Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. נתמך על ידי המועצה למחקר מדעי וטכנולוגי של טורקיה (TUBITAK) 2219 - תוכנית עמיתי מחקר בינלאומית לפוסט-דוקטורט. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המרכז הלאומי לרפואה משלימה ואינטגרטיבית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר 1R41AT011716-01. עבודה זו נתמכה באופן חלקי גם על ידי מענק ההתחלה של האגודה האמריקאית למחקר פרמקוגנוזי, מענק רג'יס טכנולוגיות ל- L.C. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. תרבית תאים של תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y (קווי תאים TrkB ו-TrkB-NULL (הורים) )
הערה: קווי תאים (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) וקו תאי הורים SH-SY5Y (TrkB NULL))49,50 נרכשו מ-Kerafast. תאים בתרבית משמשים כמקור של קולטני transmembrane להיות משותקים להכנת עמודות CMAC. השלבים הבאים מתארים...

זיהוי תרכובות פעילות הקיימות בתערובות מורכבות של מטבוליטים מיוחדים הוא משימה מאתגרת מאוד23. באופן מסורתי, תרכובות בודדות מבודדות, ופעילותן נבדקת במבחנים שונים. גישה זו גוזלת זמן ויקרה ומובילה לעתים קרובות לבידוד וזיהוי של התרכובות הנפוצות והמאופיינות ביותר23. כ?...

תערובות בוטניות עשירות בתרכובות פעילות פרמקולוגית1, משמשות כמקור טוב לזיהוי להיטים של תרופות חדשות ומובילות 2,3,4,5. הגילוי של תרופות חדשות ממוצרים טבעיים היה גישה פורייה ותרופות רבות שאושרו כיום מקורן בתרכובות שזוהו לראשונה בטבע. המגוון הכימי של תרכובות טבעיות קשה להתאמה על ידי ספריות מעשה ידי אדם של מולקולות מסונתזות כימית. תרכובות טבעיות רבות מתקשרות עם מטרות חלבונים אנושיות ומווסתות אותן, ויכולות להיחשב למולקולות דמויות-תרופה שעברו אופטימיזציה אבולוציונית6. תרכובות טבעיות אלה מתאימות במיוחד לזיהוי עופרת סמים לשימוש בהפרעות נוירולוגיות6. שתיים מהתרופות המאושרות כיום על ידי ה-FDA לטיפול במחלת אלצהיימר (AD) מופקות מאלקלואידים טבעיים, כלומר: גלנטמין וריבסטיגמין (נגזרת של physostigmine)6. L-DOPA, כיום התרופה הנפוצה ביותר למחלת פרקינסון, זוהתה לראשונה מהשעועית הרחבה (Vicia faba L.) 7. פרגוליד וליזורייד, אגוניסטים של קולטן דופמינרגי הם הנגזרות של אלקלואידים ארגוט טבעיים מהפטריה הטפילית Claviceps purpurea8. רסרפין, אלקלואיד שבודד מנחש הודי (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) היה אחד התרופות האנטי-פסיכוטיות הראשונות9. לאחרונה, תגובה חיסונית לא מווסתת ודלקת מערכתית נקשרו להתפתחות של מחלות נוירולוגיות רבות, כגון הפרעת דיכאון מז'ורי או מחלות נוירודגנרטיביות10. תזונה מבוססת צמחים יחד עם התערבויות אחרות באורח החיים נמצאה כמשפרת את היכולות הקוגניטיביות והתפקודיות בקרב קשישים 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . מולקולות אלקטרופיליות מסוימות השייכות לטריטרפנים ולפוליפנולים נמצאו כמכשירות תגובות דלקתיות הן במודלים של in vitro והן במודלים in vivo 12. לדוגמה, תרכובות טבעיות המכילות α,β-קרבוניל בלתי רווי (לדוגמה, כורכומין, סינמאלדהיד), או קבוצת איזותיוציאנטים (למשל, סולפוראפן) מפריעות לדמריזציה של קולטן דמוי אגרה-4 (TLR4) המעכבת את הסינתזה במורד הזרם של ציטוקינים פרו-דלקתיים בקו תאי פרו-B תלויי מורין אינטרלוקין-3בקו 12,22 . עדויות אפידמיולוגיות מצביעות על כך שפיטוכימיקלים תזונתיים, הנמצאים במטריצות מזון מורכבות, עשויים גם הם להוות מקור בר קיימא של תרופות חדשות המובילות6.
