Name: cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Z.C.A. è stato supportato dal Consiglio di ricerca scientifica e tecnologica della Turchia (TUBITAK) 2219- International Postdoctoral Research Fellowship Program. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Center for Complimentary and Integrative Medicine del National Institutes of Health con il numero di premio 1R41AT011716-01. Questo lavoro è stato anche parzialmente supportato dall'American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, dalla sovvenzione Regis Technologies a L.C. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health.

1. Coltura cellulare di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y (linee cellulari TrkB e TrkB-NULL (parentali))
NOTA: Le linee cellulari (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) e SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 sono state acquistate da Kerafast. Le cellule coltivate sono utilizzate come fonte dei recettori transmembrana da immobilizzare per la preparazione delle colonne CMAC. I seguenti passaggi descrivono come ottenere fram...

L'identificazione di composti attivi presenti in miscele complesse di metaboliti specializzati è un compito molto impegnativo23. Tradizionalmente, i singoli composti sono isolati e la loro attività viene testata in diversi saggi. Questo approccio è dispendioso in termini di tempo e denaro e spesso porta all'isolamento e all'identificazione dei composti più abbondanti e ben caratterizzati23. I saggi di screening ad alto rendimento attualmente utilizzati si basano fortem...

Le miscele botaniche sono ricche di composti farmacologicamente attivi1, che fungono da buona fonte per l'identificazione di nuovi colpi di farmaci e conduce 2,3,4,5. La scoperta di nuovi farmaci da prodotti naturali è stato un approccio fruttuoso e molti farmaci attualmente approvati hanno avuto origine da composti identificati per la prima volta in natura. La diversità chimica dei composti naturali è difficile da eguagliare nelle librerie artificiali di molecole sintetizzate chimicamente. Molti composti naturali interagiscono e modulano bersagli proteici umani e possono essere considerati molecole simili a farmaci ottimizzate evolutivamente6. Questi composti naturali sono particolarmente adatti per l'identificazione del piombo farmacologico da utilizzare nei disturbi neurologici6. Due dei farmaci attualmente approvati dalla FDA per la gestione della malattia di Alzheimer (AD) sono derivati da alcaloidi naturali, vale a dire: galantamina e rivastigmina (un derivato della fisostigmina)6. L-DOPA, attualmente il farmaco più comunemente prescritto per il morbo di Parkinson, è stato identificato per la prima volta dalla fava (Vicia faba L.) 7. Pergolide e lisuride, agonisti del recettore dopaminergico sono i derivati degli alcaloidi naturali della segale cornuta dal fungo parassita Claviceps purpurea8. Reserpina, un alcaloide isolato dalla radice di serpente indiana (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) è stato uno dei primi farmaci antipsicotici9. Recentemente, la risposta immunitaria disregolata e l'infiammazione sistemica sono state collegate allo sviluppo di numerosi disturbi neurologici, come il disturbo depressivo maggiore o le malattie neurodegenerative10. Una dieta a base vegetale insieme ad altri interventi sullo stile di vita è stata trovata per migliorare le capacità cognitive e funzionali negli anziani 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Alcune molecole elettrofile appartenenti a triterpeni e polifenoli sono state trovate per modulare le risposte infiammatorie sia in vitro che in vivo modelli12. Ad esempio, i composti naturali contenenti α.β-insaturo carbonile (ad esempio, curcumina, cinnamaldeide) o gruppo isotiocianato (ad esempio, sulforafano) interferiscono con la dimerizzazione del recettore Toll-like-4 (TLR4) inibendo la sintesi a valle di citochine pro-infiammatorie in una linea cellulare pro-B murina interleuchina-3 dipendente12,22 . Le evidenze epidemiologiche indicano fortemente che i fitochimici dietetici, presenti in matrici alimentari complesse, possono anche costituire una valida fonte di nuovi lead farmacologici6.
