Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. a été soutenu par le Conseil de la recherche scientifique et technologique de Turquie (TUBITAK) 2219 - Programme international de bourses de recherche postdoctorale. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Center for Complementarary and Integrative Medicine des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution 1R41AT011716-01. Ce travail a également été partiellement soutenu par l’American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, la subvention Regis Technologies à L.C. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.

1. Culture cellulaire de cellules de neuroblastome SH-SY5Y (lignées cellulaires TrkB et TrkB-NULL (parentales))
REMARQUE: Lignées cellulaires (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) et SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL)))49,50 ont été achetées auprès de Kerafast. Les cellules cultivées sont utilisées comme source des récepteurs transmembranaires à immobiliser pour la préparation des colonnes CMAC. Les étapes suiva...

L’identification des composés actifs présents dans les mélanges complexes de métabolites spécialisés est une tâche très difficile23. Traditionnellement, les composés individuels sont isolés et leur activité est testée dans différents essais. Cette approche est longue et coûteuse et conduit souvent à l’isolement et à l’identification des composés les plus abondants et les mieux caractérisés23. Les essais de criblage à haut débit actuellement utili...

Les mélanges botaniques sont riches en composés pharmacologiquement actifs1, servant de bonne source pour l’identification de nouveaux médicaments et conduit 2,3,4,5. La découverte de nouveaux médicaments à partir de produits naturels a été une approche fructueuse et de nombreux médicaments actuellement approuvés proviennent de composés identifiés pour la première fois dans la nature. La diversité chimique des composés naturels est difficile à égaler par des bibliothèques artificielles de molécules synthétisées chimiquement. De nombreux composés naturels interagissent avec et modulent des cibles protéiques humaines et peuvent être considérés comme des molécules semblables à des médicaments optimisées sur le plan de l’évolution6. Ces composés naturels sont particulièrement bien adaptés à l’identification des plombs médicamenteux à utiliser dans les troubles neurologiques6. Deux des médicaments actuellement approuvés par la FDA pour la prise en charge de la maladie d’Alzheimer (MA) sont dérivés d’alcaloïdes naturels, à savoir: la galantamine et la rivastigmine (un dérivé de la physostigmine)6. La L-DOPA, actuellement le médicament le plus couramment prescrit pour la maladie de Parkinson, a été identifiée pour la première fois à partir de la fève (Vicia faba L.) 7. Pergolide et lisuride, agonistes des récepteurs dopaminergiques sont les dérivés des alcaloïdes naturels de l’ergot du champignon parasite Claviceps purpurea8. La réserpine, un alcaloïde isolé de la racine de serpent indienne (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) a été l’un des premiers médicaments antipsychotiques9. Récemment, la réponse immunitaire dérégulée et l’inflammation systémique ont été liées au développement de nombreuses affections neurologiques, telles que les troubles dépressifs majeurs ou les maladies neurodégénératives10. Un régime à base de plantes ainsi que d’autres interventions sur le mode de vie ont été trouvés pour améliorer les capacités cognitives et fonctionnelles chez lespersonnes âgées 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Certaines molécules électrophiles appartenant aux triterpènes et aux polyphénols ont été trouvées pour moduler les réponses inflammatoires dans les modèles in vitro et in vivo 12. Par exemple, les composés naturels contenant du α β carbonyle insaturé (p. ex., curcumine, cinnamaldéhyde) ou du groupe isothiocyanate (p. ex., sulforaphane) interfèrent avec la dimérisation du récepteur 4 de type Toll (TLR4) inhibant la synthèse en aval de cytokines pro-inflammatoires dans une lignée cellulaire pro-B dépendante de l’interleukine-3 murine12,22 . Les données épidémiologiques indiquent clairement que les composés phytochimiques alimentaires, présents dans les matrices alimentaires complexes, peuvent également constituer une source viable de nouveaux médicaments6.
