Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. wurde vom Scientific and Technological Research Council of Turkey (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program unterstützt. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Center for Complementary and Integrative Medicine der National Institutes of Health unter der Preisnummer 1R41AT011716-01 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise durch den American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, den Regis Technologies Grant an L.C. unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.

1. Zellkultur von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen (TrkB- und TrkB-NULL-Zelllinien (parentale) Zelllinien)
HINWEIS: Zelllinien (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) und SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 wurden von Kerafast gekauft. Kultivierte Zellen werden als Quelle der Transmembranrezeptoren verwendet, die für die Herstellung von CMAC-Säulen immobilisiert werden sollen. In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie...

Die Identifizierung von Wirkstoffen, die in komplexen Mischungen spezialisierter Metaboliten vorhanden sind, ist eine sehr anspruchsvolle Aufgabe23. Traditionell werden einzelne Verbindungen isoliert und ihre Aktivität in verschiedenen Assays getestet. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig und kostspielig und führt häufig zur Isolierung und Identifizierung der am häufigsten vorkommenden und gut charakterisierten Verbindungen23. Die derzeit verwendeten Hochdurchsatz-Screening...

Botanische Mischungen sind reich an pharmakologisch aktiven Verbindungen1 und dienen als gute Quelle für die Identifizierung neuer Arzneimittel-Hits und -Leads 2,3,4,5. Die Entdeckung neuer Medikamente aus Naturprodukten war ein fruchtbarer Ansatz, und viele derzeit zugelassene Medikamente stammen aus Verbindungen, die zuerst in der Natur identifiziert wurden. Die chemische Vielfalt von Naturstoffen ist schwer von künstlichen Bibliotheken chemisch synthetisierter Moleküle zu erreichen. Viele natürliche Verbindungen interagieren mit und modulieren menschliche Proteinziele und können als evolutionär optimierte arzneimittelähnliche Molekülebetrachtet werden 6. Diese Naturstoffe eignen sich besonders gut für die Identifizierung von Wirkstoff-Blei zur Verwendung bei neurologischen Erkrankungen6. Zwei der derzeit von der FDA zugelassenen Medikamente zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit (AD) stammen aus natürlichen Alkaloiden, nämlich: Galantamin und Rivastigmin (ein Derivat von Physostigmin)6. L-DOPA, derzeit das am häufigsten verschriebene Medikament gegen die Parkinson-Krankheit, wurde zuerst aus der breiten Bohne (Vicia faba L.) identifiziert. 7. Pergolid und Lisurid, dopaminerge Rezeptoragonisten sind die Derivate natürlicher Mutterkornalkaloide aus dem parasitären Pilz Claviceps purpurea8. Reserpine, ein aus der indischen Schlangenwurzel (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) isoliertes Alkaloid, war eines der ersten Antipsychotika9. In jüngster Zeit wurden eine fehlregulierte Immunantwort und eine systemische Entzündung mit der Entwicklung zahlreicher neurologischer Erkrankungen wie schweren depressiven Störungen oder neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht10. Es wurde festgestellt, dass eine pflanzliche Ernährung zusammen mit anderen Lebensstilinterventionen die kognitiven und funktionellen Fähigkeiten bei älteren Menschen verbessert 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Es wurde festgestellt, dass bestimmte elektrophile Moleküle, die zu Triterpenen und Polyphenolen gehören, Entzündungsreaktionen sowohl in vitro- als auch in vivo-Modellen modulieren 12. Zum Beispiel stören natürliche Verbindungen, die α,β-ungesättigtes Carbonyl (z. B. Curcumin, Zimtaldehyd) oder Isothiocyanatgruppe (z. B. Sulforaphan) enthalten, die Toll-like-Rezeptor-4 (TLR4) -Dimerisierung, die die nachgeschaltete Synthese von proinflammatorischen Zytokinen in einer murinen Interleukin-3-abhängigen Pro-B-Zelllinie hemmt12,22 . Epidemiologische Beweise deuten stark darauf hin, dass diätetische Phytochemikalien, die in komplexen Lebensmittelmatrizen vorhanden sind, auch eine brauchbare Quelle für neue Arzneimittelleitungen darstellenkönnen 6.
