Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
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जेडसीए को तुर्की के वैज्ञानिक और तकनीकी अनुसंधान परिषद (टीयूबीआईटीएके) 2219- इंटरनेशनल पोस्टडॉक्टोरल रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या 1आर 41 एटी 011716-01 के तहत नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के नेशनल सेंटर फॉर कॉम्प्लिमेंट्री एंड इंटीग्रेटिव मेडिसिन द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को आंशिक रूप से अमेरिकन सोसाइटी ऑफ फार्माकोग्नोसी रिसर्च स्टार्टर ग्रांट, एलसी को रेगिस टेक्नोलॉजीज अनुदान द्वारा भी समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

1. एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं की सेल संस्कृति (टीआरकेबी और टीआरकेबी-नल (माता-पिता) सेल लाइनों)
नोट: सेल लाइनों (एसएच-एसवाई 5 वाई सेल लाइन (टीआरकेबी, बीआर 6) और एसएच-एसवाई 5 वाई प?...

विशेष मेटाबोलाइट्स के जटिल मिश्रण में मौजूद सक्रिय यौगिकों की पहचान एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण कार्य23 है। परंपरागत रूप से, व्यक्तिगत यौगिकों को अलग किया जाता है, और उनकी गतिविधि का परीक्षण विभिन?...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

पौधों, कवक, बैक्टीरिया और समुद्री अकशेरुकी द्वारा संश्लेषित रसायन नई दवा हिट और लीड का एक समृद्ध स्रोत रहे हैं। आमतौर पर चिकित्सा पद्धति में उपयोग की जाने वाली स्टेटिन, पेनिसिलिन, पैक्लिटैक्सेल, रैपामाइसिन, या आर्टेमिसिनिन जैसी दवाओं को पहले प्राकृतिक उत्पादों से पहचाना और अलग किया गया है। हालांकि, प्राकृतिक स्रोतों से जैविक रूप से सक्रिय विशेष मेटाबोलाइट्स की पहचान और अलगाव एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली प्रक्रिया है। परंपरागत रूप से, बायोमास के निष्कर्षण के बाद, व्यक्तिगत चयापचयों को जटिल मिश्रण से अलग और शुद्ध किया जाता है। इसके बाद, पृथक अणुओं को उनकी जैविक गतिविधि को सत्यापित करने के लिए कार्यात्मक परख में परीक्षण किया जाता है। यहां हम जटिल मिश्रण से सीधे जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों की पहचान करने के लिए सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (सीएमएसी) कॉलम का उपयोग प्रस्तुत करते हैं। सीएमएसी कॉलम अपने मूल फॉस्फोलिपिड बाइलेयर वातावरण में एम्बेडेड स्थिर कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन (टीएमपी) के साथ बातचीत करने वाले यौगिकों की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। यह एक लक्षित दृष्टिकोण है, जिसके लिए टीएमपी को जानने की आवश्यकता होती है जिसकी गतिविधि एक नए पहचाने गए छोटे अणु दवा उम्मीदवार के साथ संशोधित करने का इरादा रखती है। इस प्रोटोकॉल में, हम स्थिर ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी (टीआरकेबी) के साथ सीएमएसी कॉलम तैयार करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, जो कई तंत्रिका तंत्र विकारों के लिए दवा की खोज के लिए एक व्यवहार्य लक्ष्य के रूप में उभरा है। इस लेख में, हम न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइनों का उपयोग करके स्थिर टीआरकेबी रिसेप्टर्स के साथ सीएमएसी कॉलम को इकट्ठा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो टीआरकेबी रिसेप्टर्स को अतिरंजित करते हैं। हम आगे कॉलम की कार्यक्षमता और टीआरकेबी रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने वाले विशेष पौधे मेटाबोलाइट्स की पहचान में इसके उपयोग की जांच करने के लिए दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं।

प्रोटोकॉल के बाद, दो सीएमएसी क्रोमैटोग्राफिक कॉलम इकट्ठे किए गए थे: एक स्थिर एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोब्लास्टोमा सेल झिल्ली टुकड़े के साथ अतिरंजित टीआरकेबी के साथ और एक एसएच-एसवाई 5 वाई टीआरकेबी-नल सेल झि...