L’un des principaux obstacles à l’identification des molécules biologiquement actives présentes dans les extraits de plantes, y compris les aliments à base de plantes, est la complexité des échantillons étudiés. Traditionnellement, les composés individuels sont isolés, purifiés et ensuite testés pour leur activité biologique. Cette approche conduit généralement à l’identification des composés les plus abondants et les mieux caractérisés. Les approches phénotypiques de découverte de médicaments sans cible moléculaire définie reposent sur le fractionnement bioguidé de mélanges complexes23. Dans cette approche, un extrait est fractionné en sous-fractions moins complexes qui sont ensuite testées dans des essais phénotypiques. L’isolement et la purification des composés actifs sont guidés par l’activité biologique vérifiée dans le test. La connaissance de l’identité d’une cible médicamenteuse spécifiée peut accélérer considérablement l’identification des composés pharmacologiquement actifs présents dans les mélanges complexes. Ces approches sont généralement basées sur l’immobilisation de la cible moléculaire, par exemple, une enzyme, sur une surface solide, comme les billes magnétiques23. Les cibles immobilisées sont ensuite utilisées dans les expériences de criblage, ce qui permet d’isoler les composés interagissant avec la cible. Bien que cette approche ait été largement utilisée dans l’identification de composés ciblant les protéines cytosoliques, elle a été moins couramment appliquée dans l’identification des produits chimiques interagissant avec les protéines transmembranaires (TMP)23. Un défi supplémentaire dans l’immobilisation des TMP provient du fait que l’activité de la protéine dépend de son interaction avec les phospholipides de la membrane cellulaire et d’autres molécules dans la bicouche telles que le cholestérol23,24. Il est important de préserver ces interactions subtiles entre les protéines et leur environnement bicouche phospholipidique natif lorsque l’on tente d’immobiliser la cible transmembranaire.
Dans la chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire (CMAC), les fragments de membrane cellulaire, et non les protéines purifiées, sont immobilisés sur les particules de phase stationnaire de la membrane artificielle (IAM)23. Les phases stationnaires IAM sont préparées en liant de manière covalente des analogues de la phosphatidylcholine sur de la silice. Récemment, de nouvelles classes de phases stationnaires IAM ont été développées dans lesquelles les groupes amine et silanol libres sont plafonnés (IAM. PC. Particules DD2). Au cours de la préparation des colonnes CMAC, des fragments de membrane cellulaire sont immobilisés à la surface des particules IAM par adsorption.
Les colonnes de l’ACMC ont été utilisées à ce jour pour immobiliser différentes classes de TMP, y compris les canaux ioniques (p. ex., les récepteurs nicotiniques), les RCPG (p. ex., les récepteurs opioïdes), les transporteurs de protéines (p. ex., p-glycoprotéine), etc.24. Les cibles protéiques immobilisées ont été utilisées dans la caractérisation de la pharmacodynamique (p. ex., constante de dissociation, Kd) ou dans la détermination de la cinétique de liaison (kon et koff) de ligands de petites molécules interagissant avec la cible ainsi que dans le processus d’identification de nouveaux médicaments potentiels présents dans des matrices complexes24 . Nous présentons ici la préparation de colonnes CMAC avec le récepteur immobilisé de la tropomyosine kinase B (TrkB), qui est devenu une cible viable pour la découverte de médicaments pour de nombreux troubles du système nerveux.
