Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. werd ondersteund door de Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219 - International Postdoctoral Research Fellowship Program. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Center for Complimentary and Integrative Medicine van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer 1R41AT011716-01. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door de American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, Regis Technologies-subsidie aan L.C. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

1. Celkweek van SH-SY5Y neuroblastoomcellen (TrkB en TrkB-NULL (ouderlijke) cellijnen)
OPMERKING: Cellijnen (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) en SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 werden gekocht bij Kerafast. Gekweekte cellen worden gebruikt als bron van de transmembraanreceptoren die moeten worden geïmmobiliseerd voor de bereiding van CMAC-kolommen. In de volgende stappen wordt beschreven hoe u celmembraanfragme...

Identificatie van actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe mengsels van gespecialiseerde metabolieten is een zeer uitdagende taak23. Traditioneel worden individuele verbindingen geïsoleerd en wordt hun activiteit getest in verschillende testen. Deze aanpak is tijdrovend en kostbaar en leidt vaak tot isolatie en identificatie van de meest voorkomende en goed gekarakteriseerde verbindingen23. De momenteel gebruikte high-throughput screeningstests zijn sterk afhank...

Botanische mengsels zijn rijk aan farmacologisch actieve verbindingen1, die dienen als een goede bron voor de identificatie van nieuwe medicijnhits en leads 2,3,4,5. De ontdekking van nieuwe geneesmiddelen uit natuurlijke producten is een vruchtbare aanpak geweest en veel momenteel goedgekeurde geneesmiddelen zijn afkomstig van verbindingen die voor het eerst in de natuur zijn geïdentificeerd. De chemische diversiteit van natuurlijke verbindingen is moeilijk te evenaren door door de mens gemaakte bibliotheken van chemisch gesynthetiseerde moleculen. Veel natuurlijke verbindingen interageren met en moduleren menselijke eiwitdoelen en kunnen worden beschouwd als evolutionair geoptimaliseerde medicijnachtige moleculen6. Deze natuurlijke verbindingen zijn bijzonder geschikt voor de identificatie van geneesmiddellood voor gebruik bij neurologische aandoeningen6. Twee van de momenteel door de FDA goedgekeurde geneesmiddelen voor de behandeling van de ziekte van Alzheimer (AD) zijn afgeleid van natuurlijke alkaloïden, namelijk: galantamine en rivastigmine (een derivaat van fysostigmine)6. Levodopa, momenteel het meest voorgeschreven medicijn voor de ziekte van Parkinson, werd voor het eerst geïdentificeerd uit de brede boon (Vicia faba L.) 7. Pergolide en lisuride, dopaminerge receptoragonisten zijn de derivaten van natuurlijke moederkorenalkaloïden uit de parasitaire schimmel Claviceps purpurea8. Reserpine, een alkaloïde geïsoleerd uit Indiase slangenwortel (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) was een van de eerste antipsychotica9. Onlangs zijn ontregelde immuunrespons en systemische ontsteking in verband gebracht met de ontwikkeling van tal van neurologische aandoeningen, zoals depressieve stoornissen of neurodegeneratieve ziekten10. Een plantaardig dieet samen met andere leefstijlinterventies blijkt de cognitieve en functionele vaardigheden bij ouderen te verbeteren 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Bepaalde elektrofiele moleculen die behoren tot triterpenen en polyfenolen blijken ontstekingsreacties te moduleren in zowel in vitro als in vivo modellen12. Natuurlijke verbindingen die α,β-onverzadigde carbonyl (bijv. Curcumine, cinnamaldehyde) of isothiocyanaatgroep (bijv. Sulforafaan) bevatten, interfereren bijvoorbeeld met Toll-like receptor-4 (TLR4) dimerisatie en remmen de stroomafwaartse synthese van pro-inflammatoire cytokines in een muriene interleukine-3-afhankelijke pro-B-cellijn12,22 . Epidemiologisch bewijs wijst er sterk op dat fytochemicaliën in de voeding, aanwezig in complexe voedselmatrices, ook een levensvatbare bron van nieuwe geneesmiddelen kunnen vormen6.