Uno dei maggiori ostacoli nell'identificazione di molecole biologicamente attive presenti negli estratti vegetali, compresi gli alimenti a base vegetale, è la complessità dei campioni indagati. Tradizionalmente, i singoli composti vengono isolati, purificati e successivamente testati per l'attività biologica. Questo approccio di solito porta all'identificazione dei composti più abbondanti e ben caratterizzati. Gli approcci fenotipici alla scoperta di farmaci senza un bersaglio molecolare definito si basano sul frazionamento bioguidato di miscele complesse23. In questo approccio, un estratto viene frazionato in sottofrazioni meno complesse che vengono successivamente testate in saggi fenotipici. L'isolamento e la purificazione dei composti attivi sono guidati dall'attività biologica verificata nel test. La conoscenza dell'identità di un bersaglio farmacologico specifico può accelerare significativamente l'identificazione di composti farmacologicamente attivi presenti in miscele complesse. Questi approcci sono solitamente basati sull'immobilizzazione del bersaglio molecolare, ad esempio un enzima, su una superficie solida, come le perle magnetiche23. I bersagli immobilizzati vengono successivamente utilizzati negli esperimenti di screening con conseguente isolamento di composti che interagiscono con il bersaglio. Mentre questo approccio è stato ampiamente utilizzato nell'identificazione di composti mirati alle proteine citosoliche, è stato applicato meno comunemente nell'identificazione di sostanze chimiche che interagiscono con le proteine transmembrana (TMP)23. Un'ulteriore sfida nell'immobilizzazione dei TMP deriva dal fatto che l'attività della proteina dipende dalla sua interazione con i fosfolipidi della membrana cellulare e altre molecole nel doppio strato come il colesterolo23,24. È importante preservare queste sottili interazioni tra le proteine e il loro ambiente nativo fosfolipidico a doppio strato quando si tenta di immobilizzare il bersaglio transmembrana.
Nella cromatografia di affinità di membrana cellulare (CMAC) i frammenti di membrana cellulare, e non le proteine purificate, sono immobilizzati sulla membrana artificiale (IAM) particelle di fase stazionaria23. Le fasi stazionarie IAM sono preparate legando covalentemente gli analoghi della fosfatidilcolina sulla silice. Recentemente sono state sviluppate nuove classi di fasi stazionarie IAM in cui i gruppi di ammine e silanoli liberi sono end-capped (IAM. PC. Particelle DD2). Durante la preparazione delle colonne CMAC i frammenti di membrana cellulare vengono immobilizzati sulla superficie delle particelle IAM attraverso l'adsorbimento.
Le colonne CMAC sono state utilizzate fino ad oggi per immobilizzare diverse classi di TMP, inclusi i canali ionici (ad esempio, recettori nicotinici), GPCR (ad esempio, recettori oppioidi), trasportatori di proteine (ad esempio, p-glicoproteina), ecc.24. I bersagli proteici immobilizzati sono stati utilizzati nella caratterizzazione della farmacodinamica (ad esempio, costante di dissociazione, Kd) o nella determinazione della cinetica di legame (kon e koff) di ligandi di piccole molecole che interagiscono con il bersaglio, nonché nel processo di identificazione di potenziali nuovi lead farmacologici presenti in matrici complesse24 . Qui presentiamo la preparazione di colonne CMAC con il recettore immobilizzato della tropomiosina chinasi B (TrkB), che è emerso come un bersaglio praticabile per la scoperta di farmaci per numerosi disturbi del sistema nervoso.
Studi precedenti hanno dimostrato che l'attivazione del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)/TrkB è associata al miglioramento di alcuni disturbi neurologici, come l'AD o il disturbo depressivo maggiore 25,26,27,28. È stato riportato che i livelli di BDNF e il suo recettore TrkB di espressione diminuiscono nell'AD e riduzioni simili compromettono la funzione dell'ippocampo in modelli animali di AD29. Livelli ridotti di BDNF sono stati riportati nel siero e nel cervello dei pazienti con AD 30,31,32. La sovraespressione di Tau o l'iperfosforilazione sono state trovate per down-regolare l'espressione di BDNF nei neuroni primari e modelli animali di AD 33,34,35. Inoltre, è stato segnalato che il BDNF ha effetti protettivi sulla neurotossicità indotta da β-amiloide in vitro e in vivo36. La somministrazione diretta di BDNF nel cervello del ratto ha dimostrato di aumentare l'apprendimento e la memoria negli animali cognitivamente compromessi37. BDNF / TrkB è emerso come un obiettivo valido per migliorare i disturbi neurologici e psichiatrici tra cui AD28,38. Prendere di mira la via di segnalazione BDNF / TrkB per lo sviluppo di terapie nell'AD migliorerà