Des études antérieures ont montré que l’activation de la voie du facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) / TrkB est associée à l’amélioration de certaines affections neurologiques, telles que la MA ou le trouble dépressif majeur 25,26,27,28. Il a été rapporté que les niveaux de BDNF et son expression de récepteur TrkB diminuent dans la MA, et des réductions similaires altèrent la fonction hippocampique dans les modèles animaux de AD29. Une diminution des taux de BDNF a été rapportée dans le sérum et le cerveau des patients atteints de MA 30,31,32. La surexpression de Tau ou l’hyperphosphorylation régulent à la baisse l’expression du BDNF dans les neurones primaires et les modèles animaux AD 33,34,35. De plus, le BDNF aurait des effets protecteurs sur la neurotoxicité induite par la β-amyloïde in vitro et in vivo36. Il a été démontré que l’administration directe de BDNF dans le cerveau du rat augmentait l’apprentissage et la mémoire chez les animaux atteints de troubles cognitifs37. BdNF /TrkB est apparu comme une cible valide pour améliorer les troubles neurologiques et psychiatriques, y compris AD28,38. Le ciblage de la voie de signalisation BDNF/TrkB pour le développement de thérapies dans la MA améliorera potentiellement notre compréhension de la maladie39. Malheureusement, le BDNF lui-même ne peut pas être utilisé comme traitement en raison de ses mauvaises propriétés pharmacocinétiques et de ses effets secondaires indésirables40. Les activateurs de petites molécules des voies TrkB/BDNF ont été explorés en tant que ligands TrkB potentiels 41,42,43. Parmi les agonistes de petites molécules testés, la 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF), il a été démontré qu’il active la voie BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un dérivé du 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phényl-4H-chromene-7,8-diyl bis(méthylcarbamate)) est actuellement à l’étude comme médicament possible pour AD47. Récemment, il a été démontré que plusieurs antidépresseurs agissent en se liant directement au TrkB et en favorisant la signalisation du BDNF, soulignant davantage l’importance de poursuivre le TrkB comme cible valide pour traiter divers troubles neurologiques48.
Le protocole décrit le processus d’assemblage de la colonne TrkB fonctionnelle et de la colonne de contrôle négatif TrkB-NULL. Les colonnes sont caractérisées à l’aide d’un ligand de petite molécule de produit naturel connu: le 7,8-DHF. En outre, nous décrivons le processus de criblage de matrices complexes, en utilisant l’extrait de plante comme exemple, pour l’identification des composés interagissant avec TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Les produits chimiques synthétisés par les plantes, les champignons, les bactéries et les invertébrés marins ont été une riche source de nouveaux médicaments et de pistes. Des médicaments tels que les statines, la pénicilline, le paclitaxel, la rapamycine ou l’artémisinine, couramment utilisés dans la pratique médicale, ont d’abord été identifiés et isolés à partir de produits naturels. Cependant, l’identification et l’isolement des métabolites spécialisés biologiquement actifs à partir de sources naturelles est un processus difficile et long. Traditionnellement, les métabolites individuels sont isolés et purifiés à partir de mélanges complexes, après l’extraction de la biomasse. Par la suite, les molécules isolées sont testées dans des tests fonctionnels pour vérifier leur activité biologique. Nous présentons ici l’utilisation de colonnes de chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire (CMAC) pour identifier les composés biologiquement actifs directement à partir de mélanges complexes. Les colonnes CMAC permettent d’identifier les composés interagissant avec les protéines transmembranaires fonctionnelles (TMP) immobilisées intégrées dans leur environnement bicouche phospholipidique natif. Il s’agit d’une approche ciblée, qui nécessite de connaître le TMP dont on entend moduler l’activité avec le candidat médicament à petite molécule nouvellement identifié. Dans ce protocole, nous présentons une approche pour préparer des colonnes CMAC avec le récepteur B immobilisé de la tropomyosine kinase (TrkB), qui est devenu une cible viable pour la découverte de médicaments pour de nombreux troubles du système nerveux. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé pour assembler la colonne CMAC avec des récepteurs TrkB immobilisés en utilisant des lignées cellulaires de neuroblastome surexprimant les récepteurs TrkB. Nous présentons en outre l’approche pour étudier la fonctionnalité de la colonne et son utilisation dans l’identification de métabolites végétaux spécialisés interagissant avec les récepteurs TrkB.

