Name: flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives
Uploaded: 2021-11-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives at JoVE.com

Мы любезно благодарим Центр молекулярной визуализации и Центр проточной цитометрии в Университете Бергена в Норвегии. Эта работа была поддержана финансированием Норвежского исследовательского совета (номер гранта: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat и Китайского стипендиального совета (номер проекта: 201906220275).

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов и Дополнительную таблицу S1 для рецептур всех сред и решений, используемых в этом протоколе.
1. Дифференциация ИПСК человека в NCS, дофаминергические (DA) нейроны и астроциты
<ol><li>Подготовьте пластины с матричным ...

<ol>
	<li>Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+the+potential+countermeasure.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure.</a> CNS Neuroscience &amp; Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).</li><li>Chen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+riboside+and+metformin+ameliorate+mitophagy+defect+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+with+POLG+mutations.">Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+phenotypes+in+iPSC-derived+neural+stem+cells+with+POLG+mutations.">Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).</li><li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--fusion,+fission,+movement,+and+mitophagy--in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases.</a> Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress:+A+key+modulator+in+neurodegenerative+diseases.">Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases.</a> Molecules. 24 (8), 1583 (2019).</li><li>Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interplay+between+cristae+biogenesis,+mitochondrial+dynamics+and+mitochondrial+DNA+integrity.">Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).</li><li>Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Sch&#246;ler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+human+disease+using+stem+cell+models.">Investigating human disease using stem cell models.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).</li><li>Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell+models+of+disease+and+the+prognosis+of+academic+medicine.">Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine.</a> Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation.">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. , 337 (2021).</li><li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson's+disease+model.">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li><li>Juopperi, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+generated+from+patient+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+features+of+Huntington's+disease+patient+cells.">Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells.</a> Molecular Brain. 5, 17 (2012).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+derived+astrocytes+with+POLG+mutations+and+mitochondrial+dysfunction+including+abnormal+NAD++metabolism+is+toxic+for+neurons.">Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+induced+pluripotent+stem+cells:+induction,+maintenance,+and+differentiation+into+functional+schwann+cells.">Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).</li><li>Hong, Y. J., Do, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+lineage+differentiation+from+pluripotent+stem+cells+to+mimic+human+brain+tissues.">Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).</li><li>Lundin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS-derived+astroglia+from+a+stable+neural+precursor+state+show+improved+functionality+compared+with+conventional+astrocytic+models.">Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).</li><li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation.">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).</li><li>Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+MitoTracker+Green&#8482;+and+CMXrosamine+to+measure+changes+in+mitochondrial+membrane+potentials+in+living+cells+and+tissues.">Efficacy of MitoTracker Green&#8482; and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues.</a> Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).</li><li>Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+mitochondrial+membranes+with+10-nonyl+acridine+orange,+MitoFluor+Green,+and+MitoTracker+Green+is+affected+by+mitochondrial+membrane+potential+altering+drugs.">Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs.</a> Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).</li><li>Buckman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoTracker+labeling+in+primary+neuronal+and+astrocytic+cultures:+influence+of+mitochondrial+membrane+potential+and+oxidants.">MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).</li><li>Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-density-dependent+changes+in+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+production+in+human+skin+cells+post+sunlight+exposure.">Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure.</a> Photodermatology, Photoimmunology &amp; Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).</li></ol>

Здесь представлены протоколы для генерации нейронов и астроцитов, полученных из iPSC, и оценки нескольких аспектов функции митохондрий с использованием проточной цитометрии. Эти протоколы позволяют эффективно преобразовывать человеческие ИПСК как в нейроны, так и в глиальные астроцит?...

