Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

تم دعم Z.C.A. من قبل مجلس البحوث العلمية والتكنولوجية في تركيا (TUBITAK) 2219- برنامج زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه الدولي. تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل المركز الوطني للطب التكميلي والتكاملي التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1R41AT011716-01. كما تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل الجمعية الأمريكية لمنحة بدء أبحاث العقاقير ، ومنحة ريجيس تكنولوجيز إلى L.C. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

1. زراعة الخلايا من خلايا الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y (خطوط الخلايا TrkB و TrkB-NULL (الأبوية) )
ملاحظة: تم شراء خطوط الخلايا (خط الخلية SH-SY5Y (TrkB، BR6) وخط الخلية الأبوية SH-SY5Y (TrkB NULL))49,50 من كيرافاست. تستخدم الخلايا المستزرعة كمصدر للمستقبلات عبر الغش...

إن تحديد المركبات النشطة الموجودة في مخاليط معقدة من المستقلبات المتخصصة مهمة صعبة للغاية23. تقليديا ، يتم عزل المركبات الفردية ، ويتم اختبار نشاطها في فحوصات مختلفة. هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ومكلفا وغالبا ما يؤدي إلى عزل وتحديد المركبات الأكثر وفرة وتميزا23. ?...

المخاليط النباتية غنية بالمركبات النشطة دوائيا1 ، وتعمل كمصدر جيد لتحديد نتائج الأدوية الجديدة وتؤدي إلى2،3،4،5. كان اكتشاف أدوية جديدة من المنتجات الطبيعية نهجا مثمرا والعديد من الأدوية المعتمدة حاليا نشأت من مركبات تم تحديدها لأول مرة في الطبيعة. من الصعب أن يقابل التنوع الكيميائي للمركبات الطبيعية مكتبات من صنع الإنسان من الجزيئات المصنعة كيميائيا. تتفاعل العديد من المركبات الطبيعية مع أهداف البروتين البشري وتعدل ويمكن اعتبارها جزيئات شبيهة بالأدوية محسنة تطوريا6. هذه المركبات الطبيعية مناسبة بشكل خاص لتحديد الرصاص المخدرات لاستخدامها في الاضطرابات العصبية6. اثنان من الأدوية المعتمدة حاليا من إدارة الأغذية والعقاقير لإدارة مرض الزهايمر (AD) مشتقة من قلويدات طبيعية ، وهي: galantamine و rivastigmine (مشتق من physostigmine)6. تم تحديد L-DOPA ، وهو حاليا الدواء الأكثر شيوعا لمرض باركنسون ، لأول مرة من الفول العريض (Vicia faba L.) 7. Pergolide و lisuride ، ناهضات مستقبلات الدوبامين هي مشتقات قلويدات الإرغوت الطبيعية من الفطريات الطفيلية Claviceps purpurea8. ريسيربين، قلويد معزول من جذر الثعبان الهندي (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) كان واحدا من أوائل الأدوية المضادة للذهان9. في الآونة الأخيرة ، تم ربط الاستجابة المناعية غير المنظمة والالتهاب الجهازي بتطور العديد من الأمراض العصبية ، مثل الاضطراب الاكتئابي الرئيسي أو الأمراض العصبية التنكسية10. تم العثور على نظام غذائي نباتي جنبا إلى جنب مع تدخلات نمط الحياة الأخرى لتحسين القدرات المعرفية والوظيفية لدى كبار السن 11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21 . تم العثور على بعض الجزيئات الكهربية التي تنتمي إلى triterpenes والبوليفينول لتعديل الاستجابات الالتهابية في كل من المختبر وفي النماذج الحية 12. على سبيل المثال ، تتداخل المركبات الطبيعية التي تحتوي على α،β الكربونيل غير المشبع (على سبيل المثال ، الكركمين ، القرفة ، القرفة) ، أو مجموعة الأيزوثيوسيانات (على سبيل المثال ، السلفورافان) مع مستقبلات Toll-4 (TLR4) التي تمنع التوليف النهائي للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات في خط الخلايا المؤيدة لل B المعتمد على الفئران12,22 . تشير الأدلة الوبائية بقوة إلى أن المواد الكيميائية النباتية الغذائية ، الموجودة في المصفوفات الغذائية المعقدة ، قد تشكل أيضا مصدرا قابلا للتطبيق لأدوية جديدةتؤدي 6.
واحدة من العقبات الرئيسية في تحديد الجزيئات النشطة بيولوجيا الموجودة في المستخلصات النباتية ، بما في ذلك الأغذية النباتية ، هي تعقيد العينات التي تم التحقيق فيها. تقليديا ، يتم عزل المركبات الفردية وتنقيتها واختبارها لاحقا للنشاط البيولوجي. عادة ما يؤدي هذا النهج إلى تحديد المركبات الأكثر وفرة وتميزا. تعتمد مناهج اكتشاف الأدوية المظهرية بدون هدف جزيئي محدد على التجزئة الموجهة بيولوجيا للمخاليط المعقدة23. في هذا النهج ، يتم تقسيم المستخلص إلى أجزاء فرعية أقل تعقيدا يتم اختبارها لاحقا في اختبارات النمط الظاهري. يسترشد عزل وتنقية المركبات النشطة بالنشاط البيولوجي الذي تم التحقق