potenzialmente la nostra comprensione della malattia39. Sfortunatamente, il BDNF stesso non può essere usato come trattamento a causa delle sue scarse proprietà farmacocinetiche e degli effetti collaterali avversi40. Gli attivatori di piccole molecole delle vie TrkB/BDNF sono stati esplorati come potenziali ligandi TrkB 41,42,43. Tra gli agonisti di piccole molecole testati, il 7,8-diidrossiflavone (7,8-DHF), ha dimostrato di attivare la via BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un derivato del 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromone-7,8-diil bis(metilcarbammato)) è attualmente in esame come possibile farmaco per l'AD47. Recentemente, è stato dimostrato che diversi antidepressivi agiscono attraverso il legame diretto al TrkB e la promozione della segnalazione BDNF, sottolineando ulteriormente l'importanza di perseguire TrkB come obiettivo valido per il trattamento di vari disturbi neurologici48.
Il protocollo descrive il processo di assemblaggio della colonna TrkB funzionale e della colonna di controllo negativo TrkB-NULL. Le colonne sono caratterizzate utilizzando un noto prodotto naturale legante molecolare piccolo: 7,8-DHF. Inoltre, descriviamo il processo di screening di matrici complesse, utilizzando l'estratto vegetale come esempio, per l'identificazione di composti che interagiscono con TrkB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-8 Dihydroxyflavone hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5446-10 mg</td>
			<td>&#8805;98% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH9204-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA5-15198-400 &#956;L</td>
			<td>Primary antibody; 2 mg/mL of concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine hydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6506-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3795-10 &#956;g</td>
			<td>Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9224-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid sodium salt</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62050-100 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce homogenizer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-516</td>
			<td>40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>493511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH-9232-500 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442-500 mL</td>
			<td>sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulfate salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8168-100 mL</td>
			<td>50 mg/mL in H2O, 0.1 &#956;m filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>E520-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)</td>
			<td>Regis Technologies, Inc.</td>
			<td>1-771050-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>VWR Analytical</td>
			<td>BDH9244-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>322425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Plan Fluor</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (10%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>50197Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978-5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>K812-500 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>0395-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>VWR Life Science Ambreso</td>
			<td>M221-1 mL</td>
			<td>Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 &#181;M aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-500 mL</td>
			<td>with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td>
			<td>A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-SY5Y Trk-NULL cell line</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECP005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snake skin dialysis tubing</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88245</td>
			<td>10K MWCO, 35 mm dry I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH VWR Analytical</td>
			<td>BDH9286-2.5 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricorn 5/20 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>24-4064-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0497-1 kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049-500 mL</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular membrane affinity chromatography columns to identify specialized plant metabolites interacting with immobilized tropomyosin kinase receptor b

