Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. blev støttet af Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219- International Postdoc Research Fellowship Program. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Center for Complimentary and Integrative Medicine fra National Institutes of Health under tildelingsnummer 1R41AT011716-01. Dette arbejde blev også delvist støttet af American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies bevilling til L.C. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.

1. Cellekultur af SH-SY5Y neuroblastomceller (TrkB og TrkB-NULL (forældre) cellelinjer)
BEMÆRK: Cellelinjer (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) og SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 blev købt hos Kerafast. Dyrkede celler anvendes som en kilde til de transmembranreceptorer, der skal immobiliseres til fremstilling af CMAC-kolonner. Følgende trin beskriver, hvordan man opnår cellemembranfragmenter og samler funkti...

Identifikation af aktive forbindelser til stede i komplekse blandinger af specialiserede metabolitter er en meget udfordrende opgave23. Traditionelt isoleres individuelle forbindelser, og deres aktivitet testes i forskellige assays. Denne fremgangsmåde er tidskrævende og dyr og fører ofte til isolering og identifikation af de mest rigelige og velkarakterierede forbindelser23. I øjeblikket anvendes screeningsassays med høj kapacitet og er stærkt afhængige af screenin...

Botaniske blandinger er rige på farmakologisk aktive forbindelser1, der tjener som en god kilde til identifikation af nye lægemiddelhits og fører 2,3,4,5. Opdagelsen af nye lægemidler fra naturlige produkter har været en frugtbar tilgang, og mange aktuelt godkendte lægemidler stammer fra forbindelser, der først blev identificeret i naturen. Den kemiske mangfoldighed af naturlige forbindelser er svær at matche af menneskeskabte biblioteker af kemisk syntetiserede molekyler. Mange naturlige forbindelser interagerer med og modulerer humane proteinmål og kan betragtes som evolutionært optimerede lægemiddellignende molekyler6. Disse naturlige forbindelser er særligt velegnede til identifikation af lægemiddellende til brug ved neurologiske lidelser6. To af de i øjeblikket FDA-godkendte lægemidler til behandling af Alzheimers sygdom (AD) er afledt af naturlige alkaloider, nemlig: galantamin og rivastigmin (et derivat af physostigmin)6. L-DOPA, i øjeblikket det mest almindeligt foreskrevne lægemiddel til Parkinsons sygdom, blev først identificeret fra den brede bønne (Vicia faba L.) 7. Pergolid og lisurid, dopaminerge receptoragonister er derivaterne af naturlige ergotalkaloider fra den parasitære svamp Claviceps purpurea8. Reserpin, et alkaloid isoleret fra indisk slangerod (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var et af de første antipsykotiske lægemidler9. For nylig har dysreguleret immunrespons og systemisk inflammation været forbundet med udviklingen af adskillige neurologiske lidelser, såsom større depressiv lidelse eller neurodegenerative sygdomme10. En plantebaseret kost sammen med andre livsstilsinterventioner har vist sig at forbedre kognitive og funktionelle evner hos ældre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Visse elektrofile molekyler, der tilhører triterpener og polyfenoler, har vist sig at modulere inflammatoriske reaktioner i både in vitro- og in vivo-modeller 12. For eksempel interfererer naturlige forbindelser indeholdende α.β-umættet carbonyl (f.eks. Curcumin, cinnamaldehyd) eller isothiocyanatgruppe (f.eks. Sulforafan) med Toll-lignende receptor-4 (TLR4) dimerisering, der hæmmer nedstrømssyntesen af proinflammatoriske cytokiner i en murininterleukin-3-afhængig pro-B-cellelinje12,22 . Epidemiologisk dokumentation peger stærkt på, at fytokemikalier i kosten, der findes i komplekse fødevarematricer, også kan udgøre en levedygtig kilde til nye lægemiddelledninger6.