אחד המכשולים העיקריים בזיהוי מולקולות פעילות ביולוגית הנמצאות בתמציות צמחים, כולל מזון צמחי, הוא המורכבות של הדגימות הנחקרות. באופן מסורתי, התרכובות הבודדות מבודדות, מטוהרות, ולאחר מכן נבדקות לפעילות ביולוגית. גישה זו מובילה בדרך כלל לזיהוי התרכובות הנפוצות והמאופיינות ביותר. גישות לגילוי תרופות פנוטיפיות ללא מטרה מולקולרית מוגדרת מסתמכות על פיצול מונחה ביולוגית של תערובות מורכבות23. בגישה זו, תמצית מחולקת לתת-שברים פחות מורכבים שנבדקים לאחר מכן במבחנים פנוטיפיים. הבידוד והטיהור של תרכובות פעילות מונחים על ידי פעילות ביולוגית המאומתת בבדיקה. הידע על זהותה של מטרה תרופתית מוגדרת עשוי להאיץ באופן משמעותי את זיהוי התרכובות הפעילות מבחינה פרמקולוגית הקיימות בתערובות מורכבות. גישות אלה מבוססות בדרך כלל על אימוביליזציה של המטרה המולקולרית, למשל, אנזים, על משטח מוצק, כמו חרוזים מגנטיים23. המטרות המשותקות משמשות לאחר מכן בניסויי הסינון וכתוצאה מכך בידוד של תרכובות המקיימות אינטראקציה עם המטרה. בעוד שגישה זו שימשה באופן נרחב בזיהוי תרכובות המכוונות לחלבונים ציטוזוליים, היא יושמה פחות נפוץ בזיהוי כימיקלים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני טרנס-ממברנה (TMPs)23. אתגר נוסף בשתוק של TMPs נובע מהעובדה שפעילות החלבון תלויה באינטראקציה שלו עם פוספוליפידים של קרום התא ומולקולות אחרות בדו-שכבתיות כגון כולסטרול23,24. חשוב לשמר את האינטראקציות העדינות האלה בין חלבונים לבין הסביבה הדו-שכבתית הפוספוליפידית הטבעית שלהם כאשר הם מנסים לשתק את המטרה הטרנס-ממברנית.
בכרומטוגרפיה של קרום התא (CMAC) שברי קרום התא, ולא חלבונים מטוהרים, משותקים על חלקיקי הפאזה הנייחים של הממברנה המלאכותית (IAM)23. פאזות נייחות של IAM מוכנות על ידי חיבור קוולנטי של אנלוגים פוספטידילכולין על סיליקה. לאחרונה פותחו מחלקות חדשניות של שלבים נייחים של IAM שבהן קבוצות אמין וסילנול חופשיות מכוסות סופית (IAM). מחשב אישי. חלקיקי DD2). במהלך הכנת עמודי CMAC שברי קרום התא משותקים על פני השטח של חלקיקי IAM באמצעות ספיחה.
עמודי CMAC שימשו עד כה לשתוק סוגים שונים של TMPs, כולל תעלות יונים (למשל, קולטנים ניקוטיניים), GPCRs (למשל, קולטני אופיואידים), מובילי חלבונים (למשל, p-גליקופרוטאין) וכו'24. מטרות החלבון המשותקות שימשו באפיון פרמקודינמיקה (למשל, קבוע דיסוציאציה, Kd) או בקביעת קינטיקה קושרת (kon ו-koff) של ליגנדות של מולקולות קטנות המקיימות אינטראקציה עם המטרה וכן בתהליך זיהוי של מובילי תרופות חדשות פוטנציאליים הנמצאים במטריצות מורכבות24 . כאן אנו מציגים את ההכנה של עמודות CMAC עם קולטן tropomyosin קינאז משותק B (TrkB), אשר התגלה כמטרה בת קיימא לגילוי תרופות עבור הפרעות רבות במערכת העצבים.