منه في الفحص. قد تؤدي معرفة هوية هدف دوائي محدد إلى تسريع كبير في تحديد المركبات النشطة دوائيا الموجودة في المخاليط المعقدة. تعتمد هذه الأساليب عادة على تجميد الهدف الجزيئي ، على سبيل المثال ، إنزيم ، على سطح صلب ، مثل الخرز المغناطيسي23. وتستخدم الأهداف المجمدة لاحقا في تجارب الفرز التي تؤدي إلى عزل المركبات المتفاعلة مع الهدف. في حين تم استخدام هذا النهج على نطاق واسع في تحديد المركبات التي تستهدف البروتينات الخلوية ، فقد تم تطبيقه بشكل أقل شيوعا في تحديد المواد الكيميائية المتفاعلة مع البروتينات عبر الغشاء (TMPs)23. ينبع تحد إضافي في تجميد TMPs من حقيقة أن نشاط البروتين يعتمد على تفاعله مع الدهون الفوسفاتية في غشاء الخلية والجزيئات الأخرى في الطبقة الثنائية مثل الكوليسترول23,24. من المهم الحفاظ على هذه التفاعلات الدقيقة بين البروتينات وبيئتها ثنائية الطبقة الفوسفاتية الأصلية عند محاولة شل حركة الهدف عبر الغشاء.
في غشاء التقارب الخلوي ، يتم تجميد شظايا غشاء الخلية (CMAC) ، وليس البروتينات النقية ، على جزيئات الطور الثابت للغشاء الاصطناعي (IAM)23. يتم تحضير المراحل الثابتة IAM عن طريق الترابط التساهمي لنظائر الفوسفاتيديل كولين على السيليكا. تم مؤخرا تطوير فئات جديدة من المراحل الثابتة IAM التي يتم فيها تغطية مجموعات الأمين والسيلانول الحر (IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2). خلال أعمدة CMAC إعداد شظايا غشاء الخلية يتم تجميدها على سطح جزيئات IAM من خلال الامتزاز.
وقد استخدمت أعمدة CMAC حتى الآن لشل حركة فئات مختلفة من TMPs بما في ذلك القنوات الأيونية (على سبيل المثال ، مستقبلات النيكوتين) ، GPCRs (على سبيل المثال ، مستقبلات المواد الأفيونية) ، ناقلات البروتين (على سبيل المثال ، p-glycoprotein) ، إلخ.24. وقد استخدمت أهداف البروتين المجمدة في توصيف الديناميكا الدوائية (على سبيل المثال، ثابت التفكك، Kd) أو تحديد حركيات الربط (kon and koff) لأربطة الجزيئات الصغيرة التي تتفاعل مع الهدف وكذلك في عملية تحديد خيوط الدواء الجديدة المحتملة الموجودة في المصفوفات المعقدة24 . نقدم هنا إعداد أعمدة CMAC مع مستقبل التروبوميوسين كيناز B (TrkB) المتجمد ، والذي ظهر كهدف قابل للتطبيق لاكتشاف الأدوية للعديد من اضطرابات الجهاز العصبي.
أظهرت الدراسات السابقة أن تنشيط مسار عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) / TrkB يرتبط بتحسين بعض الأمراض العصبية ، مثل AD أو اضطراب الاكتئاب الرئيسي25،26،27،28. وأفيد أن مستويات BDNF وتعبيره عن مستقبلاته TrkB تنخفض في AD ، وتخفيضات مماثلة تضعف وظيفة الحصين في النماذج الحيوانية من AD29. تم الإبلاغ عن انخفاض مستويات BDNF في مصل ودماغ مرضى AD 30،31،32. تم العثور على فرط التعبير عن تاو أو فرط الفسفرة لخفض تنظيم تعبير BDNF في الخلايا العصبية الأولية والنماذج الحيوانية AD33،34،35. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن BDNF له آثار وقائية على السمية العصبية الناجمة عن β أميلويد في المختبر وفي الجسم الحي36. وقد تبين أن إعطاء BDNF المباشر في دماغ الفئران يزيد من التعلم والذاكرة في الحيوانات الضعيفة إدراكيا37. ظهرت BDNF / TrkB كهدف صالح لتخفيف الاضطرابات العصبية والنفسية بما في ذلكAD 28,38. إن استهداف مسار إشارات BDNF / TrkB لتطوير العلاجات في AD من المحتمل أن يعزز فهمنا للمرض39. لسوء الحظ ، لا يمكن استخدام BDNF نفسه كعلاج بسبب خصائصه الدوائية السيئة وآثاره الجانبية الضارة40. تم استكشاف منشطات الجزيئات الصغيرة لمسارات TrkB / BDNF كروابط TrkB محتملة41،42،43. من بين ناهضات الجزيئات الصغيرة التي تم اختبارها ، 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) ، ثبت أنها تنشط مسار BDNF / TrkB41,44,45,46. ويجري حاليا النظر في مشتق من 7,8-DHF (R13؛ 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diyl bis(methylcarbamate)) كدواء محتمل ل AD47. في الآونة الأخيرة ، تبين أن العديد من مضادات الاكتئاب تعمل من خلال الارتباط المباشر ب TrkB وتعزيز إشارات BDNF ، مما يؤكد على أهمية متابعة TrkB كهدف صالح لعلاج الاضطرابات العصبية المختلفة48.
يصف البروتوكول عملية تجميع عمود TrkB الوظيفي وعمود التحكم السلبي TrkB-NULL. تتميز الأعمدة باستخدام منتج طبيعي معروف رباط جزيئي صغير: 7,8-DHF. بالإضافة إلى ذلك ، نصف عملية فحص المصفوفات المعقدة ، باستخدام المستخلص النباتي كمثال ، لتحديد المركبات التي تتفاعل مع TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

