AB_301443</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use&#160; Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-mouse IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABM Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3187</td>
			<td>Basal medium for astrocyte culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGM SingleQuots Supplement Pack</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td>Supplement for astrocyte culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Basal medium for dilute Geltrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Europa Bioproducts</td>
			<td>EQBAH62-1000</td>
			<td>Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>DA neurons medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11905031</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning non-treated culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430589</td>
			<td>Suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Used for a variety of cell culture wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Astrocyte differentiation basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Basal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516901</td>
			<td>Basal medium for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517101</td>
			<td>Supplement for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic (AA 10&#8211;155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12103C</td>
			<td>Medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td>Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid aspiration system BVC control</td>
			<td>Vacuubrand, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (PFA) 16%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>Used for attachment and maintenance of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>DA neurons medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>Used for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31765027</td>
			<td>Basal medium for CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin beta-1 human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3055</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Stain the nuclei for confocal image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubators</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21980032</td>
			<td>Basal medium for CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1376497</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution AMPK Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>171261</td>
			<td>Neural induction medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like Growth Factor-I human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Basal medium for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Used for mitochondrial volume indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSox Red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Used for mitochondrial ROS indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Neural induction medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>Used for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shakers - SSM1</td>
			<td>Stuart Equipment, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72204</td>
			<td>Promotes DA neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting the coverslip for confocal image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Used for a variety of wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>423-F8-025/CF</td>
			<td>Promotes DA neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>TB1614-GMP</td>
			<td>Neural Induction Medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Neural Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10508-01</td>
			<td>Supplement for NSCs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>652202</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for cells permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113852</td>
			<td>Used for mitochondrial membrane potential staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments</td>
			<td>Grant Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives

미토콘드리아는 많은 신경 퇴행성 질환의 병태생리학에서 중요하다. 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위 (MMP), 활성 산소 종 (ROS)의 미토콘드리아 생산 및 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 복제 수의 변화는 종종 이러한 과정의 특징입니다. 이 보고서는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 및 iPSC 유래 신경 및 신경교 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하기 위한 새로운 유세포 분석 기반 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 흐름 기반 전략은 살아있는 세포를 사용하여 미토콘드리아 부피, MMP 및 ROS 수준을 측정하고 고정 세포를 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬(MRC) 및 미토콘드리아 전사 인자 A(TFAM)와 같은 mtDNA 관련 단백질의 구성 요소를 추정합니다. 
MitoTracker Green(MTG), 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(TMRE) 및 MitoSox Red를 포함한 형광 리포터와의 공동 염색을 통해 미토콘드리아 부피, MMP 및 미토콘드리아 ROS의 변화를 정량화하고 미토콘드리아 함량과 관련시킬 수 있습니다. MRC 복합체 서브유닛 및 외부 미토콘드리아 막 20(TOMM20)의 트랜스로카제에 대한 항체를 이용한 이중 염색은 MRC 서브유닛 발현의 평가를 허용한다. TFAM의 양은 mtDNA 복제 수에 비례하므로 TOMM20 당 TFAM의 측정은 미토콘드리아 부피 당 mtDNA의 간접적 인 측정을 제공합니다. 전체 프로토콜은 2-3 시간 내에 수행 할 수 있습니다. 중요하게도, 이러한 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 미토콘드리아 부피 당 전체 수준과 특정 수준 모두에서 미토콘드리아 매개 변수를 측정 할 수 있습니다.

분화 방법 및 유세포 분석 전략에 대한 개략적인 설명이 그림 3에 나와 있습니다. 인간 iPSC는 신경 로제트로 분화된 다음 신경 영역으로 분화하기 위해 서스펜션 배양으로 들어 올려집니다. 신경 영역은 DA 뉴런으로 더욱 분화되고 성숙됩니다. 신경 구체는 단일 세포로 해리되어 신경교 성상 세포를 생성하고 NSC로 단층으로 재 도금 된 다음 성상 세포로 분화됩니다. 이 프로토...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포와 그 신경 및 신경교 유도체에서 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