En af de største hindringer for identifikationen af biologisk aktive molekyler i planteekstrakter, herunder plantebaserede fødevarer, er kompleksiteten af de undersøgte prøver. Traditionelt isoleres, renses de enkelte forbindelser og testes efterfølgende for biologisk aktivitet. Denne tilgang fører normalt til identifikation af de mest rigelige og velkarakterierede forbindelser. Fænotypiske lægemiddelopdagelsesmetoder uden et defineret molekylært mål er afhængige af biostyret fraktionering af komplekse blandinger23. I denne fremgangsmåde fraktioneres et ekstrakt i mindre komplekse underfraktioner, der efterfølgende testes i fænotypiske assays. Isolering og oprensning af aktive forbindelser styres af biologisk aktivitet verificeret i assayet. Kendskabet til identiteten af et specificeret lægemiddelmål kan i væsentlig grad fremskynde identifikationen af farmakologisk aktive forbindelser, der er til stede i komplekse blandinger. Disse tilgange er normalt baseret på immobilisering af det molekylære mål, for eksempel et enzym, på en fast overflade, som magnetiske perler23. De immobiliserede mål anvendes efterfølgende i screeningsforsøgene, hvilket resulterer i isolering af forbindelser, der interagerer med målet. Mens denne tilgang i vid udstrækning er blevet anvendt til identifikation af forbindelser rettet mod cytosoliske proteiner, er den blevet mindre almindeligt anvendt til identifikation af kemikalier, der interagerer med transmembranproteiner (TMP'er)23. En yderligere udfordring i immobiliseringen af TMP'er stammer fra det faktum, at proteinets aktivitet afhænger af dets interaktion med cellemembranphospholipider og andre molekyler i dobbeltlagstoget, såsom kolesterol23,24. Det er vigtigt at bevare disse subtile interaktioner mellem proteiner og deres oprindelige phospholipid dobbeltlagsmiljø, når man forsøger at immobilisere transmembranmålet.
I cellulær membranaffinitetskromatografi (CMAC) immobiliseres cellemembranfragmenter og ikke oprensede proteiner på de stationære fasepartikler af kunstig membran (IAM)23. IAM stationære faser fremstilles ved kovalent binding af phosphatidylcholinanaloger på silica. For nylig er der udviklet nye klasser af IAM stationære faser, hvor frie amin- og silanolgrupper er ende-capped (IAM. Personlig computer. DD2 partikler). Under CMAC-kolonnernes forberedelse immobiliseres cellemembranfragmenter på overfladen af IAM-partikler gennem adsorption.
CMAC-kolonner er blevet brugt til dato til at immobilisere forskellige klasser af TMP'er, herunder ionkanaler (f.eks. Nikotinreceptorer), GPCR'er (f.eks. Opioidreceptorer), proteintransportører (f.eks. P-glycoprotein) osv.24. De immobiliserede proteinmål er blevet anvendt til karakterisering af farmakodynamik (f.eks. dissociationskonstant, Kd) eller bestemmelse af bindingskinetik (kon og koff) af små molekyleligander, der interagerer med målet, samt i processen med identifikation af potentielle nye lægemiddelledninger, der er til stede i komplekse matricer24 . Her præsenterer vi forberedelsen af CMAC-kolonner med den immobiliserede tropomyosinkinasereceptor B (TrkB), som har vist sig som et levedygtigt mål for lægemiddelopdagelse for adskillige nervesystemforstyrrelser.
Tidligere undersøgelser viste, at aktiveringen af den hjerneafledte neurotrofiske faktor (BDNF) / TrkB-vej er forbundet med forbedring af visse neurologiske lidelser, såsom AD eller større depressiv lidelse 25,26,27,28. Det blev rapporteret, at BDNF-niveauer og dets receptor TrkB-ekspression falder i AD, og lignende reduktioner forringer hippocampus funktion i dyremodeller af AD29. Nedsatte niveauer af BDNF blev rapporteret i serum og hjerne hos AD-patienter 30,31,32. Tau-overekspression eller hyperphosphorylering viste sig at nedregulere BDNF-ekspression i primære neuroner og AD-dyremodeller 33,34,35. Derudover blev BDNF rapporteret at have beskyttende virkninger på β-amyloidinduceret neurotoksicitet in vitro og in vivo36. Direkte BDNF-administration i rottehjernen viste sig at øge indlæring og hukommelse hos kognitivt svækkede dyr37. BDNF / TrkB opstod som et gyldigt mål for at forbedre neurologiske og psykiatriske lidelser, herunder AD28,38. Målretning af BDNF/TrkB-signalvejen til udvikling af terapier i AD vil potentielt forbedre vores forståelse af sygdommen39. Desværre kan BDNF i sig selv ikke anvendes som behandling på grund af dets dårlige farmakokinetiske egenskaber og negative bivirkninger40. Små molekyleaktivatorer af TrkB / BDNF-veje er blevet undersøgt som potentielle TrkB-ligander 41,42,43. Blandt testede agonister med små molekyler har 7,8-dihydroxyflavon (7,8-DHF) vist sig at aktivere BDNF/TrkB-vejen 41,44,45,46. Et derivat af 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diylbis(methylcarbamat)) overvejes i øjeblikket som et muligt lægemiddel til AD47. For nylig blev det vist, at flere antidepressiva virker gennem direkte binding til TrkB og fremme af BDNF-signalering, hvilket yderligere understreger vigtigheden af at forfølge TrkB som et gyldigt mål til behandling af forskellige neurologiske lidelser48.