Suivant le protocole, deux colonnes chromatographiques du CMAC ont été assemblées : l’une avec les fragments de membrane cellulaire du neuroblastome SH-SY5Y immobilisés avec TrkB surexprimé et l’autre avec des fragments de membrane cellulaire SH-SY5Y TrkB-NULL. La colonne CMAC correctement assemblée est présentée à la figure 1 et les étapes impliquées dans l’immobilisation des fragments de membrane cellulaire sont présentées à la figure 2.</p...

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Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Le protocole décrit la préparation de colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire (CMAC) avec des fragments de membrane cellulaire immobilisés contenant des protéines fonctionnelles du récepteur B de la tropomyosine kinase transmembranaire. L’utilisation des colonnes CMAC dans l’identification des métabolites végétaux spécialisés interagissant avec ces récepteurs et présents dans des mélanges naturels complexes est également expliquée.

Colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire pour identifier les métabolites végétaux spécialisés interagissant avec le récepteur B de la tropomyosine kinase immobilisée

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Cette verticale présente des étapes importantes dans l’assemblage de colonnes de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire avec des récepteurs transmembranaires fonctionnels. Ces colonnes peuvent être utilisées pour l’identification de petites molécules présentes dans des extraits complexes et interagissant avec des récepteurs transmembranaires immobilisés. Les colonnes de chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire accélèrent l’identification des composés biologiquement actifs présents dans les mélanges complexes.L’utilisation de colonnes de chromatographie d’affinité sur membrane cellulaire peut être particulièrement intéressante pour ceux qui s’intéressent à l’identification des composés pharmacologiquement actifs présents dans des matrices naturelles complexes, telles que des extraits végétaux, fongiques ou bactériens. Pour commencer, préparez une solution mère de benzamidine de 200 millimolaires en dissolvant 120 de benzamidine dans cinq millilitres d’eau désionisée ultrapure. Préparer une solution mère de PMSF de 10 millimolaires en dissolvant 0,017 gramme de PMSF dans 10 millilitres d’éthanol dans une hotte aspirante.Préparez le cocktail d’inhibiteurs de protéases 100X en dissolvant le mélange d’inhibiteurs de protéase disponible dans le commerce dans un millilitre d’eau désionisée ultrapure. Bien mélanger et aliquoter 200 à 300 microlitres du cocktail. Préparer une solution mère d’ATP de 100 millimolaires en dissolvant 55,114 milligrammes d’hydrate de sel disodique d’ATP dans un millilitre de l’eau ultrapure ionisée.Bien mélanger et aliquoter 100 microlitres du mélange. Préparer le tampon en dissolvant 3,03 grammes de Tris-HCL, 2,9 grammes de chlorure de sodium, 0,22 gramme de chlorure de calcium anhydre, 0,2 gramme de chlorure de magnésium hexahydraté et 0,19 gramme de chlorure de potassium dans 500 millilitres d’eau désionisée ultrapure. Préparer le tampon d’homogénéisation en mélangeant 17,3 millilitres du tampon Tris avec 0,3 millilitre de solution mère de benzamidine, 0,2 millilitre de solution mère PMSF, 0,2 millilitres de cocktail inhibiteur de protéases, 20 microlitres de solution mère d’ATP, deux millilitres de glycérol et 0,029 gramme d’EDTA.Ajuster le pH à 7,4 à l’aide d’une solution d’acide chlorhydrique. Faites tourner les cellules récoltées à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes à 400 x g et retirez le surnageant et lavez la pastille cellulaire restante avec 10 millilitres de PBS glacé 1X pH 7,4. Jeter le surnageant et ajouter 20 millilitres de tampon d’homogénéisation.Placez le tube conique sur de la glace. Transférez la suspension cellulaire dans un broyeur de tissu homogénéisateur Dounce de 40 millilitres, homogénéisez la suspension manuellement sur de la glace à l’aide de 40 coups de pilon de haut en bas. Transférer la suspension cellulaire homogénéisée dans un tube conique de 50 millilitres, jeter la pastille et transférer le surnageant dans un nouveau tube conique.Conservez la pastille de membrane cellulaire et jetez le surnageant. Préparer le tampon de solubilisation en mélangeant 8,7 millilitres de la solution tampon avec 0,1 millilitre de solution mère pmSF, 0,15 millilitre de solution mère de benzamidine, 0,1 millilitre de cocktail inhibiteur des protéases, 10 microlitres de solution mère ATP, un millilitre de glycérol et 0,2 gramme de cholate de sodium. Transférer le tampon de solubilisation dans le tube conique avec des fragments de membrane cellulaire.Et remettez en suspension la pastille. Faites pivoter le mélange résultant à 150 tr/min à quatre degrés Celsius pendant 18 heures. Après 18 heures, centrifuger le mélange de solubilisation à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à 47 900 x g.Ajouter 100 milligrammes d’IAM. PC. Particules de DD2 vers le surnageant et faire pivoter le mélange de suspension résultant à 150 tr / min à quatre degrés Celsius pendant une heure. Préparez un tampon de dialyse dans quatre litres d’eau désionisée ultrapure en ajoutant 24 grammes de Tris-HCl, 23,4 grammes de chlorure de sodium, 0,06 gramme de chlorure de calcium, 5,85 grammes d’EDTA et 0,07 gramme de PMSF.Dissoudre d’abord le PMSF dans un petit volume d’éthanol, puis ajouter lentement dans le bécher avec le tampon. Coupez 10 centimètres de tube de