كانت المواد الكيميائية التي يتم تصنيعها بواسطة النباتات والفطريات والبكتيريا واللافقاريات البحرية مصدرا غنيا لضربات الأدوية الجديدة وخيوطها. تم تحديد الأدوية مثل الستاتين أو البنسلين أو الباكليتاكسيل أو راباميسين أو الأرتيميسينين ، التي يشيع استخدامها في الممارسة الطبية ، لأول مرة وعزلها عن المنتجات الطبيعية. ومع ذلك ، فإن تحديد وعزل المستقلبات المتخصصة النشطة بيولوجيا من المصادر الطبيعية هي عملية صعبة وتستغرق وقتا طويلا. تقليديا ، يتم عزل المستقلبات الفردية وتنقيتها من مخاليط معقدة ، بعد استخراج الكتلة الحيوية. في وقت لاحق ، يتم اختبار الجزيئات المعزولة في اختبارات وظيفية للتحقق من نشاطها البيولوجي. نقدم هنا استخدام أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي (CMAC) لتحديد المركبات النشطة بيولوجيا مباشرة من المخاليط المعقدة. تسمح أعمدة CMAC بتحديد المركبات التي تتفاعل مع البروتينات الوظيفية عبر الغشاء (TMPs) المجمدة المضمنة في بيئتها ثنائية الطبقة الفوسفاتية الأصلية. هذا نهج مستهدف ، والذي يتطلب معرفة TMP الذي يعتزم المرء تعديل نشاطه مع مرشح عقار الجزيء الصغير الذي تم تحديده حديثا. في هذا البروتوكول ، نقدم نهجا لإعداد أعمدة CMAC مع مستقبلات التروبوميوسين كيناز B (TrkB) المجمدة ، والتي ظهرت كهدف قابل للتطبيق لاكتشاف الأدوية للعديد من اضطرابات الجهاز العصبي. في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتجميع عمود CMAC مع مستقبلات TrkB المجمدة باستخدام خطوط خلايا الورم الأرومي العصبي التي تبالغ في التعبير عن مستقبلات TrkB. كما نقدم النهج للتحقيق في وظائف العمود واستخدامه في تحديد مستقلبات النباتات المتخصصة التي تتفاعل مع مستقبلات TrkB.