מחקרים קודמים הראו כי הפעלת הגורם הנוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF)/TrkB קשורה לשיפור של מחלות נוירולוגיות מסוימות, כגון AD או הפרעת דיכאון מז'ורי 25,26,27,28. דווח כי רמות ה-BDNF והביטוי של הקולטן שלו TrkB יורדים באלצהיימר, והפחתות דומות פוגעות בתפקוד ההיפוקמפוס במודלים של בעלי חיים של29 לספירה. ירידה ברמות של BDNF דווחה בסרום ובמוח של חולי אלצהיימר 30,31,32. ביטוי יתר של טאו או היפר-פוספורילציה נמצאו כמפחיתים את ההנמכה של ביטוי ה-BDNF בתאי עצב ראשוניים ובמודלים של חיות AD 33,34,35. בנוסף, דווח כי ל-BDNF יש השפעות מגינות על רעילות עצבית הנגרמת על ידי β-עמילואיד במבחנה וב-in vivo36. הודגם כי מתן BDNF ישיר למוח החולדה מגביר את הלמידה והזיכרון אצל בעלי חיים לקויים קוגניטיבית37. BDNF/TrkB התגלה כיעד תקף להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, כולל28,38 לספירה. התמקדות במסלול האיתות BDNF/TrkB לפיתוח טיפולים ב-AD עשויה לשפר את הבנתנו את המחלה39. למרבה הצער, BDNF עצמו לא יכול לשמש כטיפול בגלל התכונות הפרמקוקינטיות הגרועות שלו ותופעות לוואי שליליות40. מפעילי מולקולות קטנות של מסלולי TrkB/BDNF נחקרו כליגנדות TrkB פוטנציאליות 41,42,43. בקרב אגוניסטים של מולקולות קטנות שנבדקו, הוכח כי 7,8-דיהידרוקסיפלבון (7,8-DHF) מפעיל את מסלול ה-BDNF/TrkB 41,44,45,46. נגזרת של 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-phenyl-4H-chromene-7,8-diyl bis(methylcarbamate)) נמצאת כעת בבחינה כתרופה אפשרית עבור AD47. לאחרונה, הוכח כי מספר תרופות נוגדות דיכאון פועלות באמצעות קשירת קשר ישיר ל- TrkB וקידום איתות BDNF, מה שמדגיש עוד יותר את החשיבות של רדיפה אחר TrkB כמטרה תקפה לטיפול בהפרעות נוירולוגיות שונות48.
הפרוטוקול מתאר את התהליך של הרכבת עמודת TrkB פונקציונלית ועמודת בקרה שלילית TrkB-NULL. העמודות מאופיינות באמצעות מוצר טבעי ידוע ליגנד קטן-מולקולרי: 7,8-DHF. בנוסף, אנו מתארים את תהליך סינון המטריצות המורכבות, תוך שימוש בתמצית צמחים כדוגמה, לזיהוי תרכובות המקיימות אינטראקציה עם TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

כימיקלים המסונתזים על ידי צמחים, פטריות, חיידקים וחסרי חוליות ימיים היו מקור עשיר לפגיעות ומובילות של תרופות חדשות. תרופות כגון סטטינים, פניצילין, פקליטקסל, רפמיצין או ארטמיסינין, המשמשים בדרך כלל בפרקטיקה הרפואית, זוהו לראשונה ובודדו ממוצרים טבעיים. עם זאת, זיהוי ובידוד של מטבוליטים מיוחדים פעילים ביולוגית ממקורות טבעיים הוא תהליך מאתגר וגוזל זמן. באופן מסורתי, מטבוליטים בודדים מבודדים ומטוהרים מתערובות מורכבות, בעקבות מיצוי הביומסה. לאחר מכן, המולקולות המבודדות נבדקות במבחנים פונקציונליים כדי לאמת את פעילותן הביולוגית. כאן אנו מציגים את השימוש בעמודות כרומטוגרפיית זיקה של קרום התא (CMAC) לזיהוי תרכובות פעילות ביולוגית ישירות מתערובות מורכבות. עמודות CMAC מאפשרות זיהוי של תרכובות המקיימות אינטראקציה עם חלבוני טרנס-ממברנה פונקציונליים משותקים (TMPs) המוטבעים בסביבה הדו-שכבתית הפוספוליפידית המקורית שלהם. זוהי גישה ממוקדת, הדורשת הכרת ה-TMP שאת פעילותו מתכוונים לווסת עם המועמד החדש שזוהה לתרופה עם המולקולה הקטנה שזוהתה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גישה להכנת עמודות CMAC עם קולטן tropomyosin קינאז משותק B (TrkB), אשר התגלה כמטרה בת קיימא לגילוי תרופות עבור הפרעות רבות במערכת העצבים. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט להרכבת עמודת CMAC עם קולטני TrkB משותקים באמצעות קווי תאי נוירובלסטומה המבטאים יתר על המידה קולטני TrkB. כמו כן, אנו מציגים את הגישה לחקור את הפונקציונליות של העמודה ואת השימוש בה בזיהוי מטבוליטים צמחיים מיוחדים המקיימים אינטראקציה עם קולטני TrkB.