Een van de belangrijkste obstakels bij de identificatie van biologisch actieve moleculen die aanwezig zijn in plantenextracten, waaronder plantaardig voedsel, is de complexiteit van de onderzochte monsters. Traditioneel worden de individuele verbindingen geïsoleerd, gezuiverd en vervolgens getest op biologische activiteit. Deze aanpak leidt meestal tot de identificatie van de meest voorkomende en goed gekarakteriseerde verbindingen. Fenotypische geneesmiddelontdekkingsbenaderingen zonder een gedefinieerd moleculair doelwit zijn afhankelijk van de biogeleide fractionering van complexe mengsels23. In deze benadering wordt een extract gefractioneerd in minder complexe subfracties die vervolgens worden getest in fenotypische assays. De isolatie en zuivering van actieve verbindingen worden geleid door biologische activiteit die in de test wordt geverifieerd. De kennis van de identiteit van een bepaald geneesmiddeldoel kan de identificatie van farmacologisch actieve verbindingen in complexe mengsels aanzienlijk versnellen. Die benaderingen zijn meestal gebaseerd op de immobilisatie van het moleculaire doelwit, bijvoorbeeld een enzym, op een vast oppervlak, zoals magnetische kralen23. De geïmmobiliseerde doelen worden vervolgens gebruikt in de screeningsexperimenten die resulteren in de isolatie van verbindingen die interageren met het doelwit. Hoewel deze benadering op grote schaal is gebruikt bij de identificatie van verbindingen die gericht zijn op cytosolische eiwitten, is deze minder vaak toegepast bij de identificatie van chemicaliën die interageren met transmembraaneiwitten (TMP's)23. Een extra uitdaging bij de immobilisatie van TMP's komt voort uit het feit dat de activiteit van het eiwit afhankelijk is van de interactie met celmembraanfosfolipiden en andere moleculen in de dubbellaag zoals cholesterol 23,24. Het is belangrijk om deze subtiele interacties tussen eiwitten en hun inheemse fosfolipide dubbellaagse omgeving te behouden bij het immobiliseren van het transmembraandoel.
Bij cellulaire membraanaffiniteit chromatografie (CMAC) worden celmembraanfragmenten, en niet gezuiverde eiwitten, geïmmobiliseerd op de stationaire fasedeeltjes van het kunstmatige membraan (IAM) 23. IAM stationaire fasen worden bereid door fosfatidylcholine analogen covalent te binden aan silica. Onlangs zijn nieuwe klassen van IAM stationaire fasen ontwikkeld waarin vrije amine- en silanolgroepen end-capped (IAM. PC. DD2 deeltjes). Tijdens cmac-kolommenvoorbereiding worden celmembraanfragmenten geïmmobiliseerd op het oppervlak van IAM-deeltjes door adsorptie.
CMAC-kolommen zijn tot nu toe gebruikt om verschillende klassen TMP's te immobiliseren, waaronder ionkanalen (bijv. Nicotinereceptoren), GPCR's (bijv. Opioïde receptoren), eiwittransporters (bijv. P-glycoproteïne), enz.24. De geïmmobiliseerde eiwitdoelen zijn gebruikt bij de karakterisering van de farmacodynamiek (bijv. Dissociatieconstante, Kd) of bij het bepalen van bindingskinetiek (kaan en kuit) van liganden met kleine moleculen die interageren met het doelwit, evenals bij het proces van identificatie van potentiële nieuwe geneesmiddelkabels die aanwezig zijn in complexe matrices24 . Hier presenteren we de voorbereiding van CMAC-kolommen met de geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (TrkB), die naar voren is gekomen als een levensvatbaar doelwit voor medicijnontdekking voor tal van aandoeningen van het zenuwstelsel.
Eerdere studies toonden aan dat de activering van de van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) / TrkB-route geassocieerd is met de verbetering van bepaalde neurologische aandoeningen, zoals AD of depressievestoornis 25,26,27,28. Er werd gemeld dat BDNF-niveaus en de receptor TrkB-expressie afnemen in AD, en vergelijkbare reducties verminderen de hippocampusfunctie in diermodellen van AD29. Verlaagde niveaus van BDNF werden gemeld in serum en hersenen van AD-patiënten 30,31,32. Tau-overexpressie of hyperfosforylering bleken de BDNF-expressie in primaire neuronen en AD-diermodellen te downreguleren 33,34,35. Bovendien werd gemeld dat BDNF beschermende effecten had op β-amyloïde geïnduceerde neurotoxiciteit in vitro en in vivo36. Directe toediening van BDNF in de hersenen van ratten bleek het leren en geheugen te verhogen bij cognitief gehandicapte dieren37. BDNF /TrkB kwam naar voren als een geldig doelwit voor het verbeteren van neurologische en psychiatrische stoornissen, waaronder AD28,38. Het richten op de BDNF/TrkB-signaleringsroute voor de ontwikkeling van therapieën in AD zal ons begrip van de ziekte mogelijk verbeteren39. Helaas kan BDNF zelf niet als behandeling worden gebruikt vanwege de slechte farmacokinetische eigenschappen en nadelige bijwerkingen40. Kleine molecuulactivatoren van TrkB/BDNF-routes zijn onderzocht als potentiële TrkB-liganden 41,42,43. Van de geteste agonisten met kleine moleculen is aangetoond dat 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) de BDNF / TrkB-route 41,44,45,46 activeert. Een derivaat van 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diyl bis(methylcarbamaat)) wordt momenteel overwogen als een mogelijk medicijn voor AD47. Onlangs werd aangetoond dat verschillende antidepressiva werken door direct te binden aan TrkB en BDNF-signalering te bevorderen, waardoor het belang van het nastreven van TrkB als een geldig doelwit voor de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen verder wordt benadrukt48.