Eines der Haupthindernisse bei der Identifizierung biologisch aktiver Moleküle in Pflanzenextrakten, einschließlich pflanzlicher Lebensmittel, ist die Komplexität der untersuchten Proben. Traditionell werden die einzelnen Verbindungen isoliert, gereinigt und anschließend auf biologische Aktivität getestet. Dieser Ansatz führt in der Regel zur Identifizierung der am häufigsten vorkommenden und gut charakterisierten Verbindungen. Phänotypische Wirkstoffforschungsansätze ohne definiertes molekulares Ziel beruhen auf der bio-geführten Fraktionierung komplexer Gemische23. Bei diesem Ansatz wird ein Extrakt in weniger komplexe Unterfraktionen fraktioniert, die anschließend in phänotypischen Assays getestet werden. Die Isolierung und Reinigung von Wirkstoffen wird durch die im Assay verifizierte biologische Aktivität geleitet. Die Kenntnis der Identität eines spezifizierten Wirkstoffziels kann die Identifizierung pharmakologisch aktiver Verbindungen, die in komplexen Gemischen vorhanden sind, erheblich beschleunigen. Diese Ansätze basieren in der Regel auf der Immobilisierung des molekularen Ziels, beispielsweise eines Enzyms, auf einer festen Oberfläche, wie magnetischen Perlen23. Die immobilisierten Targets werden anschließend in den Screening-Experimenten verwendet, was zur Isolierung von Verbindungen führt, die mit dem Target interagieren. Während dieser Ansatz bei der Identifizierung von Verbindungen, die auf zytosolische Proteine abzielen, umfassend verwendet wurde, wurde er bei der Identifizierung von Chemikalien, die mit Transmembranproteinen (TMPs) interagieren, seltener angewendet23. Eine zusätzliche Herausforderung bei der Immobilisierung von TMPs ergibt sich aus der Tatsache, dass die Aktivität des Proteins von seiner Wechselwirkung mit Zellmembranphospholipiden und anderen Molekülen in der Doppelschicht wie Cholesterin23,24 abhängt. Es ist wichtig, diese subtilen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und ihrer nativen Phospholipid-Doppelschichtumgebung zu erhalten, wenn versucht wird, das Transmembranziel zu immobilisieren.
In der Zellmembranaffinitätschromatographie (CMAC) werden Zellmembranfragmente und nicht gereinigte Proteine auf den stationären Phasenpartikeln der künstlichen Membran (IAM)immobilisiert 23. Stationäre IAM-Phasen werden durch kovalente Bindung von Phosphatidylcholinanaloga an Siliciumdioxid hergestellt. In jüngster Zeit wurden neuartige Klassen von stationären IAM-Phasen entwickelt, in denen freie Amin- und Silanolgruppen endgekappt sind (IAM. PC. DD2-Partikel). Während der CMAC-Säulenvorbereitung werden Zellmembranfragmente durch Adsorption auf die Oberfläche von IAM-Partikeln immobilisiert.
CMAC-Säulen wurden bisher verwendet, um verschiedene Klassen von TMPs zu immobilisieren, einschließlich Ionenkanäle (z. B. Nikotinrezeptoren), GPCRs (z. B. Opioidrezeptoren), Proteintransporter (z. B. p-Glykoprotein) usw. 24. Die immobilisierten Proteintargets wurden bei der Charakterisierung der Pharmakodynamik (z. B. Dissoziationskonstante, Kd) oder der Bestimmung der Bindungskinetik (kon und koff) von niedermolekularen Liganden, die mit dem Ziel interagieren, sowie bei der Identifizierung potenzieller neuer Wirkstoff-Leads in komplexen Matrizen verwendet24 . Hier stellen wir die Herstellung von CMAC-Säulen mit dem immobilisierten Tropomyosin-Kinase-Rezeptor B (TrkB) vor, der sich als brauchbares Ziel für die Wirkstoffforschung bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems herausgestellt hat.