Protokollen beskriver processen med at samle funktionel TrkB-kolonne og TrkB-NULL negativ kontrolkolonne. Kolonnerne er karakteriseret ved hjælp af et kendt naturprodukt småmolekylær ligand: 7,8-DHF. Derudover beskriver vi processen med screening af komplekse matricer ved hjælp af planteekstrakt som et eksempel til identifikation af forbindelser, der interagerer med TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Kemikalier syntetiseret af planter, svampe, bakterier og marine hvirvelløse dyr har været en rig kilde til nye lægemiddelhits og bly. Lægemidler som statiner, penicillin, paclitaxel, rapamycin eller artemisinin, der almindeligvis anvendes i medicinsk praksis, er først blevet identificeret og isoleret fra naturlige produkter. Identifikation og isolering af biologisk aktive specialiserede metabolitter fra naturlige kilder er imidlertid en udfordrende og tidskrævende proces. Traditionelt isoleres og renses individuelle metabolitter fra komplekse blandinger efter ekstraktion af biomasse. Derefter testes de isolerede molekyler i funktionelle assays for at verificere deres biologiske aktivitet. Her præsenterer vi brugen af cellulære membranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner til at identificere biologisk aktive forbindelser direkte fra komplekse blandinger. CMAC-kolonner giver mulighed for identifikation af forbindelser, der interagerer med immobiliserede funktionelle transmembranproteiner (TMP'er) indlejret i deres oprindelige phospholipid-dobbeltlagsmiljø. Dette er en målrettet tilgang, som kræver, at man kender den TMP, hvis aktivitet man har til hensigt at modulere med den nyligt identificerede lægemiddelkandidat til små molekyler. I denne protokol præsenterer vi en tilgang til at forberede CMAC-kolonner med immobiliseret tropomyosinkinasereceptor B (TrkB), som har vist sig som et levedygtigt mål for lægemiddelopdagelse for adskillige nervesystemforstyrrelser. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol til at samle CMAC-kolonnen med immobiliserede TrkB-receptorer ved hjælp af neuroblastomcellelinjer, der overudtrykker TrkB-receptorer. Vi præsenterer yderligere tilgangen til at undersøge kolonnens funktionalitet og dens anvendelse til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med TrkB-receptorer.

Efter protokollen blev to CMAC-kromatografiske kolonner samlet: en med de immobiliserede SH-SY5Y neuroblastomcellemembranfragmenter med overudtrykt TrkB og en med SH-SY5Y TrkB-NULL cellemembranfragmenter. Den korrekt monterede CMAC-kolonne er vist i figur 1, og de trin, der er involveret i immobilisering af cellemembranfragmenter, er vist i figur 2.
Siden immobiliseringen af TrkB-receptorer på IAM. Personlig computer. DD2 kromatograf...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Protokollen beskriver fremstillingen af cellemembranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner med immobiliserede cellemembranfragmenter indeholdende funktionelle transmembrantropomyosinkinasereceptor B-proteiner. Anvendelsen af CMAC-kolonner til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med disse receptorer og er til stede i komplekse naturlige blandinger, forklares også.