Het protocol beschrijft het proces van het samenstellen van de functionele TrkB-kolom en de TrkB-NULL-negatieve besturingskolom. De kolommen worden gekarakteriseerd met behulp van een bekend natuurproduct kleinmoleculair ligand: 7,8-DHF. Daarnaast beschrijven we het proces van het screenen van complexe matrices, met behulp van plantenextract als voorbeeld, voor de identificatie van verbindingen die interageren met TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Chemicaliën gesynthetiseerd door planten, schimmels, bacteriën en ongewervelde zeedieren zijn een rijke bron van nieuwe medicijnhits en -leads. Geneesmiddelen zoals statines, penicilline, paclitaxel, rapamycine of artemisinine, vaak gebruikt in de medische praktijk, zijn voor het eerst geïdentificeerd en geïsoleerd uit natuurlijke producten. De identificatie en isolatie van biologisch actieve gespecialiseerde metabolieten uit natuurlijke bronnen is echter een uitdagend en tijdrovend proces. Traditioneel worden individuele metabolieten geïsoleerd en gezuiverd uit complexe mengsels, na de extractie van biomassa. Vervolgens worden de geïsoleerde moleculen getest in functionele assays om hun biologische activiteit te verifiëren. Hier presenteren we het gebruik van cellulaire membraanaffiniteitschromatografie (CMAC) -kolommen om biologisch actieve verbindingen rechtstreeks uit complexe mengsels te identificeren. CMAC-kolommen maken de identificatie mogelijk van verbindingen die interageren met geïmmobiliseerde functionele transmembraaneiwitten (TMP's) ingebed in hun inheemse fosfolipide dubbellaagse omgeving. Dit is een gerichte aanpak, die vereist dat men de TMP kent waarvan men de activiteit wil moduleren met het nieuw geïdentificeerde kandidaat-geneesmiddel met kleine moleculen. In dit protocol presenteren we een aanpak om CMAC-kolommen voor te bereiden met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B (TrkB), die naar voren is gekomen als een levensvatbaar doelwit voor het ontdekken van geneesmiddelen voor tal van aandoeningen van het zenuwstelsel. In dit artikel bieden we een gedetailleerd protocol om de CMAC-kolom samen te stellen met geïmmobiliseerde TrkB-receptoren met behulp van neuroblastoomcellijnen die TrkB-receptoren overexpressie geven. We presenteren verder de aanpak om de functionaliteit van de kolom en het gebruik ervan bij de identificatie van gespecialiseerde plantenmetabolieten die interageren met TrkB-receptoren te onderzoeken.

Volgens het protocol werden twee CMAC-chromatografische kolommen samengesteld: één met de geïmmobiliseerde SH-SY5Y neuroblastoomcelmembraanfragmenten met overexpressie TrkB en één met SH-SY5Y TrkB-NULL celmembraanfragmenten. De correct geassembleerde CMAC-kolom is weergegeven in figuur 1 en de stappen die betrokken zijn bij immobilisatie van celmembraanfragmenten zijn weergegeven in figuur 2.
Sinds de immobilisatie van TrkB recep...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Het protocol beschrijft de bereiding van celmembraanaffiniteitschromatografie (CMAC) kolommen met geïmmobiliseerde celmembraanfragmenten die functionele transmembraantropomyosinekinasereceptor B-eiwitten bevatten. Het gebruik van CMAC-kolommen bij de identificatie van gespecialiseerde plantenmetabolieten die interageren met deze receptoren en aanwezig zijn in complexe natuurlijke mengsels wordt ook uitgelegd.

Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen om gespecialiseerde plantenmetabolieten te identificeren die interageren met geïmmobiliseerde tropomyosinekinasereceptor B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Deze verticale presenteert belangrijke stappen in het samenstellen van celmembraanaffiniteitschromatografiekolommen met functionele transmembraanreceptoren. Deze kolommen kunnen worden gebruikt voor de identificatie van kleine moleculen die aanwezig zijn in complexe extracten en interageren met geïmmobiliseerde transmembraanreceptoren. Cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen versnellen de identificatie van biologisch actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe mengsels.Het gebruik van cellulaire membraanaffiniteitschromatografiekolommen kan van bijzonder belang zijn voor diegenen die geïnteresseerd zijn in de identificatie van farmacologisch actieve verbindingen die aanwezig zijn in complexe natuurlijke matrices, zoals planten-, schimmel- of bacteriële extracten. Bereid om te beginnen 200 millimolar benzamidine stockoplossing door 120 benzamidine op te lossen in vijf milliliter ultrapuur gedeïoniseerd water. Bereid een 10 millimolaire PMSF-stamoplossing door 0,017 gram PMSF op te lossen in 10 milliliter ethanol in een zuurkast.Bereid 100X proteasenremmer cocktail door het oplossen van commercieel verkrijgbare proteaseremmer mengsel in een milliliter ultrapure gedeïoniseerd water. Meng grondig en aliquot 200 tot 300 microliter van de cocktail. Bereid 100 millimolaire ATP-stamoplossing door 55,114 milligram ATP-dinatriumzouthydraat op te lossen in één milliliter van het geïoniseerde ultrapuur water.Meng grondig en aliquot 100 microliter van het mengsel. Bereid buffer voor door 3,03 gram Tris-HCL, 2,9 gram natriumchloride, 0,22 gram calciumchloride watervrij, 0,2 gram magnesiumchloridehexahydraat en 0,19 gram kaliumchloride op te lossen in 500 milliliter ultrapuur gedeïoniseerd water. Bereid homogenisatiebuffer door 17,3 milliliter van de Tris-buffer te mengen met 0,3 milliliter benzamidine-stamoplossing, 0,2 milliliter PMSF-stamoplossing, 0,2 milliliter proteasenremmercocktail, 20 microliter ATP-stamoplossing, twee milliliter glycerol en 0,029 gram EDTA.Stel de pH in op 7,4 met behulp van zoutzuuroplossing. Draai de cellen geoogst bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten op 400 x g en verwijder het supernatant en was de resterende celkorrel met 10 milliliter 1X pH 7,4 ijskoude PBS. Gooi het supernatant weg en voeg 20 milliliter homogenisatiebuffer toe.Plaats de conische buis op ijs. Breng de celsuspensie over in een 40 milliliter Dounce homogenisator weefselslijper, homogeniseer de suspensie handmatig op ijs met behulp van 40 op en neer stamperslagen. Breng gehomogeniseerde celsuspensie over in een conische buis van 50 milliliter, gooi de pellet weg en breng het supernatant over naar een nieuwe conische buis.Bewaar de celmembraankorrel en gooi het supernatant weg. Bereid oplosbuffer door 8,7 milliliter van de bufferoplossing te mengen met 0,1 milliliter PMSF-stamoplossing, 0,15 milliliter benzamidine-stamoplossing, 0,1 milliliter proteasenremmercocktail, 10 microliter ATP-stamoplossing, één milliliter glycerol en 0,2 gram natriumkorf. Breng de oplosbuffer over in de conische buis met celmembraanfragmenten.En resuspend de pellet. Draai het resulterende mengsel bij 150 RPM bij vier graden Celsius gedurende 18 uur. Centrifugeer na 18 uur het oplosbaarheidsmengsel bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten bij 47, 900 x g.Voeg 100 milligram IAM toe. PC. DD2-deeltjes naar het supernatant en roteer het resulterende suspensiemengsel bij 150 RPM bij vier graden Celsius gedurende één uur. Bereid dialysebuffer voor in vier liter ultrapuur gedeïoniseerd water door 24 gram Tris-HCl, 23,4 gram natriumchloride, 0,06 gram calciumchloride, 5,85 gram EDTA en 0,07 gram PMSF toe te voegen.Los PMSF eerst op in een klein volume ethanol en voeg vervolgens langzaam toe aan het bekerglas met de buffer. Snijd 10 centimeter cellulosemembraandialysebuis om de dialysebuis voor te bereiden en breng de suspensie met IAM over. PC. DD2-deeltjes en celmembraanfragmenten in de dialysebuis.Sluit beide uiteinden van de dialysebuis met dialysebuisclips. Plaats de dialysebuis in de dialysebuffer. Plaats na 24 uur de dialyseslang in de vers voorbereide dialysebuffer en ga nog 24 uur door met dialyse.Bereid 10 