Le sostanze chimiche sintetizzate da piante, funghi, batteri e invertebrati marini sono state una ricca fonte di nuovi colpi di droga e piombo. Farmaci come statine, penicillina, paclitaxel, rapamicina o artemisinina, comunemente usati nella pratica medica, sono stati identificati e isolati per la prima volta dai prodotti naturali. Tuttavia, l'identificazione e l'isolamento di metaboliti specializzati biologicamente attivi da fonti naturali è un processo impegnativo e dispendioso in termini di tempo. Tradizionalmente, i singoli metaboliti vengono isolati e purificati da miscele complesse, in seguito all'estrazione della biomassa. Successivamente, le molecole isolate vengono testate in saggi funzionali per verificarne l'attività biologica. Qui presentiamo l'uso delle colonne di cromatografia di affinità di membrana cellulare (CMAC) per identificare composti biologicamente attivi direttamente da miscele complesse. Le colonne CMAC consentono l'identificazione di composti che interagiscono con proteine transmembrana funzionali immobilizzate (TMP) incorporate nel loro ambiente nativo di fosfolipidi a doppio strato. Si tratta di un approccio mirato, che richiede la conoscenza del TMP la cui attività si intende modulare con il candidato farmaco a piccola molecola appena identificato. In questo protocollo, presentiamo un approccio per preparare colonne CMAC con recettore immobilizzato della tropomiosina chinasi B (TrkB), che è emerso come un bersaglio praticabile per la scoperta di farmaci per numerosi disturbi del sistema nervoso. In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per assemblare la colonna CMAC con recettori TrkB immobilizzati utilizzando linee cellulari di neuroblastoma che sovraesprimono i recettori TrkB. Presentiamo inoltre l'approccio per studiare la funzionalità della colonna e il suo utilizzo nell'identificazione di metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con i recettori TrkB.