بعد البروتوكول ، تم تجميع عمودين كروماتوغرافيين CMAC: أحدهما مع شظايا غشاء خلية الورم الأرومي العصبي SH-SY5Y المجمدة مع TrkB المعبر عنه بشكل مفرط والآخر مع شظايا غشاء خلية SH-SY5Y TrkB-NULL. يتم عرض عمود CMAC الذي تم تجميعه بشكل صحيح في الشكل 1 ويتم عرض الخطوات التي ينطوي عليها تجميد شظايا غ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

يصف البروتوكول إعداد أعمدة كروماتوغرافيا تقارب غشاء الخلية (CMAC) مع شظايا غشاء الخلية المجمدة التي تحتوي على بروتينات مستقبلات التروبوميوزين كيناز B الوظيفية عبر الغشاء. كما يتم شرح استخدام أعمدة CMAC في تحديد مستقلبات النباتات المتخصصة التي تتفاعل مع هذه المستقبلات والموجودة في المخاليط الطبيعية المعقدة.

أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي لتحديد مستقلبات النباتات المتخصصة التي تتفاعل مع مستقبلات تروبوميوسين كيناز B المجمدة

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

يقدم هذا العمودي خطوات مهمة في تجميع أعمدة كروماتوغرافيا تقارب غشاء الخلية مع مستقبلات وظيفية عبر الغشاء. يمكن استخدام هذه الأعمدة لتحديد الجزيئات الصغيرة الموجودة في المستخلصات المعقدة والتفاعل مع المستقبلات عبر الغشاء المجمدة. تسرع أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي من تحديد المركبات النشطة بيولوجيا الموجودة في المخاليط المعقدة.يمكن أن يكون استخدام أعمدة كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي ذا أهمية خاصة للمهتمين بتحديد المركبات النشطة دوائيا الموجودة في المصفوفات الطبيعية المعقدة ، مثل المستخلصات النباتية أو الفطرية أو البكتيرية. للبدء ، قم بإعداد محلول مخزون البنزاميدين 200 ملليمولار عن طريق إذابة 120 من البنزاميدين في خمسة ملليلتر من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. تحضير محلول مخزون PMSF 10 ملليمولار عن طريق إذابة 0.017 جرام من PMSF في 10 ملليلتر من الإيثانول في غطاء الدخان.قم بإعداد كوكتيل مثبط البروتياز 100X عن طريق إذابة خليط مثبطات الأنزيم البروتيني المتوفر تجاريا في ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. تخلط جيدا و aliquot 200 إلى 300 ميكرولتر من الكوكتيل. تحضير محلول مخزون ATP 100 ملليمولار عن طريق إذابة 55.114 ملليغرام من هيدرات ملح الصوديوم ATP في ملليلتر واحد من الماء المتأين فائق النقاء.تخلط جيدا و aliquot 100 ميكرولتر من الخليط. تحضير المخزن المؤقت عن طريق إذابة 3.03 غرام من Tris-HCL ، و 2.9 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 0.22 غرام من كلوريد الكالسيوم اللامائي ، و 0.2 غرام من سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم ، و 0.19 غرام من كلوريد البوتاسيوم في 500 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. قم بإعداد مخزن مؤقت للتجانس عن طريق خلط 17.3 ملليلتر من المخزن المؤقت Tris مع 0.3 ملليلتر من محلول مخزون البنزاميدين ، و 0.2 ملليلتر من محلول مخزون PMSF ، و 0.2 ملليلتر من كوكتيل مثبطات البروتياز ، و 20 ميكرولتر من محلول مخزون ATP ، وملليلتر من الجلسرين ، و 0.029 جرام من EDTA.اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام محلول حمض الهيدروكلوريك. قم بتدوير الخلايا التي يتم حصادها عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق عند 400 × g وقم بإزالة supernatant وغسل حبيبات الخلايا المتبقية ب 10 ملليلتر من 1X pH 7.4 PBS الجليدي البارد. تخلص من supernatant وأضف 20 ملليلتر من المخزن المؤقت للتجانس.