Cellulære membranaffinitetskromatografikolonner til identifikation af specialiserede plantemetabolitter, der interagerer med immobiliseret tropomyosinkinasereceptor B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Denne lodrette præsenterer vigtige trin i samlingen af cellemembranaffinitetskromatografikolonner med funktionelle transmembranreceptorer. Disse kolonner kan anvendes til identifikation af små molekyler, der er til stede i komplekse ekstrakter og interagerer med immobiliserede transmembranreceptorer. Cellulær membranaffinitetskromatografikolonner fremskynder identifikationen af biologisk aktive forbindelser, der er til stede i komplekse blandinger.Anvendelsen af cellulære membranaffinitetskromatografikolonner kan være af særlig interesse for dem, der er interesseret i identifikation af farmakologisk aktive forbindelser, der er til stede i komplekse naturlige matricer, såsom plante-, svampe- eller bakterieekstrakter. Til at begynde med fremstilles 200 millimolær benzamidinopløsning ved at opløse 120 benzamidin i fem ml ultrarent deioniseret vand. Forbered en 10 millimolær PMSF-stamopløsning ved at opløse 0,017 gram PMSF i 10 ml ethanol i en stinkhætte.Forbered 100X proteasehæmmercocktail ved at opløse kommercielt tilgængelig proteasehæmmerblanding i en milliliter ultrarent deioniseret vand. Bland grundigt og aliquot 200 til 300 mikroliter af cocktailen. Forbered 100 millimolær ATP-stamopløsning ved at opløse 55.114 mg ATP-dinatriumsalthydrat i en milliliter af det ioniserede ultrarene vand.Bland grundigt og aliquot 100 mikroliter af blandingen. Forbered buffer ved at opløse 3,03 gram Tris-HCL, 2,9 gram natriumchlorid, 0,22 gram calciumchlorid vandfrit, 0,2 gram magnesiumchloridhexahydrat og 0,19 gram kaliumchlorid i 500 ml ultrarent deioniseret vand. Forbered homogeniseringsbuffer ved at blande 17,3 ml Tris-bufferen med 0,3 ml benzamidinstamopløsning, 0,2 ml PMSF-stamopløsning, 0,2 ml proteasehæmmercocktail, 20 mikroliter ATP-stamopløsning, to ml glycerol og 0,029 gram EDTA.Juster pH til 7,4 ved hjælp af saltsyreopløsning. Spin ned cellerne høstet ved fire grader Celsius i fem minutter ved 400 x g og fjern supernatanten og vask den resterende cellepille med 10 ml 1X pH 7,4 iskold PBS. Kassér supernatanten og tilsæt 20 ml homogeniseringsbuffer.Placer det koniske rør på is. Overfør cellesuspensionen til en 40 ml Dounce homogenisatorvævskværn, homogeniser suspensionen manuelt på is ved hjælp af 40 op og ned pestleslag. Overfør homogeniseret cellesuspension til et 50 ml konisk rør, kassér pelleten og overfør supernatanten til et nyt konisk rør.Gem cellemembranpillen og kassér supernatanten. Forbered opløselighedsbuffer ved at blande 8,7 ml bufferopløsning med 0,1 ml PMSF-stamopløsning, 0,15 ml benzamidinstamopløsning, 0,1 ml proteasehæmmercocktail, 10 mikroliter ATP-stamopløsning, en milliliter glycerol og 0,2 gram natriumkolat. Overfør opløselighedsbufferen ind i det koniske rør med cellemembranfragmenter.Og resuspend pellet. Drej den resulterende blanding ved 150 rpm ved fire grader Celsius i 18 timer. Efter 18 timer centrifugeres opløselighedsblandingen ved fire grader Celsius i 30 minutter ved 47.900 x g.Tilsæt 100 mg IAM. Personlig computer. DD2-partikler til supernatanten og roterer den resulterende suspensionsblanding ved 150 o / min ved fire grader Celsius i en time. Forbered dialysebuffer i fire liter ultrarent deioniseret vand ved at tilsætte 24 gram Tris-HCI, 23,4 gram natriumchlorid, 0,06 gram calciumchlorid, 5,85 gram EDTA og 0,07 gram PMSF.PMSF opløses først i et lille volumen ethanol, og tilsæt derefter langsomt i bægerglasset med bufferen. Skær 10 centimeter cellulosemembrandialyseslange for at forberede dialyserør, og overfør suspensionen indeholdende IAM. Personlig computer. DD2-partikler og cellemembranfragmenter ind i dialyserøret.Luk begge ender af dialyserøret med dialyseslangeklip. Anbring dialyserøret i dialysebufferen. Efter 24 timer anbringes dialyseslangen i den frisklavede dialysebuffer og fortsætter dialyse i yderligere 24 timer.Forbered 10 millimolær pH 7,4 ammoniumacetatbuffer, der vil blive brugt til at vaske IAM. Personlig computer. DD2-partikler og i kolonnekarakteriseringsforsøg ved at opløse 0,778 gram ammoniumacetat i en liter ultrarent deioniseret vand. Efter 48 timers dialyse skal du fjerne dialyserøret fra