בעקבות הפרוטוקול, הורכבו שתי עמודות כרומטוגרפיות של CMAC: אחת עם שברי קרום תאי הנוירובלסטומה SH-SY5Y המשותקים עם TrkB עם ביטוי יתר של TrkB ואחד עם שברי קרום תאי SH-SY5Y TrkB-NULL. עמודת CMAC שהורכבה כהלכה מוצגת באיור 1 והשלבים המעורבים באימוביליזציה של שברים של קרום התא מוצגים באיו...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

הפרוטוקול מתאר את ההכנה של עמודי כרומטוגרפיית זיקה של קרום התא (CMAC) עם שברי קרום תאים משותקים המכילים חלבוני קולטן B טרנס-ממברנה tropomyosin kinase פונקציונליים. כמו כן מוסבר השימוש בעמודות CMAC בזיהוי מטבוליטים צמחיים מיוחדים המקיימים אינטראקציה עם קולטנים אלה ונוכחים בתערובות טבעיות מורכבות.

עמודי כרומטוגרפיה של זיקה לממברנת התא לזיהוי מטבוליטים מיוחדים של צמחים המקיימים אינטראקציה עם קולטן Tropomyosin Kinase משותק B

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

אנכי זה מציג שלבים חשובים בהרכבת עמודי כרומטוגרפיית זיקה של קרום התא עם קולטני טרנס-ממברנה פונקציונליים. עמודות אלה יכולות לשמש לזיהוי מולקולות קטנות הקיימות בתמציות מורכבות ולאינטראקציה עם קולטני טרנס-ממברנה משותקים. עמודי הכרומטוגרפיה של זיקת קרום התא מאיצים את הזיהוי של תרכובות פעילות ביולוגית הנמצאות בתערובות מורכבות.השימוש בעמודות כרומטוגרפיה של זיקה לממברנה תאית יכול לעניין במיוחד את המתעניינים בזיהוי תרכובות פעילות פרמקולוגית הקיימות במטריצות טבעיות מורכבות, כגון תמציות צמחים, פטרייתיות או חיידקים. כדי להתחיל, להכין 200 תמיסת מלאי בנזאמידין millimolar על ידי המסת 120 של בנזמידין בחמישה מיליליטרים של מים אולטרה-פורה deionized. הכן תמיסת מניות PMSF של 10 מילימולר על ידי המסת 0.017 גרם PMSF ב -10 מיליליטר של אתנול במכסה אדים.הכינו קוקטייל מעכבי פרוטאזות 100X על ידי המסת תערובת מעכבי פרוטאזות הזמינה מסחרית במיליליטר אחד של מים אולטרה-פורים שעברו דה-יוניזציה. מערבבים היטב ומכניסים 200 עד 300 מיקרוליטרים של הקוקטייל. הכן 100 תמיסת מלאי ATP מילימולרית על ידי המסת 55.114 מיליגרם של מלח דיסודיום ATP הידרט במיליליטר אחד של מי האולטרה-פורה המיוננים.מערבבים היטב ומקפידים על 100 מיקרוליטרים של התערובת. הכן חיץ על ידי המסת 3.03 גרם של Tris-HCL, 2.9 גרם של נתרן כלורי, 0.22 גרם של סידן כלורי אנהידרוס, 0.2 גרם של מגנזיום כלוריד הקסהידראט, ו 0.19 גרם של אשלגן כלורי ב 500 מיליליטר של מים אולטרה-אפורים deionized. הכן מאגר הומוגניזציה על ידי ערבוב 17.3 מיליליטרים של מאגר Tris עם 0.3 מיליליטרים של תמיסת מלאי בנזמידין, 0.2 מיליליטרים של תמיסת מניות PMSF, 0.2 מיליליטרים של קוקטייל מעכבי פרוטאזות, 20 מיקרוליטרים של תמיסת מניות ATP, שני מיליליטרים של גליצרול ו-0.029 גרם של EDTA.התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות תמיסת חומצה הידרוכלורית. סובבו את התאים שנקטפו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ב-400 x גרם, הסירו את הסופרנאטנט ושטפו את גלולת התא הנותרת ב-10 מיליליטרים של PH 7.4 PBS קר כקרח של 1X pH 7.4. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהוסיף 20 מיליליטרים של מאגר הומוגניזציה.הניחו את הצינור החרוטי על הקרח. מעבירים את תרחיף התא למטחנת רקמות הומוגנייזר של Dounce 40 מיליליטר, הומוגניזציה של ההשעיה באופן ידני על קרח באמצעות 40 משיכות הדברה למעלה ולמטה. מעבירים את תרחיף התא ההומוגני לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, משליכים את הכדור ומעבירים את הסופרנטנט לצינור חרוטי חדש.שמור את גלולת קרום התא והשלך את הסופרנאטנט. הכינו את מאגר הסולוביליזציה על ידי ערבוב של 8.7 מיליליטרים של תמיסת המאגר עם 0.1 מיליליטרים של תמיסת מלאי PMSF, 0.15 מיליליטרים של תמיסת מלאי בנזמידין, 0.1 מיליליטרים של קוקטייל מעכבי פרוטאזות, 10 מיקרוליטרים של תמיסת מניות ATP, מיליליטר אחד של גליצרול ו-0.2 גרם של נתרן כולאט. מעבירים את חיץ הסולוביליזציה לצינור החרוטי עם שברי קרום התא.ותחזירו את הכדור. סובבו את התערובת המתקבלת ב-150 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. לאחר 18 שעות, צנטריפוגה תערובת solubilization בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ב 47, 900 x g.הוסף 100 מיליגרם של IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 לסופרנט ומסובבים את תערובת ההשעיה המתקבלת ב-150 סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. הכינו מאגר דיאליזה בארבעה ליטרים של מים אולטרה-פוריים שעברו דה-יוניזציה על ידי הוספת 24 גרם של Tris-HCl, 23.4 גרם נתרן כלורי, 0.06 גרם סידן כלורי, 5.85 גרם EDTA ו-0.07 גרם PMSF.ממיסים PMSF תחילה בנפח קטן של אתנול ולאחר מכן מוסיפים לאט לאט לתוך הכוס עם המאגר. חותכים 10 סנטימטרים של צינורות דיאליזה של קרום התאית כדי להכין צינור דיאליזה, ומעבירים את ההשעיה המכילה IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 ושברי קרום התא לתוך צינור הדיאליזה.סגור את שני הקצוות של שפופרת הדיאליזה עם קליפסים של צינורות דיאליזה. מקם את צינור הדיאליזה במאגר הדיאליזה. לאחר 24 שעות, הניחו את צינורות הדיאליזה במאגר הדיאליזה שזה עתה הוכן והמשיכו בדיאליזה עוד 24 שעות.הכן 10 millimolar pH 7.4 אמוניום אצטט חיץ שישמש לשטוף את IAM. מחשב אישי. חלקיקי DD2 ובניסויי אפיון עמודה על ידי המסת 0.778 גרם אמוניום אצטט לליטר אחד של מים אולטרה-פוריים שעברו דה-יוניזציה. לאחר 48 שעות של דיאליזה, הסר את שפופרת הדיאליזה ממאגר הדיאליזה והעבר את תוכן צינור הדיאליזה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הכדור הנותר שלוש פעמים עם 10 מיליליטרים של חיץ אמוניום אצטט. לאחר הכביסה השלישית, יש להחיות את הכדור הנותר במיליליטר אחד של חיץ אמוניום אצטט. ערבבו אותו ביסודיות והשתמשו ב-slurry שנוצר כדי לארוז את עמוד הזכוכית בגודל 5 x 20 כדי להפיק את עמודת הכרומטוגרפיה CMAC.