ضع الأنبوب المخروطي على الثلج. انقل المعلق الخلوي إلى مطحنة أنسجة مجانسة Dounce سعة 40 ملليلتر ، وقم بتجانس التعليق يدويا على الجليد باستخدام 40 ضربة مدقة لأعلى ولأسفل. نقل تعليق الخلية المتجانسة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ، والتخلص من الكريات ونقل supernatant إلى أنبوب مخروطي جديد.حفظ بيليه غشاء الخلية والتخلص من supernatant. تحضير المخزن المؤقت للذوبان عن طريق خلط 8.7 ملليلتر من المحلول العازل مع 0.1 ملليلتر من محلول مخزون PMSF ، و 0.15 ملليلتر من محلول مخزون البنزاميدين ، و 0.1 ملليلتر من كوكتيل مثبطات البروتياز ، و 10 ميكرولتر من محلول مخزون ATP ، و ملليلتر واحد من الجلسرين ، و 0.2 جرام من كولات الصوديوم. انقل المخزن المؤقت للذوبان إلى الأنبوب المخروطي مع شظايا غشاء الخلية.وإعادة تعليق الكرية. قم بتدوير الخليط الناتج عند 150 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة. بعد 18 ساعة ، قم بالطرد المركزي لخليط الذوبان عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة عند 47،900 × جم.أضف 100 ملليغرام من IAM. كمبيوتر شخصي. جزيئات DD2 إلى supernatant وتدوير خليط التعليق الناتج عند 150 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. تحضير الغسيل العازل في أربعة لترات من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء عن طريق إضافة 24 غراما من Tris-HCl ، و 23.4 غراما من كلوريد الصوديوم ، و 0.06 غراما من كلوريد الكالسيوم ، و 5.85 غراما من EDTA ، و 0.07 غراما من PMSF.قم بإذابة PMSF أولا في كمية صغيرة من الإيثانول ثم أضفها ببطء إلى الكأس باستخدام المخزن المؤقت. قطع 10 سنتيمترات من أنابيب غسيل الكلى غشاء السليلوز لإعداد أنبوب غسيل الكلى، ونقل التعليق الذي يحتوي على IAM. كمبيوتر شخصي. جزيئات DD2 وشظايا غشاء الخلية في أنبوب غسيل الكلى.أغلق طرفي أنبوب غسيل الكلى بمشابك أنابيب غسيل الكلى. ضع أنبوب غسيل الكلى في المخزن المؤقت لغسيل الكلى. بعد 24 ساعة، ضع أنبوب غسيل الكلى في المخزن المؤقت لغسيل الكلى المعد حديثا واستمر غسيل الكلى لمدة 24 ساعة أخرى.قم بإعداد 10 ملليمولار من الأس الهيدروجيني 7.4 خلات الأمونيوم العازلة التي سيتم استخدامها لغسل IAM. كمبيوتر شخصي. جسيمات DD2 وفي تجارب توصيف العمود عن طريق إذابة 0.778 جرام من خلات الأمونيوم في لتر واحد من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء. بعد 48 ساعة من غسيل الكلى، قم بإزالة أنبوب غسيل الكلى من المخزن المؤقت لغسيل الكلى ونقل محتوى أنبوب غسيل الكلى إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.تخلص من السوبرناتانت واغسل الكريات المتبقية ثلاث مرات باستخدام 10 ملليلتر من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم. بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الكريات المتبقية في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم. امزجه جيدا واستخدم الملاط الناتج لتعبئة العمود الزجاجي 5 × 20 لإنتاج عمود كروماتوغرافيا CMAC.لتعبئة العمود ، ضع مرشحا سفليا منقوعا مسبقا بمخزن مؤقت من خلات الأمونيوم في حامل الفلتر. قم بتركيب حامل المرشح في العمود الزجاجي وقم بتثبيت غطاء العمود لتأمين موضع الحامل. ضع العمود عموديا في مشبك إصبع وقم بتثبيته في حامل المختبر.