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Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

प्रोटोकॉल सेल झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (सीएमएसी) कॉलम की तैयारी का वर्णन करता है जिसमें कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी प्रोटीन युक्त स्थिर सेल झिल्ली टुकड़े होते हैं। इन रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने वाले विशेष पौधे मेटाबोलाइट्स की पहचान में सीएमएसी कॉलम का उपयोग और जटिल प्राकृतिक मिश्रण में मौजूद भी समझाया गया है।

सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम स्थिर ट्रोपोमायोसिन किनेज रिसेप्टर बी के साथ बातचीत करने वाले विशेष पौधे मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

यह ऊर्ध्वाधर कार्यात्मक ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर्स के साथ सेल झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम को इकट्ठा करने में महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत करता है। इन स्तंभों का उपयोग जटिल अर्क में मौजूद छोटे अणुओं की पहचान और स्थिर ट्रांसमेम्ब्रेन रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करने के लिए किया जा सकता है। सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम जटिल मिश्रण में मौजूद जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों की पहचान को गति देते हैं।सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम का उपयोग जटिल प्राकृतिक मैट्रिक्स, जैसे पौधे, कवक, या बैक्टीरियल अर्क में मौजूद औषधीय रूप से सक्रिय यौगिकों की पहचान में रुचि रखने वालों के लिए विशेष रुचि का हो सकता है। शुरू करने के लिए, अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी के पांच मिलीलीटर में बेंजामिडाइन के 120 को भंग करके 200 मिलीमोलर बेंजामिडाइन स्टॉक समाधान तैयार करें। एक धूआं हुड में इथेनॉल के 10 मिलीलीटर में 0.017 ग्राम पीएमएसएफ को भंग करके 10 मिलीमोलर पीएमएसएफ स्टॉक समाधान तैयार करें।अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी के एक मिलीलीटर में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीज अवरोधक मिश्रण को भंग करके 100 एक्स प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं और कॉकटेल के 200 से 300 माइक्रोलीटर को विभाज्य करें। आयनित अल्ट्राप्योर पानी के एक मिलीलीटर में एटीपी डिसोडियम नमक हाइड्रेट के 55.114 मिलीग्राम को भंग करके 100 मिलीमोलर एटीपी स्टॉक समाधान तैयार करें।अच्छी तरह से मिलाएं और मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर को विभाज्य करें। 3.03 ग्राम ट्रिस-एचसीएल, 2.9 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 0.22 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड निर्जल, 0.2 ग्राम मैग्नीशियम क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट, और 0.19 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड को 500 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी में भंग करके बफर तैयार करें। बेंज़ामिडाइन स्टॉक समाधान के 0.3 मिलीलीटर, पीएमएसएफ स्टॉक समाधान के 0.2 मिलीलीटर, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के 0.2 मिलीलीटर, एटीपी स्टॉक समाधान के 20 माइक्रोलीटर, ग्लिसरॉल के दो मिलीलीटर, और 0.02 9 ग्राम ईडीटीए के साथ ट्रिस बफर के 17.3 मिलीलीटर मिश्रण करके होमोजनाइजेशन बफर तैयार करें।हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान का उपयोग करके पीएच को 7.4 तक समायोजित करें। 400 एक्स जी पर पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर काटा कोशिकाओं को नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला निकालें और 1 एक्स पीएच 7.4 बर्फ ठंड पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ शेष सेल गोली धो लें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और होमोजिनाइजेशन बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ें।शंक्वाकार ट्यूब को बर्फ पर रखें। सेल निलंबन को 40 मिलीलीटर डोंस होमोजेनाइज़र ऊतक ग्राइंडर में स्थानांतरित करें, 40 ऊपर और नीचे मूसल स्ट्रोक का उपयोग करके बर्फ पर मैन्युअल रूप से निलंबन को समरूप करें। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में होमोजेनाइज्ड सेल निलंबन स्थानांतरित करें, गोली को त्यागें और सतह पर तैरनेवाला को एक नई शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।कोशिका झिल्ली गोली को बचाने के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। पीएमएसएफ स्टॉक समाधान के 0.1 मिलीलीटर, बेंजामिडाइन स्टॉक समाधान के 0.15 मिलीलीटर, प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के 0.1 मिलीलीटर, एटीपी स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोलीटर, ग्लिसरॉल के एक मिलीलीटर, और 0.2 ग्राम सोडियम कोलेट के साथ बफर समाधान के 8.7 मिलीलीटर मिलाकर घुलनशीलता बफर तैयार करें। सेल झिल्ली टुकड़े के साथ शंक्वाकार ट्यूब में घुलनशीलता बफर स्थानांतरण।और गोली को फिर से निलंबित कर दिया। परिणामी मिश्रण को 18 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 150 आरपीएम पर घुमाएं। 18 घंटे के बाद, 47, 900 एक्स जी पर 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर घुलनशीलता मिश्रण को अपकेंद्रित्र करें।आईएएम के 100 मिलीग्राम जोड़ें। पीसी। सतह पर तैरनेवाला करने के लिए डीडी 2 कणों और एक घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 150 आरपीएम पर परिणामी निलंबन मिश्रण बारी बारी से। 