dialysebufferen og overføre indholdet af dialyserøret til et 15 ml konisk rør.Kassér supernatanten og vask den resterende pellet tre gange med 10 ml ammoniumacetatbuffer. Efter den tredje vask suspenderes den resterende pellet i en milliliter ammoniumacetatbuffer. Bland det grundigt, og brug den resulterende opslæmning til at pakke 5 x 20 glassøjlen for at give CMAC-kromatografikolonnen.For at pakke søjlen skal du placere et bundfilter, der tidligere er gennemblødt med ammoniumacetatbuffer, i filterholderen. Monter filterholderen i glassøjlen, og skru søjlehætten for at sikre holderens position. Placer søjlen lodret i en fingerklemme, og fastgør den i laboratoriestativet.Anbring et bægerglas under søjlen, overfør et lille volumen af opslæmningen langsomt ind i glassøjlen med en enkeltkanals pipetter, der holder pipettespidsen mod glassøjlevæggen. For at fremskynde pakningsprocessen skal du fjerne bufferen ovenfra det stationære bed med en mikropipette mellem hvert trin. Anbring et topfilter, og skru adapterenheden, så der ikke er nogen resterende buffer over den stationære fase.Fastgør adapterenhedens position med adapterlåsen. Tilslut søjlen til en højtydende væskekromatografipumpe, og for at vaske søjlen natten over med ammoniumacetatbuffer skal du indstille strømningshastigheden til 0,2 ml pr. Minut. For længere opbevaring skal du køre kolonnen med 0,05% natriumazidopløsning i ammoniumacetatbuffer, iført en laboratoriefrakke, sikkerhedsbriller og handsker, når du arbejder med natriumazid og opbevares ved fire grader Celsius.IAM.Personlig computer. DD2-partikler med immobiliseret neuroblastom TrkB-cellemembranfragmenter og i nærvær af BDNF resulterede i fluorescerende partikler. Der blev ikke observeret fluorescens i TrkB-nulcellemembranindkapslede IAM-partikler, eller når der ikke blev anvendt BDNF som i TrkB-cellemembranindkapslede IAM-partikler. Et funktionelt CMAC-kolonne typisk frontalt affinitetskromatogram med stigende 7, 8-DHF-koncentrationer på en millimolær, 750 nanomolær, 500 nanomolær og 300 nanomolær til de immobiliserede TrkB-receptorer er vist, hvilket viste en koncentrationsafhængig ændring i retentionstiden.En ikke-funktionel CMAC-kolonne viste manglen på koncentrationsafhængige ændringer i tilbageholdelsen af markørliganden. En CMAC-negativ kontrolkolonne blev fremstillet ved immobilisering af cellemembranfragmenter, der ikke udtrykte det målrettede protein for at udelukke ikke-specifikke interaktioner. Tilsætningen af 0,2% vandig Gotu kola-ekstrakt resulterede i en signifikant reduktion på 7, 8-DHF-retention, hvilket indikerer tilstedeværelsen af konkurrerende ligander for agonistbindingsstedet.Manglen på reduktion af 7, 8-DHF-retention på den CMAC-negative TrkB-null-kolonne bekræftede yderligere manglen på funktionelle TrkB-receptorer på denne kolonne. Den manglende peak kromatografi tilgang identificerede en forbindelse stærkt bevaret på TrkB kolonne, mens eluering tidligt på TrkB null kolonne, hvilket indikerer specifik interaktion. Det er afgørende at kende din kilde til receptorer til hurtig cellulær membranaffinitetskromatografikolonne.Sørg for at kontrollere litteraturen for korrekt design af homogeniserings- og opløselighedsbuffere. Cellulær membranaffinitetskromatografikolonne fremstillet i denne protokol blev brugt til at identificere nye potentielle lægemiddelhits og til at karakterisere arten af interaktionen mellem immobiliseret receptor og dens naturlige ligander.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metode til at visualisere og analysere membran interagerende proteiner af Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse af proteinkinaseaktivitet med radiomærket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktioneret ekstraktionsmetode til den omfattende analyse af metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop immobiliseret Metal affinitet kromatografi, rekonstitution og analyse af en Polyhistidine mærkede Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensning af grønkorn Translocon Protein komplekser ved hjælp af tryk på Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifikation af inositol fosfat eller Phosphoinositide interagerende proteiner ved affinitets kromatografi koblet til Western blot eller massespektrometri

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...