dialyse à membrane de cellulose pour préparer le tube de dialyse et transférez la suspension contenant de l’IAM. PC. Particules DD2 et fragments de membrane cellulaire dans le tube de dialyse.Fermez les deux extrémités du tube de dialyse avec des clips de tube de dialyse. Placez le tube de dialyse dans le tampon de dialyse. Après 24 heures, placez le tube de dialyse dans le tampon de dialyse fraîchement préparé et poursuivez la dialyse pendant encore 24 heures.Préparer un tampon d’acétate d’ammonium de 10 millimolaires pH 7,4 qui sera utilisé pour laver l’IAM. PC. Particules de DD2 et dans des expériences de caractérisation en colonne en dissolvant 0,778 gramme d’acétate d’ammonium dans un litre d’eau désionisée ultrapure. Après 48 heures de dialyse, retirez le tube de dialyse du tampon de dialyse et transférez le contenu du tube de dialyse dans un tube conique de 15 millilitres.Jeter le surnageant et laver la pastille restante trois fois avec 10 millilitres de tampon d’acétate d’ammonium. Après le troisième lavage, remettre en suspension la pastille restante dans un millilitre de tampon d’acétate d’ammonium. Mélangez-le soigneusement et utilisez la boue obtenue pour emballer la colonne de verre 5 x 20 afin de donner la colonne de chromatographie CMAC.Pour emballer la colonne, placez un filtre inférieur préalablement imbibé d’un tampon d’acétate d’ammonium dans le porte-filtre. Placez le porte-filtre dans la colonne de verre et vissez le capuchon de la colonne pour sécuriser la position du support. Placez la colonne verticalement dans une pince à doigts et fixez-la dans le support de laboratoire.Placez un bécher sous la colonne, transférez lentement un petit volume de boue dans la colonne de verre avec une pipetter à canal unique tenant la pointe de la pipette contre la paroi de la colonne de verre. Pour accélérer le processus d’emballage, retirez le tampon au-dessus du lit fixe avec une micropipette entre chaque étape. Placez un filtre supérieur et vissez l’adaptateur de sorte qu’il ne reste plus de tampon au-dessus de la phase stationnaire.Fixez la position de l’adaptateur à l’aide du verrou de l’adaptateur. Connectez la colonne à une pompe de chromatographie liquide à haute performance et, pour laver la colonne pendant la nuit avec un tampon d’acétate d’ammonium, réglez le débit à 0,2 millilitre par minute. Pour un stockage plus long, faites fonctionner la colonne avec une solution d’azoture de sodium à 0,05% dans un tampon d’acétate d’ammonium, en portant une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants lorsque vous travaillez avec de l’azoture de sodium et conservez à quatre degrés Celsius.IAM.PC. Les particules de DD2 avec des fragments de membrane cellulaire TrkB de neuroblastome immobilisés et en présence de BDNF ont donné des particules fluorescentes. Aucune fluorescence n’a été observée dans les particules IAM encapsulées par membrane cellulaire nulle TrkB ou lorsqu’aucun BDNF n’a été utilisé comme dans les particules IAM encapsulées par membrane cellulaire TrkB. Un chromatogramme d’affinité frontale typique des colonnes CMAC fonctionnelles augmentant les concentrations de 7, 8-DHF d’un millimolaire, 750 nanomolaire, 500 nanomolaire et 300 nanomolaires aux récepteurs TrkB immobilisés est montré, ce qui a montré un changement dépendant de la concentration dans le temps de rétention.Une colonne CMAC non fonctionnelle a montré l’absence de changements dépendants de la concentration dans la rétention du ligand marqueur. Une colonne témoin négative CMAC a été préparée en immobilisant des fragments de membrane cellulaire, et non en exprimant la protéine ciblée pour exclure des interactions non spécifiques. L’ajout d’extrait aqueux de Gotu kola à 0,2 % a entraîné une réduction significative de la rétention de 7, 8-DHF, indiquant la présence de ligands concurrents pour le site de liaison agoniste.L’absence de réduction de la rétention de 7, 8-DHF sur la colonne nulle TrkB négative du CMAC a confirmé l’absence de récepteurs TrkB fonctionnels sur cette colonne. L’approche manquante de la chromatographie de pointe a permis d’identifier un composé fortement retenu sur la colonne TrkB, tout en éluant tôt la colonne nulle TrkB, indiquant une interaction spécifique. Il est crucial de connaître votre source de récepteurs pour la colonne de chromatographie d’affinité de membrane cellulaire rapide.Assurez-vous de vérifier la littérature pour bien concevoir les tampons d’homogénéisation et de solubilisation. La colonne de chromatographie d’affinité de la membrane cellulaire préparée dans ce protocole a été utilisée pour identifier de nouveaux succès potentiels de médicaments et pour caractériser la nature de l’interaction entre le récepteur immobilisé et ses ligands naturels.

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Benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, Reconstitution et analyse d’un Polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Technologie des microréseaux protéine extracellulaire pour détection haut débit des Interactions Ligand-récepteur de faible affinité

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Purification d’affinité des chloroplastes Translocon protéines Complexes à l’aide de la balise de robinet

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identification du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide Protéines interactatrices par chromatographie d'affinité couplée à la fente occidentale ou à la spectrométrie de masse

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...