Митохондрии являются важными органеллами, присутствующими почти во всех эукариотических клетках. Митохондрии отвечают за энергоснабжение, производя аденозинтрифосфат (АТФ) путем окислительного фосфорилирования и действуют как метаболические посредники для биосинтеза и метаболизма. Митохондрии глубоко вовлечены во многие другие важные клеточные процессы, такие как генерация АФК, гибель клеток и внутриклеточная регуляция Ca2+. Митохондриальная дисфункция была связана с различными нейродегенеративными заболеваниями, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Хантингтона (БГ), атаксию Фридрейха (FRDA) и боковой амиотрофический склероз (БАС)1. Считается, что повышенная митохондриальная дисфункция и аномалия мтДНК также способствуют старению человека 2,3.
Различные типы митохондриальной дисфункции встречаются при нейродегенеративных заболеваниях, а изменения в объеме митохондрий, деполяризация MMP, производство АФК и изменения в количестве копий мтДНК распространены 4,5,6,7. Поэтому способность измерять эти и другие митохондриальные функции имеет большое значение при изучении механизмов заболевания и тестировании потенциальных терапевтических агентов. Более того, ввиду отсутствия животных моделей, которые точно воспроизводят нейродегенеративные заболевания человека, создание подходящих модельных систем in vitro, которые рекапитулируют заболевание человека в клетках мозга, является важным шагом на пути к лучшему пониманию этих заболеваний и разработке новых методов лечения 2,3,8,9.
Человеческие ИПСК могут быть использованы для генерации различных клеток мозга, включая нейронные и ненейрональные клетки (то есть глиальные клетки), а митохондриальное повреждение, связанное с нейродегенеративными заболеваниями, было обнаружено в обоих типах клеток 3,10,11,12,13. Соответствующие методы дифференциации iPSC в нейронные и глиальные линии доступны 14,15,16. Эти клетки обеспечивают уникальную платформу для моделирования заболеваний in vitro и скрининга лекарств. Кроме того, поскольку они получены от пациентов, нейроны и глиальные клетки, полученные из iPSC, обеспечивают модели заболеваний, которые более точно отражают то, что происходит у людей.
На сегодняшний день существует мало удобных и надежных методов измерения множественных митохондриальных функциональных параметров в ИПСК, особенно в живых нейронах и глиальных клетках. Использование проточной цитометрии предоставляет ученому мощный инструмент для измерения биологических параметров, включая митохондриальную функцию, в отдельных клетках. Этот протокол предоставляет подробную информацию о генерации различных типов клеток мозга, включая нервные стволовые клетки (NSC), нейроны и глиальные астроциты из iPSCs, а также новые подходы на основе проточной цитометрии для измерения нескольких митохондриальных параметров в разных типах клеток, включая iPSCs и нейронные и глиальные клетки, полученные из iPSC. Протокол также обеспечивает стратегию совместного окрашивания для использования проточной цитометрии для измерения объема митохондрий, MMP, уровня митохондриальной АФК, комплексов MRC и TFAM. Включая измерения объема или массы митохондрий, эти протоколы также позволяют измерять как общий уровень, так и конкретный уровень на митохондриальную единицу.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857, RRID:AB_445175</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287, RRID:AB_778073</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sox2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97959, RRID:AB_2341193</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Pax6</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5790, RRID:AB_305110</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Nestin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-23927, RRID:AB_627994</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:50, 20 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFAP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4674, RRID:AB_304558</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-S100&#946;&#160; conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196442, RRID:AB_2722596</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TH</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75875, RRID:AB_1310786</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tuj 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab78078, RRID:AB_2256751</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Synaptophysin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32127, RRID:AB_2286949</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PSD-95</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2723, RRID:AB_303248</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:100, 10 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab198308</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use mouse monoclonal IgG2b&#160; Alexa Fluor&#174; 488 as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Cat# sc-17764 RRID:AB_628381</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use mouse monoclonal IgG2a&#160; Alexa Fluor&#174; 488 as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-NDUFB10</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab196019</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SDHA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab137040</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution;&#160; use Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-rabbit IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-COX IV</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14744, RRID:AB_301443</td>
			<td>Primary Antibody; use as 1:1000, 1 &#956;L in 1000 &#956;L staining solution; use&#160; Alexa Fluor &#174; 488 goat anti-mouse IgG&#160; (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABM Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3187</td>
			<td>Basal medium for astrocyte culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGM SingleQuots Supplement Pack</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4123</td>
			<td>Supplement for astrocyte culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Basal medium for dilute Geltrex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Europa Bioproducts</td>
			<td>EQBAH62-1000</td>
			<td>Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>DA neurons medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11905031</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning non-treated culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430589</td>
			<td>Suspension culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Used for a variety of cell culture wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td>Astrocyte differentiation basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Basal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516901</td>
			<td>Basal medium for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517101</td>
			<td>Supplement for iPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic (AA 10&#8211;155) Recombinant Human Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0024</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12103C</td>
			<td>Medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120081</td>
			<td>Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid aspiration system BVC control</td>
			<td>Vacuubrand, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (PFA) 16%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>Used for attachment and maintenance of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Supplement for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>DA neurons medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td>Used for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31765027</td>
			<td>Basal medium for CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin beta-1 human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRP3055</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H1399</td>
			<td>Stain the nuclei for confocal image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubators</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21980032</td>
			<td>Basal medium for CDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>1376497</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InSolution AMPK Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>171261</td>
			<td>Neural induction medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-like Growth Factor-I human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12660012</td>
			<td>Basal medium for NSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker Green FM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Used for mitochondrial volume indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoSox Red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M36008</td>
			<td>Used for mitochondrial ROS indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Neural induction medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Astrocyte differentiation medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>Used for blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shakers - SSM1</td>
			<td>Stuart Equipment, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7405</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72204</td>
			<td>Promotes DA neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting the coverslip for confocal image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Used for a variety of wash</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>423-F8-025/CF</td>
			<td>Promotes DA neuron differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>TB1614-GMP</td>
			<td>Neural Induction Medium ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Neural Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10508-01</td>
			<td>Supplement for NSCs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>652202</td>
			<td>CDM ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITON X-100</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for cells permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRE</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab113852</td>
			<td>Used for mitochondrial membrane potential staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments</td>
			<td>Grant Instruments, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of multiple mitochondrial parameters in human induced pluripotent stem cells and their neural and glial derivatives