כדי לארוז את העמודה, מקם מסנן תחתון שהושרה בעבר עם מאגר אמוניום אצטט למחזיק המסנן. התאם את מחזיק המסנן לעמוד הזכוכית והבריג את מכסה העמוד כדי להבטיח את מיקום המחזיק. מניחים את העמוד במאונך במהדק אצבעות ומהדקים אותו במעמד המעבדה.מניחים מתחת לעמוד, מעבירים כרך קטן של הזכוכית לתוך עמוד הזכוכית באיטיות עם פייפר ערוץ יחיד שמחזיק את קצה הפיפטה על קיר עמוד הזכוכית. כדי להאיץ את תהליך האריזה, הסר את המאגר מעל המיטה הנייחת באמצעות מיקרופיפט בין כל שלב. הניחו מסנן עליון והברגו את יחידת המתאם כך שלא יישאר מאגר מעל הפאזה הנייחת.אבטח את המיקום של יחידת המתאם באמצעות נעילת המתאם. חבר את העמודה למשאבת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, וכדי לשטוף את העמודה למשך הלילה עם מאגר אמוניום אצטט, הגדר את קצב הזרימה ל-0.2 מיליליטר לדקה. לאחסון ארוך יותר, הפעילו את העמודה עם תמיסת נתרן אזיד 0.05% בחיץ אמוניום אצטט, תוך לבישת מעיל מעבדה, משקפי בטיחות וכפפות בעת עבודה עם נתרן אזיד ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.IAM.מחשב אישי. חלקיקי DD2 עם שברי ממברנת תאי TrkB נוירובלסטומה משותקים ובנוכחות BDNF גרמו לחלקיקים פלואורסצנטיים. לא נצפתה פלואורסצנציה בחלקיקי IAM עטופים בממברנת תאי TrkB, או כאשר לא נעשה שימוש ב-BDNF כמו בחלקיקי IAM עטופים בקרום תאי TrkB. מוצגת זיקה קדמית פונקציונלית של כרומטוגרמה אופיינית של 7, 8-DHF של ריכוזים של מילימולר אחד, 750 ננומולר, 500 ננומולר ו-300 ננומולרים לקולטני TrkB המשותקים, שהראו שינוי תלוי ריכוז בזמן השמירה.עמודת CMAC לא מתפקדת הראתה את היעדר השינויים התלויים בריכוז בשמירה על ליגנד הסמן. עמודת בקרה שלילית של CMAC הוכנה על ידי שיתוק שברי קרום התא, ולא ביטוי של החלבון הממוקד כדי לשלול אינטראקציות לא ספציפיות. התוספת של 0.2% תמצית גוטו קולה מימית הביאה להפחתה משמעותית של 7, 8-DHF שימור, מה שמעיד על נוכחות של ליגנדות מתחרות לאתר הקשירה האגוניסטי.חוסר ההפחתה של 7, 8-DHF שמירה על עמודת האפסים השלילית של CMAC TrkB אישר עוד יותר את היעדרם של קולטני TrkB פונקציונליים בעמודה זו. גישת הכרומטוגרפיה החסרה של השיא זיהתה תרכובת שנשמרה בחוזקה בעמודת TrkB, תוך שהיא מתרחקת בשלב מוקדם בעמודת האפס של TrkB, מה שמעיד על אינטראקציה ספציפית. זה חיוני כדי לדעת את מקור הקולטנים שלך עבור עמודת כרומטוגרפיה מהירה של זיקה לקרום התא.הקפידו לבדוק את הספרות כדי לתכנן כראוי מאגרי הומוגניזציה וסולוביזציה. עמודת הכרומטוגרפיה של זיקת הממברנה התאית שהוכנה בפרוטוקול זה שימשה לזיהוי פגיעות פוטנציאליות חדשות בתרופות ולאפיון אופי האינטראקציה בין קולטן משותק לבין הליגנדות הטבעיות שלו.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...