Frühere Studien zeigten, dass die Aktivierung des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDNF) / TrkB-Signalwegs mit der Verbesserung bestimmter neurologischer Erkrankungen wie AD oder schwerer depressiver Störungverbunden ist 25,26,27,28. Es wurde berichtet, dass BDNF-Spiegel und seine Rezeptor-TrkB-Expression bei AD abnehmen, und ähnliche Reduktionen beeinträchtigen die Hippocampus-Funktion in Tiermodellen von AD29. Verminderte BDNF-Spiegel wurden im Serum und im Gehirn von AD-Patienten berichtet 30,31,32. Es wurde festgestellt, dass Tau-Überexpression oder Hyperphosphorylierung die BDNF-Expression in primären Neuronen und AD-Tiermodellen herunterreguliert33,34,35. Darüber hinaus wurde berichtet, dass BDNF in vitro und in vivo36 schützende Wirkungen auf die β-Amyloid-induzierte Neurotoxizität hat. Es wurde gezeigt, dass die direkte BDNF-Verabreichung in das Rattengehirn das Lernen und das Gedächtnis bei kognitiv beeinträchtigten Tierenerhöht 37. BDNF/TrkB erwies sich als gültiges Ziel für die Linderung neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen, einschließlich AD28,38. Die Ausrichtung auf den BDNF/TrkB-Signalweg für die Entwicklung von Therapien bei AD wird möglicherweise unser Verständnis der Krankheitverbessern 39. Leider kann BDNF selbst wegen seiner schlechten pharmakokinetischen Eigenschaften und Nebenwirkungen nicht als Behandlung verwendetwerden 40. Kleine Molekülaktivatoren von TrkB/BDNF-Signalwegen wurden als potenzielle TrkB-Liganden41,42,43 untersucht. Unter den getesteten niedermolekularen Agonisten wurde gezeigt, dass 7,8-Dihydroxyflavon (7,8-DHF) den BDNF / TrkB-Signalweg 41,44,45,46 aktiviert. Ein Derivat von 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromen-7,8-diylbis(methylcarbamat)) wird derzeit als mögliches Medikament für AD47 in Betracht gezogen. Kürzlich wurde gezeigt, dass mehrere Antidepressiva direkt an TrkB binden und die BDNF-Signalgebung fördern, was die Bedeutung der Verfolgung von TrkB als gültiges Ziel zur Behandlung verschiedener neurologischer Erkrankungenweiter unterstreicht 48.
Das Protokoll beschreibt den Prozess der Zusammenstellung der funktionalen TrkB-Spalte und der TrkB-NULL-Negativkontrollsäule. Die Säulen werden mit einem bekannten Naturprodukt kleinmolekularer Liganden charakterisiert: 7,8-DHF. Darüber hinaus beschreiben wir den Prozess des Screenings komplexer Matrizen am Beispiel von Pflanzenextrakt zur Identifizierung von Verbindungen, die mit TrkB interagieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Chemikalien, die von Pflanzen, Pilzen, Bakterien und wirbellosen Meerestieren synthetisiert werden, waren eine reiche Quelle für neue Drogen und Blei. Medikamente wie Statine, Penicillin, Paclitaxel, Rapamycin oder Artemisinin, die üblicherweise in der medizinischen Praxis verwendet werden, wurden zuerst identifiziert und aus Naturprodukten isoliert. Die Identifizierung und Isolierung von biologisch aktiven spezialisierten Metaboliten aus natürlichen Quellen ist jedoch ein herausfordernder und zeitaufwendiger Prozess. Traditionell werden einzelne Metaboliten nach der Extraktion von Biomasse aus komplexen Gemischen isoliert und gereinigt. Anschließend werden die isolierten Moleküle in funktionellen Assays getestet, um ihre biologische Aktivität zu überprüfen. Hier stellen wir die Verwendung von CMAC-Säulen (Cellular Membrane Affinity Chromatography) vor, um biologisch aktive Verbindungen direkt aus komplexen Gemischen zu identifizieren. CMAC-Säulen ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen, die mit immobilisierten funktionellen Transmembranproteinen (TMPs) interagieren, die in ihre native Phospholipid-Doppelschichtumgebung eingebettet sind. Dies ist ein gezielter Ansatz, der voraussetzt, den TMP zu kennen, dessen Aktivität man mit dem neu identifizierten niedermolekularen Wirkstoffkandidaten modulieren will. In diesem Protokoll stellen wir einen Ansatz zur Herstellung von CMAC-Säulen mit immobilisiertem Tropomyosin-Kinase-Rezeptor B (TrkB) vor, der sich zu einem brauchbaren Ziel für die Wirkstoffforschung bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems entwickelt hat. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Montage der CMAC-Säule mit immobilisierten TrkB-Rezeptoren unter Verwendung von Neuroblastom-Zelllinien zur Überexpression von TrkB-Rezeptoren vor. Wir stellen ferner den Ansatz vor, die Funktionalität der Säule und ihre Verwendung bei der Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten zu untersuchen, die mit TrkB-Rezeptoren interagieren.