Митохондрии играют важную роль в патофизиологии многих нейродегенеративных заболеваний. Изменения в объеме митохондрий, митохондриальном мембранном потенциале (MMP), митохондриальной продукции активных форм кислорода (АФК) и количестве копий митохондриальной ДНК (мтДНК) часто являются особенностями этих процессов. В этом отчете подробно описывается новый подход на основе проточной цитометрии для измерения нескольких митохондриальных параметров в различных типах клеток, включая индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (IPSCs) и нейронные и глиальные клетки, полученные из iPSC. Эта стратегия, основанная на потоке, использует живые клетки для измерения объема митохондрий, уровней MMP и АФК, а также фиксированные клетки для оценки компонентов митохондриальной дыхательной цепи (MRC) и связанных с мтДНК белков, таких как митохондриальный фактор транскрипции A (TFAM). 
Путем совместного окрашивания с флуоресцентными репортерами, включая MitoTracker Green (MTG), тетраметилродаминэтиловый эфир (TMRE) и MitoSox Red, изменения в объеме митохондрий, MMP и митохондриальном АФК могут быть количественно определены и связаны с содержанием митохондрий. Двойное окрашивание антителами против субъединиц комплекса MRC и транслоказы наружной митохондриальной мембраны 20 (TOMM20) позволяет оценить экспрессию субъединицы MRC. Поскольку количество TFAM пропорционально числу копий мтДНК, измерение TFAM на TOMM20 дает косвенное измерение мтДНК на митохондриальный объем. Весь протокол может быть выполнен в течение 2-3 ч. Важно отметить, что эти протоколы позволяют измерять митохондриальные параметры, как на общем уровне, так и на конкретном уровне на митохондриальный объем, используя проточную цитометрию.

Схематическое описание метода дифференциации и цитометрических стратегий потока показано на рисунке 3. Человеческие ИПСК дифференцируются в нейронные розетки, а затем поднимаются в культуру суспензии для дифференциации в нейронные сферы. Нейронные сферы далее диффер...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

В этом исследовании сообщается о новом подходе к измерению нескольких митохондриальных функциональных параметров на основе проточной цитометрии и двойного окрашивания двумя флуоресцентными репортерами или антителами для обнаружения изменений в объеме митохондрий, митохондриальном мембранном потенциале, уровне активных форм кислорода, составе митохондриальной дыхательной цепи и митохондриальной ДНК.

Проточный цитометрический анализ множественных митохондриальных параметров в индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клетках и их нервных и глиальных производных