ضع دورقا أسفل العمود ، وانقل كمية صغيرة من الملاط إلى العمود الزجاجي ببطء باستخدام ماصة أحادية القناة تمسك طرف الماصة بجدار العمود الزجاجي. لتسريع عملية التعبئة ، قم بإزالة المخزن المؤقت من فوق السرير الثابت باستخدام ماصة دقيقة بين كل خطوة. ضع مرشحا علويا وقم بربط وحدة المحول بحيث لا يوجد مخزن مؤقت متبقي فوق المرحلة الثابتة.قم بتأمين موضع وحدة المحول باستخدام قفل المحول. قم بتوصيل العمود بمضخة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، ولغسل العمود بين عشية وضحاها باستخدام مخزن خلات الأمونيوم ، اضبط معدل التدفق على 0.2 ملليلتر في الدقيقة. للتخزين لفترة أطول ، قم بتشغيل العمود بمحلول أزيد الصوديوم بنسبة 0.05٪ في المخزن المؤقت لأسيتات الأمونيوم ، وارتداء معطف المختبر ، ونظارات السلامة ، والقفازات عند العمل مع أزيد الصوديوم وتخزينها عند أربع درجات مئوية.كمبيوتر شخصي. أدت جسيمات DD2 مع شظايا غشاء خلية الورم الأرومي العصبي TrkB المجمدة وفي وجود BDNF إلى جزيئات فلورسنت. لم يلاحظ أي تألق في جسيمات IAM المغلفة بغشاء الخلية الخالية من TrkB أو عندما لم يتم استخدام BDNF كما هو الحال في جسيمات IAM المغلفة بغشاء خلية TrkB. تظهر أعمدة CMAC الوظيفية كروماتوجرام التقارب الجبهي النموذجي لزيادة تركيزات 7 و 8-DHF من ملليمولار واحد و 750 نانومولار و 500 نانومول و 300 نانومولار إلى مستقبلات TrkB المجمدة ، والتي أظهرت تغيرا يعتمد على التركيز في وقت الاستبقاء.أظهر عمود CMAC غير وظيفي عدم وجود تغييرات تعتمد على التركيز في الاحتفاظ برباط العلامة. تم إعداد عمود التحكم السلبي CMAC عن طريق شل شظايا غشاء الخلية ، وليس التعبير عن البروتين المستهدف لاستبعاد التفاعلات غير المحددة. أدت إضافة مستخلص غوتو كولا المائي بنسبة 0.2٪ إلى انخفاض كبير قدره 7،8-DHF الاحتفاظ ، مما يشير إلى وجود روابط متنافسة لموقع ربط ناهض.كما أن عدم وجود تخفيض للاحتفاظ ب 7 ، 8-DHF على عمود TrkB السلبي CMAC ، أكد أيضا عدم وجود مستقبلات TrkB وظيفية في هذا العمود. حدد نهج كروماتوغرافيا الذروة المفقود مركبا تم الاحتفاظ به بقوة على عمود TrkB ، بينما كان يتخلى مبكرا عن عمود TrkB الفارغ ، مما يشير إلى تفاعل محدد. من الأهمية بمكان معرفة مصدر المستقبلات الخاصة بك لعمود كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي السريع.تأكد من التحقق من الأدبيات لتصميم المخازن المؤقتة للتجانس والذوبان بشكل صحيح. تم استخدام عمود كروماتوغرافيا تقارب الغشاء الخلوي المعد في هذا البروتوكول لتحديد الضربات الدوائية المحتملة الجديدة وتوصيف طبيعة التفاعل بين المستقبلات المجمدة وروابطها الطبيعية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

وهناك طريقة استخراج مجزأة بسيطة للتحليل الشامل من الأيض، والليبيدات، والبروتينات من عينة واحدة

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني، إعادة تشكيل ومقايسة من بوليهيستيديني معلم متالونزيمي للمختبرات الجامعية

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

انجذاب تطهير المجمعات البروتين ترانسلوكون بلاستيدات الخضراء باستخدام علامة الحنفية

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

تحديد فوسفات الإينوزيتول أو فوسفوينوسيتيد التفاعل البروتينات عن طريق الكروماتوغرافيا التقارب إلى جانب اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...