Nach dem Protokoll wurden zwei CMAC-chromatographische Säulen zusammengesetzt: eine mit den immobilisierten SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellmembranfragmenten mit überexprimiertem TrkB und eine mit SH-SY5Y TrkB-NULL-Zellmembranfragmenten. Die korrekt montierte CMAC-Säule ist in Abbildung 1 dargestellt, und die Schritte zur Immobilisierung von Zellmembranfragmenten sind in Abbildung 2 dargestellt.
Seit der Immobilisierung von TrkB-Rezeptore...

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Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Das Protokoll beschreibt die Herstellung von CMAC-Säulen (Cell Membrane Affinity Chromatography) mit immobilisierten Zellmembranfragmenten, die funktionelle Transmembran-Tropomyosin-Kinase-Rezeptor-B-Proteine enthalten. Die Verwendung von CMAC-Säulen bei der Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten, die mit diesen Rezeptoren interagieren und in komplexen natürlichen Mischungen vorhanden sind, wird ebenfalls erläutert.

Zellmembranaffinitätschromatographiesäulen zur Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten, die mit dem immobilisierten Tropomyosinkinase-Rezeptor B interagieren

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Diese Vertikale stellt wichtige Schritte bei der Montage von Zellmembran-Affinitätschromatographiesäulen mit funktionellen Transmembranrezeptoren dar. Diese Säulen können zur Identifizierung kleiner Moleküle verwendet werden, die in komplexen Extrakten vorhanden sind und mit immobilisierten Transmembranrezeptoren interagieren. Zellmembran-Affinitätschromatographiesäulen beschleunigen die Identifizierung biologisch aktiver Verbindungen, die in komplexen Gemischen vorhanden sind.Die Verwendung von zellulären Membranaffinitätschromatographiesäulen kann von besonderem Interesse für diejenigen sein, die an der Identifizierung pharmakologisch aktiver Verbindungen in komplexen natürlichen Matrizen wie Pflanzen-, Pilz- oder Bakterienextrakten interessiert sind. Bereiten Sie zunächst 200 millimolare Benzamidin-Stammlösung vor, indem Sie 120 Benzamid in fünf Millilitern ultrareinem deionisiertem Wasser auflösen. Bereiten Sie eine 10-millimolare PMSF-Stammlösung vor, indem Sie 0,017 Gramm PMSF in 10 Milliliter Ethanol in einem Abzug auflösen.Bereiten Sie 100X Proteases Inhibitor Cocktail vor, indem Sie die handelsübliche Proteaseinhibitormischung in einem Milliliter ultrareinem deionisiertem Wasser auflösen. Mischen Sie gründlich und aliquot 200 bis 300 Mikroliter des Cocktails. Bereiten Sie 100 Millimolar ATP-Stammlösung vor, indem Sie 55.114 Milligramm ATP-Dinatriumsalzhydrat in einem Milliliter ionisiertem Reinstwasser auflösen.Mischen Sie gründlich und aliquot 100 Mikroliter der Mischung. Bereiten Sie den Puffer vor, indem Sie 3,03 Gramm Tris-HCL, 2,9 Gramm Natriumchlorid, 0,22 Gramm wasserfreies Calciumchlorid, 0,2 Gramm Magnesiumchloridhexahydrat und 0,19 Gramm Kaliumchlorid in 500 Millilitern hochreinem entionisiertem Wasser auflösen. Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer vor, indem Sie 17,3 Milliliter des Tris-Puffers mit 0,3 Milliliter Benzamidin-Stammlösung, 0,2 Milliliter PMSF-Stammlösung, 0,2 Milliliter Proteasen-Inhibitor-Cocktail, 20 Mikroliter ATP-Stammlösung, zwei Milliliter Glycerin und 0,029 Gramm EDTA mischen.Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäurelösung auf 7,4 ein. Drehen Sie die bei vier Grad Celsius geernteten Zellen für fünf Minuten bei 400 x g herunter und entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das verbleibende Zellpellet mit 10 Millilitern 1X pH 7,4 eiskaltem PBS. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 20 Milliliter Homogenisierungspuffer hinzu.Legen Sie die konische Röhre auf Eis. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen 40 Milliliter Dounce Homogenisator Tissue Grinder, homogenisieren Sie die Suspension manuell auf Eis mit 40 Stößelschlägen nach oben und unten. Homogenisierte Zellsuspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr überführen, das Pellet entsorgen und den Überstand in ein neues konisches Rohr überführen.Speichern Sie das Zellmembranpellet und entsorgen Sie den Überstand. Bereiten Sie den Lösungslösungspuffer vor, indem Sie 8,7 Milliliter der Pufferlösung mit 0,1 Milliliter PMSF-Stammlösung, 0,15 Milliliter Benzamidin-Stammlösung, 0,1 Milliliter Proteasen-Inhibitor-Cocktail, 10 Mikroliter ATP-Stammlösung, einem Milliliter Glycerin und 0,2 Gramm Natriumcholat mischen. Übertragen Sie den Solubilisierungspuffer in das konische Rohr mit Zellmembranfragmenten.Und das Pellet wieder suspendieren. Drehen Sie die resultierende Mischung bei 150 U / min bei vier Grad Celsius für 18 Stunden. Nach 18 Stunden das Solubilisierungsgemisch bei vier Grad Celsius für 30 Minuten bei 47.900 x g zentrifugieren.Fügen Sie 100 Milligramm IAM hinzu. PC. DD2-Partikel zum Überstand und drehen das resultierende Suspensionsgemisch bei 150 U / min bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Bereiten Sie Dialysepuffer in vier Litern ultrareinem entionisiertem Wasser vor, indem Sie 24 Gramm Tris-HCl, 23,4 Gramm Natriumchlorid, 0,06 Gramm Calciumchlorid, 5,85 Gramm EDTA und 0,07 Gramm PMSF hinzufügen.PMSF zuerst in einer kleinen Menge Ethanol auflösen und dann langsam mit dem Puffer in das Becherglas geben. Schneiden Sie 10 Zentimeter Cellulosemembran-Dialyseschläuche ab, um den Dialyseschlauch vorzubereiten, und übertragen Sie die Suspension, die IAM enthält. PC. DD2-Partikel und Zellmembranfragmente in den Dialyseschlauch.Verschließen Sie beide Enden des Dialyseschlauches mit Dialyseschlauchclips. Legen Sie das Dialyseröhrchen in den Dialysepuffer. Nach 24 Stunden den Dialyseschlauch in den frisch zubereiteten Dialysepuffer legen und die Dialyse für weitere 24 Stunden fortsetzen.Bereiten Sie 10 millimolar pH 7,4 Ammoniumacetatpuffer vor, der zum Waschen des IAM verwendet wird. PC. DD2-Partikel und in Säulencharakterisierungsexperimenten durch Auflösen von 0,778 Gramm Ammoniumacetat in einem Liter hochreinem entionisiertem Wasser. Nach 48 Stunden Dialyse das Dialyseröhrchen aus dem Dialysepuffer entnehmen und den Inhalt des Dialyseröhrchens in ein 15 Milliliter konisches Röhrchen überführen.Den Überstand entsorgen und das restliche Pellet dreimal mit 10 Millilitern Ammoniumacetatpuffer waschen. Nach der dritten Wäsche das verbleibende Pellet in einem Milliliter Ammoniumacetatpuffer resuspendieren. Mischen Sie es gründlich und verwenden Sie die resultierende Aufschlämmung, um die 5 x 20-Glassäule zu verpacken, um die CMAC-Chromatographiesäule zu erhalten.Um die Säule zu verpacken, legen Sie einen Bodenfilter, der zuvor mit Ammoniumacetatpuffer getränkt war, in den Filterhalter. Setzen Sie den Filterhalter in die Glassäule ein und schrauben Sie den Säulendeckel an, um die Position des Halters zu sichern. Setzen Sie die Säule vertikal in eine Fingerklemme und befestigen Sie sie im Laborständer.Legen Sie ein Becherglas unter die Säule, übertragen Sie ein kleines Volumen der Aufschlämmung langsam in die Glassäule, wobei ein Einkanalpipettierer die Pipettenspitze an der Glassäulenwand hält. Um den Verpackungsprozess zu beschleunigen, entfernen Sie den Puffer