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

Наш протокол предоставляет ученому мощный инструмент для объединения нескольких микропараметров на уровне одной клетки от IPS человека и их нейро- и прозрачных производных. Эти протоколы позволяют веселить митохондриальные параметры, как на общем уровне, так и на конкретном уровне на митохондриальный объем, используя проточную цитометрию. Этот метод может быть применен к нескольким типам клеток, в том числе от других нейродегенеративных заболеваний.Таким образом, это может помочь дать представление о механизмах, лежащих в основе этих типов заболеваний, а также потенциально помочь в терапевтическом скрининге. Для начала посейте клетки отдельно в четыре лунки в шестилуночной пластине и инкубируйте клетки до тех пор, пока не будет достигнуто от 50 до 60% конфлюзии. В конце периода культивирования готовят пять отдельных окрашивающих растворов, содержащих различные комбинации питательной среды, FCCP, TMRE, MTG и mito sock spread.Добавьте их в соответствующие колодцы и инкубируйте клетки, как описано в рукописи. Далее аспирировать среду из всех колодцев и промыть PBS. Для отслоения клеток инкубируют клетки с помощью одного миллилитра реагента диссоциации клеток при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.Нейтрализуют клеточный диссоциационный реагент одним миллилитом ДМЭМ, дополненным 10% FBS. Затем соберите содержимое лунки в 15-миллилитровую летопись. Гранулируйте ячейки путем центрификации и промывайте гранулу ячейки PBS один или два раза.Аспирируйте весь супернатант, оставляя примерно 100 микролитров в трубке. Повторно суспендируйте гранулы клеток в 300 микролитрах PBS. После переноса клеточной суспензии в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку держите трубку в темноте при комнатной температуре.Проанализируйте клетки с помощью проточного цитометра с настройками полосового фильтра, описанными в текстовой рукописи. Отделите около 1 миллиона клеток с помощью реагента диссоциации клеток и гранулируйте клетки, как было продемонстрировано ранее. Нейтрализуйте клеточную суспензию с помощью DMEM плюс 10% FBS и соберите суспензию в 15-миллилитровую трубку.Зафиксируйте клетки одним миллилитом 1,6% параформальдегида при комнатной температуре в течение 10 минут. Пермеаболизируют клетки одним миллилитром ледяного холодного 90%метанола при минус 20 градусах Цельсия в течение 20 минут. Затем блокируйте образцы в одном миллилитре блокирующего буфера и промывайте клетки центрифугированием PBS, как показано на рисунке.Для обнаружения различных митохондриальных комплексов и субъединиц инкубируют клетки в течение 30 минут с соответствующими первичными антителами, описанными в текстовой рукописи. После однократного промывания клеток PBS инкубируют клетки с вторичным антителом в течение 30 минут. В конце инкубации промывайте и повторно приостанавливайте клетки и PBS, как показано на рисунке.Переложите клеточную суспензию в 1,5-миллилитрную микроцентрифужную трубку, хранящуюся в темноте на льду. Затем проанализируйте клетки на проточном цитометре и определите сигналы и отфильтруйте один с помощью 5-полосового фильтра 30/30. Для каждой подпопуляции клеток выберите график гистограммы и проанализируйте среднюю интенсивность флуоресценции или MFI различных каналов фильтра.Рассчитайте уровни TMRE, конкретные значения для комплексной субъединицы MMP ROS и TFAM, как описано в тексте рукописи. Проточная цитометрия и живые клетки использовались для исследования митохондриального объема MMP и уровней АФК. В нейронах POLG DA наблюдалось более низкое специфическое MMP и более высокое специфическое ROS, при этом не наблюдалось изменений в объеме митохондрий, общем MMP и ROS.Астроциты POLG имели снижение MMP, но не изменение объема митохондрий и АФК. Проточная цитометрия и фиксированные клетки были использованы для исследования уровня субъединицы комплекса MRC и TFAM. Нейроны DA показали увеличение сложного первого и TFAM по сравнению с контролем, но не изменили сложный двухуровневый.Астроциты POLG показали снижение комплекса один четыре и специфический TFAM. Поскольку плотность клеток также может влиять на MMP и взаимосвязь между ФЛУОресценцией MTG и MMP, это специфично для клетки. Адаптация этого протокола к другим типам клеток, вероятно, потребует оптимизации После этой процедуры может быть выполнена микроскопическая асис, например, конфокальная микроскопия, предоставляющая дополнительные сведения о митохондриальных структурах.Таким образом, хотя эта стратегия обнаруживает митохондриальную дисфункцию в нейронах DA и астроцитах от известного митохондриального заболевания, эти методы также могут быть применены для изучения функции митохондрий в любом типе клеток и заболеваний.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Покадровый Живая съемка клонально Связанные нейронные клетки-предшественники в развивающихся данио рерио переднего мозга

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

ЦГМФ-применимо Метод расширения для агрегатов человека нервных стволовых и предшественники клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток или плода ткани головного мозга

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Режиссер дофаминергических Neuron Дифференциация от человека плюрипотентных стволовых клеток

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Вывод для взрослых фибробластов человека и их прямое преобразование в расширения нейронной клетки-предшественники

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Преобразование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в функциональные спинномозговых и черепных двигательных нейронов с помощью переносчиков

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

В Vivo Прямое перепрограммирование резидентных глиальных клеток в интернейроны путем внутримозговой инъекции вирусных векторов

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...