24 ग्राम ट्रिस-एचसीएल, 23.4 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 0.06 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड, 5.85 ग्राम ईडीटीए और 0.07 ग्राम पीएमएसएफ जोड़कर चार लीटर अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी में डायलिसिस बफर तैयार करें।पीएमएसएफ को पहले इथेनॉल की एक छोटी मात्रा में भंग करें और फिर बफर के साथ बीकर में धीरे-धीरे जोड़ें। डायलिसिस ट्यूब तैयार करने के लिए सेल्यूलोज झिल्ली डायलिसिस टयूबिंग के 10 सेंटीमीटर काटें, और आईएएम युक्त निलंबन को स्थानांतरित करें। पीसी। डायलिसिस ट्यूब में डीडी 2 कणों और कोशिका झिल्ली टुकड़े।डायलिसिस ट्यूबिंग क्लिप के साथ डायलिसिस ट्यूब के दोनों सिरों को बंद करें। डायलिसिस बफर में डायलिसिस ट्यूब रखें। 24 घंटे के बाद, ताजा तैयार डायलिसिस बफर में डायलिसिस टयूबिंग रखें और एक और 24 घंटे के लिए डायलिसिस जारी रखा।10 मिलीमोलर पीएच 7.4 अमोनियम एसीटेट बफर तैयार करें जिसका उपयोग आईएएम को धोने के लिए किया जाएगा। पीसी। डीडी 2 कणों और एक लीटर अल्ट्राप्योर विआयनीकृत पानी में 0.778 ग्राम अमोनियम एसीटेट भंग करके कॉलम लक्षण वर्णन प्रयोगों में। डायलिसिस के 48 घंटे के बाद, डायलिसिस बफर से डायलिसिस ट्यूब को हटा दें और डायलिसिस ट्यूब की सामग्री को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।सतह पर तैरनेवाला त्यागें और अमोनियम एसीटेट बफर के 10 मिलीलीटर के साथ शेष गोली को तीन बार धो लें। तीसरे धोने के बाद, अमोनियम एसीटेट बफर के एक मिलीलीटर में शेष गोली को फिर से निलंबित करें। इसे अच्छी तरह से मिलाएं और सीएमएसी क्रोमैटोग्राफी कॉलम उत्पन्न करने के लिए 5 एक्स 20 ग्लास कॉलम को पैक करने के लिए परिणामी घोल का उपयोग करें।कॉलम को पैक करने के लिए, फ़िल्टर धारक में अमोनियम एसीटेट बफर के साथ पहले भिगोए गए नीचे फ़िल्टर रखें। ग्लास कॉलम में फ़िल्टर धारक को फिट करें और धारक की स्थिति को सुरक्षित करने के लिए कॉलम कैप को पेंच करें। कॉलम को एक उंगली क्लैंप में लंबवत रखें और इसे लैब स्टैंड में सुरक्षित करें।कॉलम के नीचे एक बीकर रखें, ग्लास कॉलम की दीवार के खिलाफ विंदुक टिप को पकड़ने वाले एकल चैनल विंदुक के साथ धीरे-धीरे ग्लास कॉलम में स्लरी की एक छोटी मात्रा को स्थानांतरित करें। पैकिंग प्रक्रिया को तेज करने के लिए, प्रत्येक चरण के बीच एक माइक्रोपिपेट के साथ स्थिर बिस्तर के ऊपर से बफर को हटा दें। एक शीर्ष फ़िल्टर रखें और एडाप्टर इकाई को पेंच करें ताकि स्थिर चरण के ऊपर कोई शेष बफर न हो।एडाप्टर लॉक के साथ एडाप्टर इकाई की स्थिति सुरक्षित करें। कॉलम को एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी पंप से कनेक्ट करें, और अमोनियम एसीटेट बफर के साथ रात भर कॉलम धोने के लिए, प्रवाह दर को 0.2 मिलीलीटर प्रति मिनट पर सेट करें। लंबे समय तक भंडारण के लिए, अमोनियम एसीटेट बफर में 0.05% सोडियम एजाइड समाधान के साथ कॉलम चलाएं, सोडियम एजाइड के साथ काम करते समय एक प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मा और दस्ताने पहनें और चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।पीसी। स्थिर न्यूरोब्लास्टोमा टीआरकेबी सेल झिल्ली के टुकड़ों के साथ डीडी 2 कणों और बीडीएनएफ की उपस्थिति में फ्लोरोसेंट कणों के परिणामस्वरूप। टीआरकेबी नल सेल झिल्ली में कोई प्रतिदीप्ति नहीं देखी गई थी, आईएएम कणों को समझाया गया था या जब टीआरकेबी सेल झिल्ली में आईएएम कणों के रूप में कोई बीडीएनएफ का उपयोग नहीं किया गया था। स्थिर टीआरकेबी रिसेप्टर्स के लिए एक कार्यात्मक सीएमएसी कॉलम विशिष्ट ललाट आत्मीयता क्रोमेटोग्राम 7, 750 नैनोमोलर, 750 नैनोमोलर, 500 नैनोमोलर और 300 नैनोमोलर की 7, 8-डीएचएफ सांद्रता में वृद्धि के विशिष्ट ललाट आत्मीयता क्रोमैटोग्राम दिखाए गए हैं, जो प्रतिधारण समय में एकाग्रता निर्भर परिवर्तन दिखाते हैं।एक गैर-कार्यात्मक सीएमएसी कॉलम ने मार्कर लिगैंड के प्रतिधारण में एकाग्रता निर्भर परिवर्तनों की कमी को दिखाया। एक सीएमएसी नकारात्मक नियंत्रण स्तंभ सेल झिल्ली के टुकड़ों को स्थिर करके तैयार किया गया था, गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन को रद्द करने के लिए लक्षित प्रोटीन को व्यक्त नहीं किया गया था। 0.2% जलीय गोटू कोला निकालने के अलावा 7, 8-डीएचएफ प्रतिधारण की एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप, एगोनिस्ट बाध्यकारी साइट के लिए प्रतिस्पर्धी लिगैंड की उपस्थिति का संकेत मिलता है।सीएमएसी नकारात्मक टीआरकेबी शून्य कॉलम पर 7, 8-डीएचएफ प्रतिधारण की कमी की कमी ने इस कॉलम पर कार्यात्मक टीआरकेबी रिसेप्टर्स की कमी की पुष्टि की। लापता शिखर क्रोमैटोग्राफी दृष्टिकोण ने टीआरकेबी कॉलम पर दृढ़ता से बनाए रखा गया एक यौगिक की पहचान की, जबकि टीआरकेबी शून्य कॉलम पर जल्दी एल्यूटिंग, विशिष्ट बातचीत का संकेत देता है। तेजी से सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम के लिए रिसेप्टर्स के अपने स्रोत को जानना महत्वपूर्ण है।होमोजिनाइजेशन और घुलनशीलता बफर को ठीक से डिजाइन करने के लिए साहित्य की जांच करना सुनिश्चित करें। इस प्रोटोकॉल में तैयार सेलुलर झिल्ली आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम का उपयोग नई संभावित दवा हिट की पहचान करने और स्थिर रिसेप्टर और इसके प्राकृतिक लिगैंड्स के बीच बातचीत की प्रकृति को चिह्नित करने के लिए किया गया था।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled स्तनधारी कोशिकाओं से प्रोटीन जटिल संबंध कब्जा