우리의 프로토콜은 과학자에게 인간 IPS와 신경 및 투명 유도체의 단일 세포 수준에서 여러 마이크로 매개 변수를 결합하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 미토콘드리아 부피 당 전체 수준과 특정 수준 모두에서 미토콘드리아 매개 변수의 즐거움을 허용합니다. 이 기술은 다른 신경 퇴행성 질환의 세포 유형을 포함한 여러 세포 유형에 적용될 수 있습니다.따라서 이러한 질병 유형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 잠재적으로 치료 스크리닝에 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 세포를 6웰 플레이트의 4웰에 별도로 시드하고 50-60%의 컨플루언시가 달성될 때까지 세포를 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 배양 배지, FCCP, TMRE, MTG 및 미토 양말 스프레드의 다양한 조합을 포함하는 5개의 개별 염색 용액을 준비합니다.그것들을 각각의 웰에 첨가하고, 원고에 기술된대로 세포를 배양한다. 다음으로 모든 우물에서 배지를 흡입하고 PBS로 씻으십시오. 세포 분리를 위해 섭씨 37도에서 5 분 동안 세포 해리 시약 1 밀리리터로 세포를 배양하십시오.10% FBS가 보충된 DMEM 1밀리리터로 세포 해리 시약을 중화합니다. 그런 다음 15 밀리리터 크로니클 튜브에 우물 내용물을 모으십시오. 원통화에 의해 세포를 펠릿화하고 PBS로 세포 펠릿을 한두 번 세척한다.모든 상청액을 흡인하여 튜브에 약 100 마이크로 리터를 남깁니다. 세포 펠릿을 300 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮긴 후 튜브를 실온의 어두운 곳에 보관하십시오.텍스트 원고에 설명된 대역 통과 필터 설정이 있는 유세포분석기를 사용하여 세포를 분석합니다. 세포 해리 시약을 사용하여 약 100만 개의 세포를 분리하고 이전에 입증된 대로 세포를 펠릿 다운합니다. DMEM과 10%FBS로 세포 현탁액을 중화하고 15밀리리터 튜브에 현탁액을 수집합니다.실온에서 1.6 % 파라 포름 알데히드 1 밀리리터로 세포를 10 분 동안 고정하십시오. 섭씨 영하 20도에서 20 분 동안 얼음처럼 차가운 90 % 메탄올 1 밀리리터로 세포를 투과시킵니다. 이어서 샘플을 1 밀리리터의 블로킹 완충액으로 차단하고, 입증된 바와 같이 PBS로 원심분리하여 세포를 세척한다.상이한 미토콘드리아 복합체 및 서브유닛을 검출하기 위해, 텍스트 원고에 기술된 각각의 1차 항체와 함께 세포를 30분 동안 배양한다. 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 세포를 2차 항체와 함께 30분 동안 배양한다. 인큐베이션의 끝에, 입증된 바와 같이 세포 및 PBS를 세척하고 재현탁시킨다.세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 얼음 위의 어둠 속에 보관합니다. 다음으로, 유세포분석기에서 세포를 분석하고 신호를 검출한 후 5 30/30 대역 통과 필터를 사용하여 세포를 필터링합니다. 각 세포 부분모집단에 대해 히스토그램 플롯을 선택하고 서로 다른 필터 채널의 중앙값 형광 강도 또는 MFI를 분석합니다.TMRE 수준, MMP ROS 복합 서브유닛 및 TFAM에 대한 특정 값을 텍스트 원고에 설명된 대로 계산한다. 유세포분석기 및 살아있는 세포를 MMP 미토콘드리아 부피 및 ROS 수준을 조사하기 위해 사용하였다. POLG DA 뉴런에서, 더 낮은 특이적 MMP 및 더 높은 특이적 ROS가 관찰된 반면, 미토콘드리아 부피, 총 MMP 및 ROS에는 변화가 없었다.POLG 성상교세포는 MMP를 감소시켰지만, 미토콘드리아 부피 및 ROS에는 변화가 없었다. 유동 세포분석 및 고정 세포는 MRC 복합체 서브유닛 및 TFAM의 수준을 조사하기 위해 사용되었다. DA 뉴런은 대조군에 비해 증가된 복합체 1 및 TFAM을 나타냈지만, 복합체 2 수준에서는 변화가 없었다.POLG 성상교세포는 복합체 14 및 특이적 TFAM의 감소를 나타내었다. 세포 밀도가 또한 MMP 및 MTG와 MMP 형광 사이의 관계에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이것은 세포 특이적이다. 이 프로토콜을 다른 세포 유형에 적용하려면 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 절차에 따라 미토콘드리아 구조에 대한 추가 세부 정보를 제공하는 공초점 현미경과 같은 현미경 기반 asis를 수행할 수 있습니다.따라서이 전략은 알려진 미토콘드리아 질환에서 DA 뉴런과 성상 세포에서 미토콘드리아 기능 장애를 감지하지만 이러한 기술은 모든 유형의 세포 및 질병에서 미토콘드리아 기능을 탐색하는 데에도 적용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

연구

신경과학

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...