Seguendo il protocollo, sono state assemblate due colonne cromatografiche CMAC: una con i frammenti immobilizzati della membrana cellulare del neuroblastoma SH-SY5Y con TrkB sovraespresso e una con frammenti di membrana cellulare SH-SY5Y TrkB-NULL. La colonna CMAC correttamente assemblata è presentata in Figura 1 e le fasi coinvolte nell'immobilizzazione del frammento di membrana cellulare sono presentate in Figura 2.
Dall'immobilizz...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B at JoVE

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Il protocollo descrive la preparazione di colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare (CMAC) con frammenti di membrana cellulare immobilizzata contenenti proteine B funzionali del recettore B della tropomiosina chinasi transmembrana. Viene inoltre spiegato l'uso di colonne CMAC nell'identificazione di metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con questi recettori e presenti in miscele naturali complesse.

Colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare per identificare metaboliti vegetali specializzati che interagiscono con il recettore della tropomiosina chinasi B immobilizzato

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Questa verticale presenta passi importanti nell'assemblaggio di colonne di cromatografia di affinità della membrana cellulare con recettori transmembrana funzionali. Queste colonne possono essere utilizzate per l'identificazione di piccole molecole presenti in estratti complessi e che interagiscono con recettori transmembrana immobilizzati. Le colonne di cromatografia di affinità di membrana cellulare velocizzano l'identificazione di composti biologicamente attivi presenti in miscele complesse.L'utilizzo di colonne di cromatografia di affinità di membrana cellulare può essere di particolare interesse per chi è interessato all'identificazione di composti farmacologicamente attivi presenti in matrici naturali complesse, come estratti vegetali, fungini o batterici. Per iniziare, preparare la soluzione madre di benzamidina 200 millimolare sciogliendo 120 di benzamidina in cinque millilitri di acqua deionizzata ultrapura. Preparare una soluzione madre PMSF da 10 millimolari sciogliendo 0,017 grammi di PMSF in 10 millilitri di etanolo in una cappa aspirante.Preparare il cocktail inibitore delle proteasi 100X sciogliendo la miscela di inibitori della proteasi disponibile in commercio in un millilitro di acqua deionizzata ultrapura. Mescolare accuratamente e aliquot da 200 a 300 microlitri del cocktail. Preparare la soluzione madre di ATP 100 millimolari sciogliendo 55,114 milligrammi di idrato di sale disodico ATP in un millilitro di acqua ultrapura ionizzata.Mescolare accuratamente e aliquota 100 microlitri della miscela. Preparare il tampone sciogliendo 3,03 grammi di Tris-HCL, 2,9 grammi di cloruro di sodio, 0,22 grammi di cloruro di calcio anidro, 0,2 grammi di cloruro di magnesio esaidrato e 0,19 grammi di cloruro di potassio in 500 millilitri di acqua deionizzata ultrapura. Preparare il tampone di omogeneizzazione mescolando 17,3 millilitri del tampone Tris con 0,3 millilitri di soluzione madre di benzamidina, 0,2 millilitri di soluzione madre PMSF, 0,2 millilitri di cocktail inibitore delle proteasi, 20 microlitri di soluzione madre di ATP, due millilitri di glicerolo e 0,029 grammi di EDTA.Regolare il pH a 7,4 utilizzando la soluzione di acido cloridrico. Abbassare le cellule raccolte a quattro gradi Celsius per cinque minuti a 400 x g e rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare rimanente con 10 millilitri di 1X pH 7,4 PBS ghiacciato. Scartare il surnatante e aggiungere 20 millilitri di tampone di omogeneizzazione.Posizionare il tubo conico sul ghiaccio. Trasferire la sospensione cellulare in una smerigliatrice di tessuto omogeneizzatore Dounce da 40 millilitri, omogeneizzare manualmente la sospensione sul ghiaccio usando 40 colpi di pestello su e giù. Trasferire la sospensione cellulare omogeneizzata in un tubo conico da 50 millilitri, scartare il pellet e trasferire il surnatante in un nuovo tubo conico.Salvare il pellet di membrana cellulare ed eliminare il surnatante. Preparare il tampone di solubilizzazione mescolando 8,7 millilitri della soluzione tampone con 0,1 millilitri di soluzione madre PMSF, 0,15 millilitri di soluzione madre di benzamidina, 0,1 millilitri di cocktail inibitore delle proteasi, 10 microlitri di soluzione madre di ATP, un millilitro di glicerolo e 0,2 grammi di colato di sodio. Trasferire il tampone di solubilizzazione nel tubo conico con frammenti di membrana cellulare.E risospesciare il pellet. Ruotare la miscela risultante a 150 RPM a quattro gradi Celsius per 18 ore. Dopo 18 ore, centrifugare la miscela di solubilizzazione a quattro gradi Celsius per 30 minuti a 47.900 x g.Aggiungi 100 milligrammi di IAM. PC. DD2 particelle al surnatante e ruotare la miscela di sospensione risultante a 150 RPM a quattro gradi Celsius per un'ora. Preparare il tampone per dialisi in quattro litri di acqua deionizzata ultrapura aggiungendo 24 grammi di Tris-HCl, 23,4 grammi di cloruro di sodio, 0,06 grammi di cloruro di calcio, 5,85 grammi di EDTA e 0,07 grammi di PMSF.Sciogliere pmsf prima in un piccolo volume di etanolo e poi aggiungere lentamente nel becher con il tampone. Tagliare 10 centimetri di tubo di dialisi a membrana di cellulosa per preparare il tubo di dialisi e trasferire la sospensione contenente IAM. PC. Particelle DD2 e frammenti di membrana cellulare nel tubo di dialisi.Chiudere entrambe le