zwischen den einzelnen Schritten mit einer Mikropipette von oberhalb des stationären Bettes. Platzieren Sie einen oberen Filter und schrauben Sie die Adaptereinheit so, dass kein verbleibender Puffer über der stationären Phase vorhanden ist.Sichern Sie die Position der Adaptereinheit mit dem Adapterschloss. Schließen Sie die Säule an eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographiepumpe an und um die Säule über Nacht mit Ammoniumacetatpuffer zu waschen, stellen Sie die Durchflussrate auf 0,2 Milliliter pro Minute ein. Für eine längere Lagerung führen Sie die Säule mit 0,05% Natriumazidlösung in Ammoniumacetatpuffer aus, tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und Handschuhe, wenn Sie mit Natriumazid arbeiten, und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.IAM.PC. DD2-Partikel mit immobilisiertem Neuroblastom TrkB-Zellmembranfragmenten und in Gegenwart von BDNF ergaben fluoreszierende Partikel. Es wurde keine Fluoreszenz in TrkB-Nullzellmembran-gekapselten IAM-Partikeln beobachtet oder wenn kein BDNF wie in TrkB-Zellmembran-verkapselten IAM-Partikeln verwendet wurde. Es ist ein funktionelles CMAC-Säulen-typisches frontales Affinitätschromatogramm mit steigenden 7, 8-DHF-Konzentrationen von einem Millimolaren, 750 Nanomolaren, 500 Nanomolar und 300 Nanomolar zu den immobilisierten TrkB-Rezeptoren gezeigt, das eine konzentrationsabhängige Veränderung der Retentionszeit zeigte.Eine nicht-funktionale CMAC-Säule zeigte den Mangel an konzentrationsabhängigen Veränderungen in der Retention des Markerliganden. Eine CMAC-Negativkontrollsäule wurde hergestellt, indem Zellmembranfragmente immobilisiert wurden, ohne das Zielprotein zu exprimieren, um unspezifische Wechselwirkungen auszuschließen. Die Zugabe von 0,2% wässrigem Gotu-Kola-Extrakt führte zu einer signifikanten Reduktion der 7,8-DHF-Retention, was auf das Vorhandensein konkurrierender Liganden für die Agonistenbindungsstelle hinweist.Die fehlende Reduktion der 7, 8-DHF-Retention auf der CMAC-negativen TrkB-Nullsäule bestätigte den Mangel an funktionellen TrkB-Rezeptoren auf dieser Säule. Der fehlende Peak-Chromatographie-Ansatz identifizierte eine Verbindung, die stark auf der TrkB-Säule gehalten wurde, während sie früh auf der TrkB-Nullspalte eluierte, was auf eine spezifische Wechselwirkung hinweist. Es ist wichtig, Ihre Quelle von Rezeptoren für die schnelle zelluläre Membranaffinitätschromatographie-Säule zu kennen.Stellen Sie sicher, dass Sie die Literatur lesen, um Homogenisierungs- und Lösungslösungspuffer richtig zu entwerfen. Die in diesem Protokoll vorbereitete zelluläre Membranaffinitätschromatographiesäule wurde verwendet, um neue potenzielle Arzneimitteltreffer zu identifizieren und die Art der Wechselwirkung zwischen immobilisiertem Rezeptor und seinen natürlichen Liganden zu charakterisieren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

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A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

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Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blatt-Spray-Massenspektrometrie: Eine schnelle Ambient Ionisation Technik direkt Metaboliten von Pflanzengewebe bewerten

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Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie, Rekonstitution und Assay ein Polyhistidine getaggt Metalloenzyme für das Grundstudium Labor

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

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Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...