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

विधि कल्पना और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली बातचीत प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

रेडियोलैलेड एटीपी के साथ प्रोटीन किनास गतिविधि पर काबू पाने

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

एक नमूना से मेटाबोलाइट्स, लिपिड्स और प्रोटीन्स के व्यापक विश्लेषण के लिए एक सरल भिन्नात्मक निष्कर्षण विधि

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 में 1: प्रोटीन और प्रोटीन-Metabolite परिसरों के समानांतर विश्लेषण के लिए एक कदम संबध शुद्धि

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

पत्ती स्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री: एक तेजी से परिवेश Ionization तकनीक सीधे संयंत्र के ऊतकों से चयापचयों का आकलन करने के लिए

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop मैटीरियल मेटल संबध क्रोमैटोग्राफी, पुनर्गठन और एक Polyhistidine की परख स्नातक प्रयोगशाला के लिए Metalloenzyme टैग

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellular प्रोटीन Microarray कम संबध रिसेप्टर का उच्च प्रवाह का पता लगाने के लिए प्रौद्योगिकी-Ligand बातचीत

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

टैग नल का उपयोग कर Chloroplast Translocon प्रोटीन परिसरों का अपनत्व शुद्धिकरण

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी द्वारा इनोसिटोल फॉस्फेट या फॉस्फोइनोसिटाइड इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान पश्चिमी ब्लॉट या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए जोड़ा गया

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...