estremità del tubo di dialisi con clip per tubi di dialisi. Posizionare il tubo di dialisi nel tampone di dialisi. Dopo 24 ore, posizionare il tubo di dialisi nel tampone di dialisi appena preparato e continuare la dialisi per altre 24 ore.Preparare un tampone di acetato di ammonio a pH 7,4 millimolare che verrà utilizzato per lavare lo IAM. PC. Particelle DD2 e esperimenti di caratterizzazione in colonna sciogliendo 0,778 grammi di acetato di ammonio in un litro di acqua deionizzata ultrapura. Dopo 48 ore di dialisi, rimuovere il tubo di dialisi dal tampone di dialisi e trasferire il contenuto del tubo di dialisi in un tubo conico da 15 millilitri.Scartare il surnatante e lavare il pellet rimanente tre volte con 10 millilitri di tampone di acetato di ammonio. Dopo il terzo lavaggio, risospesere il pellet rimanente in un millilitro di tampone di acetato di ammonio. Mescolare accuratamente e utilizzare il liquame risultante per imballare la colonna di vetro 5 x 20 per ottenere la colonna di cromatografia CMAC.Per imballare la colonna, posizionare un filtro inferiore precedentemente imbevuto di tampone di acetato di ammonio nel portafiltro. Montare il portafiltro nella colonna di vetro e avvitare il cappuccio della colonna per fissare la posizione del supporto. Posizionare la colonna verticalmente in un morsetto per le dita e fissarla nel supporto del laboratorio.Posizionare un becher sotto la colonna, trasferire lentamente un piccolo volume del liquame nella colonna di vetro con un pipetter a canale singolo che tiene la punta della pipetta contro la parete della colonna di vetro. Per accelerare il processo di imballaggio, rimuovere il tampone dall'alto del letto fisso con una micropipetta tra ogni passaggio. Posizionare un filtro superiore e avvitare l'unità adattatore in modo che non vi sia alcun buffer residuo sopra la fase stazionaria.Fissare la posizione dell'unità adattatore con il blocco dell'adattatore. Collegare la colonna a una pompa per cromatografia liquida ad alte prestazioni e, per lavare la colonna durante la notte con tampone in acetato di ammonio, impostare la portata su 0,2 millilitri al minuto. Per una conservazione più lunga, eseguire la colonna con una soluzione di azide di sodio allo 0,05% in tampone di acetato di ammonio, indossando un camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti quando si lavora con azide di sodio e conservare a quattro gradi Celsius.IAM.PC. Le particelle DD2 con frammenti di membrana cellulare TrkB di neuroblastoma immobilizzato e in presenza di BDNF hanno provocato particelle fluorescenti. Non è stata osservata alcuna fluorescenza nelle particelle IAM incapsulate nella membrana cellulare nulla TrkB o quando non è stato utilizzato BDNF come nelle particelle IAM incapsulate nella membrana cellulare TrkB. Viene mostrato un cromatogramma di affinità frontale tipico delle colonne CMAC funzionali di concentrazioni crescenti di 7, 8-DHF di un millimolare, 750 nanomolare, 500 nanomolari e 300 nanomolari ai recettori TrkB immobilizzati, che ha mostrato un cambiamento dipendente dalla concentrazione nel tempo di ritenzione.Una colonna CMAC non funzionale ha mostrato la mancanza di cambiamenti dipendenti dalla concentrazione nella ritenzione del ligando marcatore. Una colonna di controllo negativa CMAC è stata preparata immobilizzando frammenti di membrana cellulare, non esprimendo la proteina mirata per escludere interazioni non specifiche. L'aggiunta dello 0,2% di estratto acquoso di cola di Gotu ha comportato una significativa riduzione della ritenzione di 7, 8-DHF, indicando la presenza di ligandi concorrenti per il sito di legame dell'agonista.La mancanza di riduzione della ritenzione di 7, 8-DHF sulla colonna TrkB nulla negativa CMAC ha ulteriormente confermato la mancanza di recettori TrkB funzionali su questa colonna. L'approccio di cromatografia di picco mancante ha identificato un composto fortemente mantenuto sulla colonna TrkB, mentre eluiva precocemente sulla colonna nulla TrkB, indicando un'interazione specifica. È fondamentale conoscere la fonte dei recettori per la colonna di cromatografia di affinità della membrana cellulare veloce.Assicurati di controllare la letteratura per progettare correttamente i tamponi di omogeneizzazione e solubilizzazione. La colonna di cromatografia dell'affinità della membrana cellulare preparata in questo protocollo è stata utilizzata per identificare nuovi potenziali colpi di farmaci e per caratterizzare la natura dell'interazione tra il recettore immobilizzato e i suoi ligandi naturali.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Ricerca

Biochimica

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Un semplice metodo di estrazione frazionata per l&#39;analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Spettrometria di massa di foglia Spray: Una tecnica di ionizzazione ambiente rapido per valutare direttamente metaboliti dai tessuti vegetali

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo, la ricostituzione e l'analisi di un Polyhistidine contrassegnati metalloenzimi per il laboratorio dello studente non laureato

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Purificazione di affinità del cloroplasto Translocon proteina complessi usando il Tag di rubinetto

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Identificazione delle proteine che interagiscono con fosfato inositolo o fosfonositide mediante matricografia affinità accoppiata a Blot occidentale o spettrometria di massa

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...