millimolaire pH 7,4 ammoniumacetaatbuffer voor die zal worden gebruikt om de IAM te wassen. PC. DD2-deeltjes en in kolomkarakteriseringsexperimenten door 0,778 gram ammoniumacetaat op te lossen in één liter ultrapuur gedeïoniseerd water. Verwijder na 48 uur dialyse de dialysebuis uit de dialysebuffer en breng de inhoud van de dialysebuis over in een conische buis van 15 milliliter.Gooi het supernatant weg en was de resterende pellet drie keer met 10 milliliter ammoniumacetaatbuffer. Na de derde wasbeurt, resuspend de resterende pellet in een milliliter ammoniumacetaatbuffer. Meng het grondig en gebruik de resulterende slurry om de 5 x 20 glazen kolom te verpakken om de CMAC-chromatografiekolom te verkrijgen.Om de kolom in te pakken, plaatst u een bodemfilter dat eerder is gedrenkt met ammoniumacetaatbuffer in de filterhouder. Plaats de filterhouder in de glazen kolom en schroef de kolomdop om de positie van de houder vast te zetten. Plaats de kolom verticaal in een vingerklem en zet hem vast in de labstandaard.Plaats een bekerglas onder de kolom, breng een klein volume van de slurry langzaam over in de glazen kolom met een pipetter met één kanaal die de pipetpunt tegen de glazen kolomwand houdt. Om het verpakkingsproces te versnellen, verwijdert u de buffer van boven het stationaire bed met een micropipette tussen elke stap. Plaats een bovenfilter en schroef de adaptereenheid zo dat er geen buffer boven de stationaire fase overblijft.Bevestig de positie van de adaptereenheid met de adaptervergrendeling. Sluit de kolom aan op een hoogwaardige vloeistofchromatografiepomp en stel het debiet in op 0,2 milliliter per minuut om de kolom 's nachts te wassen met een ammoniumacetaatbuffer. Voor langere opslag, voer de kolom uit met 0,05% natriumazide-oplossing in ammoniumacetaatbuffer, draag een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen bij het werken met natriumazide en bewaar bij vier graden Celsius.IAM.PC. DD2-deeltjes met geïmmobiliseerde neuroblastoom TrkB-celmembraanfragmenten en in aanwezigheid van BDNF resulteerden in fluorescerende deeltjes. Er werd geen fluorescentie waargenomen in TrkB nulcelmembraan ingekapselde IAM-deeltjes of wanneer geen BDNF werd gebruikt zoals in TrkB-celmembraan ingekapselde IAM-deeltjes. Een functionele CMAC-kolom wordt een typisch frontaal affiniteitschromatogram getoond van toenemende 7, 8-DHF-concentraties van één millimolar, 750 nanomolair, 500 nanomolair en 300 nanomolair voor de geïmmobiliseerde TrkB-receptoren, die een concentratieafhankelijke verandering in retentietijd vertoonden.Een niet-functionele CMAC-kolom toonde het gebrek aan concentratieafhankelijke veranderingen in het vasthouden van het markerligand. Een CMAC-negatieve controlekolom werd voorbereid door celmembraanfragmenten te immobiliseren, waarbij het beoogde eiwit niet tot expressie werd gebracht om niet-specifieke interacties uit te sluiten. De toevoeging van 0,2% waterig Gotu kola-extract resulteerde in een significante vermindering van 7, 8-DHF-retentie, wat wijst op de aanwezigheid van concurrerende liganden voor de agonistbindingsplaats.Het ontbreken van reductie van 7, 8-DHF retentie op de CMAC negatieve TrkB nulkolom bevestigde verder het gebrek aan functionele TrkB receptoren op deze kolom. De ontbrekende piekchromatografiebenadering identificeerde een verbinding die sterk werd vastgehouden op de TrkB-kolom, terwijl de TrkB-nulkolom vroeg werd geëluuteerd, wat duidt op specifieke interactie. Het is cruciaal om uw bron van receptoren voor snelle cellulaire membraanaffiniteit chromatografie kolom te kennen.Zorg ervoor dat u de literatuur controleert om homogenisatie- en oplosbuffers goed te ontwerpen. Cellulaire membraanaffiniteit chromatografie kolom voorbereid in dit protocol werd gebruikt om nieuwe potentiële drug hits te identificeren en om de aard van de interactie tussen geïmmobiliseerde receptor en zijn natuurlijke liganden te karakteriseren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analyse van proteïnekinaseactiviteit met radiolabelde ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop geïmmobiliseerd Metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een Polyhistidine gecodeerde Metalloenzyme voor de Undergraduate laboratorium

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affiniteit zuivering van Chloroplast Translocon eiwitcomplexen met behulp van de Tag van de TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...